Introduction
Il diabete di tipo 1 (diabete di tipo 1) è una malattia autoimmune che si caratterizza per la distruzione di isolotto che producono insulina β cellule da parte delle cellule T autoreattive 1. La diagnosi di diabete di tipo 1 è in genere effettuato al momento della misurazione della (glicemia> 200 mg / dl) iperglicemia in una magra, giovane individuo, che potrebbe presentarsi con chetoacidosi come prova di deficit di insulina. Al momento della diagnosi di diabete di tipo 1, vi è evidenza di sostanziale perdita della funzione delle cellule β e la massa (dal 50 - 90%) 2. Negli studi clinici, diversi farmaci modulatori immunitario che sono stati istituiti al momento della diagnosi ha portato alla stabilizzazione della funzione delle cellule β (e presumibilmente di massa), ma nessuno ha portato a remissione clinica della malattia, una scoperta che ha sollevato la chiamata per lo sviluppo di biomarcatori per la diagnosi precoce della malattia e per il tracciamento longitudinale efficacia di terapie combinate 3,4. Gli sforzi da consorzi internazionali, come ad uns Consorzio Research Network Islet Umana presso il National Institutes of Heath 5, hanno sottolineato la necessità di sviluppare biomarcatori che si concentrano sullo stress delle cellule β e la morte nel diabete di tipo 1.
In linea con questi sforzi, il nostro gruppo ed altri hanno recentemente sviluppato test biomarker che misurano circolanti, frammenti di DNA epigeneticamente modificati che nascono principalmente da morire le cellule beta 6-9. In tutti i saggi pubblicati fino ad oggi, il focus è stato sul quantificazione del gene umano codifica preproinsulina (INS), che dimostra maggiori gradi di non metilato siti CpG nelle regioni codificanti e promotore rispetto ad altri tipi di cellule. La liberazione di non metilato frammenti di DNA INS stato ipotizzato come derivanti principalmente dalla morte (necrosi, apoptosi) delle cellule beta. I nostri studi recenti hanno dimostrato che in gioventù, l'innalzamento di DNA sia metilato e metilato INS in posizione -69 bp (rispetto a tegli trascrizionale inizio sito) sono stati osservati in nuova insorgenza diabete di tipo 1, e insieme servito biomarcatori come specifici per questa popolazione 6. Questi dosaggi biomarker comportano l'isolamento di DNA cell-free dal siero o plasma utilizzando kit di spin commerciali, seguita da una conversione bisolfito del DNA isolato (per convertire cytosines non metilato per uracils, lasciando cytosines metilati intatto).
In questo rapporto, descriviamo gli aspetti tecnici della raccolta dei campioni di siero, l'isolamento del DNA cell-free dal siero, la conversione bisolfito, e le prestazioni di goccioline PCR digitale (d'ora in poi, PCR digitale) per differenziale metilato INS DNA.
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Representative Results
Per interpretare i dati in modo appropriato, usiamo i controlli plasmide sia per il target INS DNA non metilato e metilato in ogni seduta PCR digitale. Questi controlli assicurano che i segnali corrispondenti al DNA metilato e non metilato sono chiaramente distinguibili. La Figura 1 mostra i diagrammi di dispersione 2-D corrispondenti a gocce per controlli plasmide contenente bisolfito-convertito non metilato INS DNA (Figura 1A), metilato INS DNA (Figura 1B), e una miscela 1: 1 dei due plasmidi (Figura 1C). Plasmide contenente metilato INS è indicato con le goccioline positivi per il segnale 6-carbossifluoresceina (FAM), considerando plasmide contenente metilato INS è indicato con le goccioline positivi per il segnale VIC. Nella miscela 1: 1 plasmide, una popolazione di goccioline doppio positive è visto, corrispondente a goccioline contenenti entrambe le specie diDNA. Per distinguere le goccioline positivi da goccioline negativi, i dati sono gated utilizzando queste trame 2-D. Si noti che in Figura 1A, c'è un leggero spostamento delle goccioline FAM-positive nel canale VIC, indicando che la sonda per la metilato INS DNA esibisce una certa reattività crociata per il unmethylated INS DNA. Analogamente, in figura 1B, vi è un leggero spostamento delle goccioline VIC-positivi nel canale FAM, indicando cross-reattività della sonda per il DNA non metilato con il DNA metilato. Un vantaggio importante di PCR digitale è ancora può discriminare segnali specifici anche quando le sonde non sono specifici al 100%. Per appropriati Poisson calcoli statistici da parte della software, ogni reazione di PCR dovrebbe dividere in almeno 10.000 goccioline totale, visualizzare un gruppo di goccioline negativi, e mostrano una differenza di ampiezza chiara tra le goccioline negative e positive (per gating affidabile). Per dimostrare la linearità dei nostri primer, abbiamo pmiscele erformed dei due plasmidi attraverso diversi ordini di grandezza. Come mostrato in figura 2, concentrazioni variabili di un plasmide possono essere linearmente rilevati in presenza di una quantità costante di secondo plasmide. Per i nuovi laboratori di eseguire questa procedura, si consiglia di costruire un esperimento miscela simile a garantire che il test sta funzionando in modo rilevamento lineare.
Successivamente, abbiamo ottenuto il siero di tre soggetti con diabete di tipo 1 di nuova insorgenza (entro 2 giorni dalla diagnosi) e tre individui di controllo senza diabete di tipo 1 (vedi Tabella 1 per caratteristiche cliniche). I protocolli sono stati approvati dalla Institutional Review Board Indiana University. I genitori di soggetti previste Consenso informato scritto. La figura 3 mostra la quantificazione di non metilato e metilato INS DNA numeri / siero ml copiare, convertito in log 10 da questi controlli e soggetti T1D. I dati mostrano che i ndividuals con T1D presentano elevati livelli sia di metilato e non metilato INS DNA rispetto ai controlli, simili ai dati riportati in precedenza 6.
Figura 1: Rappresentante Parcelle 2-D di controlli plasmidi. Norme plasmidi sono stati generati clonando frammenti di bisolfito-convertito INS DNA ospitare citosina non metilato o denaturato alla posizione -69 bp rispetto al INS trascrizionale iniziare sito. Vengono mostrati trame 2-D utilizzando plasmide contenente metilato (A) e metilato (B) INS DNA e per una miscela 1: 1 dei due plasmidi (C). Le frecce identificano il unmethylated, metilato, e non metilato + metilato (doppio-positivo) INS DNA contenenti goccioline. FAM = Obiettivo 1; VIC = Target 2.ref = target "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54838/54838fig1large.jpg" = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Quantificazione degli Obiettivi del DNA utilizzando Control Plasmid miscele. Norme plasmide contenente frammenti clonati di bisolfito-convertito INS DNA ospitare citosina non metilato o denaturato alla posizione -69 bp rispetto al INS trascrizionale iniziare sito sono stati mescolati in varie combinazioni illustrate, poi sottoposto a PCR multiplex digitale. La figura mostra la quantificazione di frammenti di DNA bersaglio, presentati come copie / ml; r 2 = 0,989 per metilato INS DNA ed r 2 = 0,998 per metilato INS DNA. Clicca qui pervisualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: i livelli circolanti non metilato e metilato INS DNA nei controlli e soggetti con diabete di tipo 1. I campioni di siero sono stati raccolti da 4 giovani con nuova insorