Introduction
مرض السكري نوع 1 (T1D) هو أحد أمراض المناعة الذاتية التي يتميز بها تدمير جزيرة المنتجة للانسولين β الخلايا عن طريق خلايا autoreactive تي 1. وعادة ما يتم التشخيص من T1D على قياس (الجلوكوز في الدم> 200 ملغ / دل) ارتفاع السكر في الدم في العجاف، فرد الشاب، الذي قد يقدم مع الحماض الكيتوني كدليل على نقص الأنسولين. في وقت التشخيص من T1D، وهناك أدلة لخسارة كبيرة في وظيفة خلايا β وكتلة (50-90٪) 2. في الدراسات السريرية، تبين أن العديد من الأدوية تغييري المناعة التي أقيمت في وقت التشخيص في تحقيق الاستقرار في وظيفة خلايا β (ويفترض الكتلة)، ولكن لا شيء قد أسفرت عن مغفرة السريرية للمرض، وهو الاكتشاف الذي أثار الدعوة إلى تطوير المؤشرات الحيوية للكشف في وقت سابق من هذا المرض وتتبع طولية من فعالية مجموعة من العلاجات 3،4. الجهود التي تبذلها اتحادات دولية، مثل هذاق كونسورتيوم شبكة البحوث جزيرة البشرية التابع للمعاهد الوطنية للهيث 5، وشدد على ضرورة تطوير المؤشرات الحيوية التي تركز على الإجهاد خلية بيتا والموت في T1D.
وتماشيا مع هذه الجهود، لدينا مجموعة والبعض الآخر قد وضعت مؤخرا فحوصات العلامات البيولوجية التي تقيس المتداولة، شظايا الحمض النووي تعديل epigenetically التي تنشأ في المقام الأول من الموت خلايا β 6-9. في جميع المقايسات التي نشرت حتى الآن، كان التركيز على الكميات من الجين البشري ترميز سلف طليعة الأنسولين (INS)، والذي يدل على درجة أكبر من المواقع الدليل السياسي الشامل unmethylated في المناطق الترميز والمروج مقارنة مع أنواع أخرى من الخلايا. كان الافتراض تحرير unmethylated شظايا الحمض النووي INS كما تنشأ أساسا من الموت (نخرية، أفكارك) خلايا β. وأظهرت لنا الدراسات الحديثة أن في الشباب، والارتفاعات في كل unmethylated والميثيلي والحمض النووي INS في موقف -69 سنة مضت (نسبة إلى Tانه النسخي بدء الموقع) لوحظت في الظهور الجديد T1D، وجنبا إلى جنب خدم المؤشرات الحيوية محددة لهذه الفئة من السكان 6. هذه المقايسات العلامات البيولوجية تنطوي على عزل الحمض النووي خالية من الخلايا من المصل أو البلازما باستخدام مجموعات تدور التجارية، تليها تحويل بيسلفيت لعزل الحمض النووي (لتحويل cytosines غير ميثليته إلى uracils، وترك cytosines ميثليته سليمة).
في هذا التقرير، وصفنا الجوانب التقنية لجمع عينة الدم، وعزل الحمض النووي خالية من الخلايا من الدم، وتحويل بيسلفيت، وأداء PCR الرقمي بالقطيرات (من الآن فصاعدا، PCR الرقمي) لميثليته تفاضلي INS الحمض النووي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتفسير البيانات بشكل مناسب، ونحن نستخدم الضوابط البلازميد لكل من الهدف INS الحمض النووي unmethylated والميثيلي في كل شوط PCR الرقمي. هذه الضوابط تضمن إشارات الموافق الحمض النووي الميثيلي وunmethylated يمكن تمييزها بوضوح. ويبين الشكل 1 المؤامرات مبعثر 2-D الموافق قطرات للضوابط تحتوي على البلازميد تحويلها بيسلفيت unmethylated INS الحمض النووي (الشكل 1A)، الميثيلي INS الحمض النووي (الشكل 1B)، و 1: 1 خليط من اثنين من البلازميدات (الشكل 1C). يشار تحتوي على البلازميد unmethylated INS التي كتبها قطرات إيجابية للإشارة 6 Carboxyfluorescein (فام)، في حين تحتوي على البلازميد ميثليته يشار INS التي كتبها قطرات إيجابية للإشارة VIC. في 1: البلازميد خليط 1، وينظر عدد سكانها قطرات إيجابية مزدوجة، الموافق قطرات تحتوي على كل أنواعالحمض النووي. للتمييز بين قطرات إيجابية من قطرات السلبية، هي بوابات البيانات باستخدام هذه المؤامرات 2-D. لاحظ أنه في الشكل 1A، هناك تحول طفيف من قطرات-FAM إيجابي في قناة VIC، مشيرا إلى أن التحقيق لميثليته INS الحمض النووي يسلك بعض عبر التفاعل لunmethylated INS الحمض النووي. وبالمثل، في الشكل 1B، هناك تحول طفيف جدا من قطرات في مركز فيينا الدولي إيجابية في قناة FAM، مشيرا عبر التفاعل لجنة التحقيق لالحمض النووي unmethylated مع الحمض النووي الميثيلي. والميزة الرئيسية لPCR الرقمية هو أنها لا تزال تنطوي على تمييز إشارات معينة حتى عندما تحقيقات ليست 100٪ محددة. لمناسبة الحسابات الإحصائية بواسون من قبل البرنامج، يجب تقسيم كل رد فعل PCR إلى لا يقل عن 10،000 مجموع قطرات، وعرض مجموعة من قطرات السلبية، وتظهر الفرق السعة واضح بين قطرات السلبية والإيجابية (لالنابضة موثوق). لإثبات الخطي من الاشعال لدينا، صمخاليط erformed من البلازميدات اثنين عبر عدة أوامر من حجمها. كما هو مبين في الشكل 2، تركيزات مختلفة البلازميد واحد يمكن أن يتم الكشف عن خطيا في وجود كمية ثابتة من البلازميد الثاني. للمختبرات جديدة تنفيذ هذا الإجراء، نوصي بناء تجربة خليط مماثلة لضمان أن الفحص يعمل بطريقة كشف الخطي.
بعد ذلك، حصلنا على مصل من ثلاث مواد مع T1D-بداية جديدة (في حدود 2 أيام من التشخيص) وثلاثة أفراد السيطرة من دون T1D (انظر الجدول رقم 1 لالخصائص السريرية). تمت الموافقة على البروتوكولات من قبل مجلس المراجعة المؤسسية جامعة إنديانا. الآباء والأمهات من المواضيع المقدمة موافقة خطية مستنيرة. ويبين الشكل 3 الكميات من unmethylated والميثيلي INS الحمض النووي نسخ أرقام / مصل ميكرولتر، وتحويلها إلى تسجيل 10 من هذه الضوابط والموضوعات T1D. تشير البيانات إلى أن ط ndividuals مع معرض مستويات مرتفعة T1D كل من ميثليته وunmethylated INS DNA مقارنة مع الضوابط، على غرار البيانات المبلغة سابقا 6.
الشكل 1: ممثل مؤامرات 2-D الضوابط البلازميد. تم إنشاؤها معايير البلازميد عن طريق الاستنساخ شظايا تحويلها بيسلفيت INS الحمض النووي إيواء السيتوزين unmethylated أو الميثيلي في موقف -69 بي بي بالنسبة لدائرة الهجرة والتجنيس النسخي بدء الموقع. أظهرت هي المؤامرات 2-D باستخدام تحتوي على البلازميد unmethylated (A) والميثيلي (ب) INS الحمض النووي ول1: 1 خليط من اثنين من البلازميدات (C). السهام التعرف على unmethylated، مثيلة، وunmethylated + ميثليته (المزدوج إيجابية) INS الحمض النووي التي تحتوي على قطرات. FAM = الهدف 1؛ VIC = الهدف 2.المرجع = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54838/54838fig1large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الكميات من الأهداف باستخدام الحمض النووي تحكم البلازميد مخاليط. وتباينت معايير البلازميد التي تحتوي على شظايا المستنسخة من تحويلها بيسلفيت INS الحمض النووي إيواء السيتوزين unmethylated أو الميثيلي في موقف -69 بي بي بالنسبة لدائرة الهجرة والتجنيس النسخي بدء الموقع في تركيبات مختلفة مبين، ثم تعرض لتعدد PCR الرقمي. هذا الرقم يدل على الكميات من شظايا الحمض النووي الهدف، كما عرضت نسخة / ميكرولتر. ص 2 = 0.989 لunmethylated INS الحمض النووي وص 2 = 0.998 لميثليته INS الحمض النووي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): تداول مستويات Unmethylated ومميثل INS الحمض النووي في التحكم والموضوعات مع T1D. تم جمع عينات من مصل الدم من 4 شباب مع بداية جديدة T1D ومن 4، وضوابط لا علاقة خالية من الأمراض، ثم معالجتها لقياس ميثليته تفاضلي الحمض النووي INS بواسطة PCR الرقمي. أظهرت ونتائج فحوصات PCR الرقمية لunmethylated (A) والميثيلي (ب) INS الحمض النووي. يتم عرض البيانات كنقاط الفردية ويعني ± SEM. وقد تم تحليل الإحصاءات من قبل الطلاب حدودي ر اختبار ثنائي الطرف. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من ثيالصورة الرقم.
| ضوابط | T1D في بداية | |
| عمر (سنة) | 10.3 ± 1.3 | 9.2 ± 1.0 |
| انثى ذكر | 1: 3 | 1: 3 |
| مؤشر كتلة الجسم Z-نتيجة | 0.30 ± 0.9 | 0.74 ± 0.9 |
| HBA 1C (٪) | 11.1 ± 0.6 | |
| C-الببتيد (بمول / لتر) | 285.5 ± 37.0 |
الجدول 1: التركيبة السكانية من الضوابط والموضوعات مع T1D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مثيلة من cytosines التي كتبها ميثيل الحمض النووي يسمح لمراقبة جينية من النسخ في العديد من الجينات. وأعرب عن الجين INS في البشر على وجه الحصر تقريبا في جزيرة β خلايا، ويبدو أن هناك علاقة بين وتيرة مثيلة من cytosines في الجين INS لإسكات من النسخ في 11. على هذا النحو، فإن معظم أنواع الخلايا تظهر ترددات أعلى بكثير من مثيلة من الجين INS في cytosines مختلف مقارنة بيتا خلايا 11-13. وقد اقترح أن انتشار موت الخلايا بيتا يمكن رصد من خلال تحليل مستويات مصل خالية من الخلايا unmethylated INS الحمض النووي، والتي قد تنشأ بشكل كبير من الموت خلايا بيتا التي تحرر بها DNA 12.
رد فعل بيسلفيت تحويل cytosines unmethylated إلى uracils، وترك cytosines ميثليته دون تغيير 14. التسلسل أو تحليل PCR سلذا و بيسلفيت تحويلها الحمض النووي يسمح تحديد ما إذا كان السيتوزين الأصلي الميثيلي أو لا. مثيلة محددة PCR باستخدام تقنية صبغية يستغل الاختلافات في كفاءة PCR نظرا لعدم التطابق 3 "قاعدة الزوج بين الاشعال والقالب، وبالتالي يسمح تمييز من unmethylated مقابل cytosines ميثليته التالية تحويل بيسلفيت الحمض النووي (15). وبناء على ذلك، تم استخدام PCR مقرها صبغ ل quantitate نسبة النسبية للunmethylated لدائرة الهجرة والتجنيس ميثليته في الدراسات المبكرة من T1D تخضع 12،16. ومع ذلك، تكنولوجيا PCR القائم على صبغ لديها العديد من السلبيات، بما في ذلك خصوصية محدودة، ونقص الكميات المطلقة من تركيز الحمض النووي جزء، وعدم القدرة على تعدد (أي كشف كل أنواع الحمض النووي مميثل وunmethylated في نفس رد الفعل). كان أداء المجموعات الأخرى التسلسل المباشر لشظايا الحمض النووي خالية من الخلايا، وهي تقنية تسمح برصد العديد من المواقع الدليل السياسي الشامل مميثل تفاضلي مع كثير عظيمإيه خصوصية 9. ومع ذلك، فإن تقنية التسلسل تتطلب كميات عينة كبيرة، ليست قابلة للاستخدام العينات المخزنة بسهولة، وغير مكلفة.
ونتيجة لهذه القيود، لدينا مجموعة وغيرها قد استخدمت PCR الرقمي، وهي تقنية توفر الكميات المطلقة من شظايا الحمض النووي، يتطلب كميات ميكروليتر فقط من المصل من عينات جديدة أو راهن، غير قابلة للمضاعفة، ويظهر حساسية أكبر من PCR الكمي التقليدي ، وأقل تكلفة من التسلسل المباشر. وتنطوي تكنولوجيا PCR الرقمية استخدام المقايسات التمهيدي / مسبار التقليدية والتقسيم القائم على microfluidics من PCR رد فعل الماء في النفط إلى ~ 20،000 قطرات. وبعد ركوب الدراجات الحرارية من رد فعل المقسمة، ويتم تحليل قطرات في وقت لاحق من قبل الكريات تدفق لتحديد قطرات مع الاشارات الايجابية والسلبية. يستخدم إحصاءات بواسون لحساب كميات المطلقة (أرقام نسخة) من كل نوع الحمض النووي. د المفاهيميوقد وصفت etails على الرقمية PCR مكان آخر (17).
يصف هذا البروتوكول قياس موت الخلايا β في البشر عن طريق قياس ميثليته تفاضلي الحمض النووي INS بواسطة PCR الرقمي. قدمت البيانات المتوفرة لدينا هنا وفي أماكن أخرى 6 تبين أن مجموعات التمهيدي / المسبار التي تكشف عن مثيلة التفاضلية من السيتوزين في موقف -69 (نسبة إلى الموقع بداية النسخي من INS) يحمل خصوصية كافية لاما السيتوزين unmethylated (فام التحقيق) أو السيتوزين ميثليته ( التحقيق VIC) (انظر الشكل 1A و B). خليط من البلازميدات تحتوي على شظايا INS كلا مميثل وunmethylated في موقف -69 سنة مضت (أي بيسلفيت تحويلها الحمض النووي وجود أي اليوراسيل أو السيتوزين في موقف -69 بي بي) إشارات قطرات المعرض يحتوي على واحد أو البلازميد الآخرين، أو كليهما البلازميدات (إيجابية مزدوج في الشكل 1C). الحساب الإحصائي بواسون يستخدم الأرقام قطرة الإلكترونية التي هي ايجابية لتحقيق معين (سواء كانت متزوجة إيجابية أو انقر نقرا مزدوجا إيجابية) لاستخلاص الأرقام نسخة من كل ميثليته أو unmethylated جزء الحمض النووي.
عندما باستخدام المصل البشري لقياس cytosines ميثليته تفاضلي في موقف -69 بي بي في الحمض النووي خالية من الخلايا (الشكل 3)، بياناتنا تظهر اثنين من السمات الرئيسية: (1) مستويات INS مميثل هي 5-10 أضعاف أعلى في هذه المواضيع من INS unmethylated (بغض النظر عن التشخيص)، و (2) المستويات المطلقة من كل من دائرة الهجرة والتجنيس unmethylated ومميثل هي أعلى في الموضوعات مع T1D جديدة الحدوث مقارنة بالمجموعة الضابطة. في حين أن مستويات أعلى من دائرة الهجرة والتجنيس مميثل مقارنة unmethylated INS تعكس على الأرجح فإن العبء الأكبر من الحمض النووي خالية من الخلايا الناشئة من الخلايا غير بيتا، ومستويات أعلى من كلا النوعين من دائرة الهجرة والتجنيس في مواضيع T1D جديدة الظهور المحتمل يعكس زيادة في حجم β انتشارا موت الخلايا (في unmethylatedS)، وربما الموت / دوران من أنواع الخلايا الأخرى التي ترتبط مع الدولة المرض (على سبيل المثال، الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية). نوقش مزيد من المضاربة على الارتفاعات من كلا النوعين من دائرة الهجرة والتجنيس في مواضيع T1D-بداية جديدة قبل 6. بغض النظر عن مصادر كلا النوعين من دائرة الهجرة والتجنيس في مصل الدم من هؤلاء الأفراد، فمن الجدير بالذكر أن قياس نسب unmethylated لدائرة الهجرة والتجنيس ميثليته (كما ذكرت من قبل باحثين آخرين باستخدام PCR القائم على صبغ) لن يكون التقطت اختلافات كبيرة في المستويات المطلقة وصفت هنا وفي منطقتنا نشر مؤخرا 6، وبالتالي التأكيد على قوة PCR الرقمي لهذا النوع من التحليل العلامات البيولوجية.
وتجدر الإشارة إلى بعض الاحتياطات والقيود. ونحن نرى أنه من المهم أن الدم معالجتها في غضون 4 ساعات من جمع وإما استخدامها على الفور لعزل الحمض النووي أو تخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. في الدراسات غير المنشورة، لدينا التوليدerved فقدان بعض الانتعاش الحمض النووي بعد 4 ساعات من جمع، وربما بسبب تدهور الحمض النووي، كما رأينا في الدراسات التخزين الطويل الأجل من 18 عينة. بسبب زيادة حساسية PCR الرقمي، وينبغي إيلاء عناية خاصة لتجنب تلوث العينات التي لولاها لا يكون ملحوظا في QPCR التقليدي. وأخيرا، وجود قيود الرئيسي للتقنية هو تحليل العينات التي لا تتجاوز الجيل قطرة ~ 10،000 قطرات. هذه العينات لا توفر إحصاءات بواسون موثوق بها، وعلى هذا النحو يمكن اعتبار uninterpretable. ويمكن أن تشمل أسباب متعددة من هذا الجيل قطرة منخفض أخطاء فنية في التعامل مع العينة، والقضايا التقنية مع مولد قطرة، أو القضايا المتعلقة بنوعية من الكواشف المستخدمة.
وباختصار، يصف هذا التقرير بروتوكول مفصلة لقياس ميثليته تفاضلي، خالية من الخلايا INS الحمض النووي في موقف -69 سنة مضت PCR الرقمي. بروتوكول الموصوفة هنا يمكن أن تتكيف مع أيأنواع الحمض النووي الذي هو المطلوب الكشف عن cytosines ميثليته تفاضلي، سواء من التداول أو من الخلايا والأنسجة المعزولة، ويمكن أن توفر الكميات المطلقة من شظايا الحمض النووي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl2 and MgCl2) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 ml PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
References
- Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
- Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).
- Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778 (2014).
- Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
- Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: https://hirnetwork.org/ (2016).
- Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
- Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591 (2014).
- Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
- Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
- Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953 (2009).
- Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
- Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
- Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
- Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942 (2012).
- Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).
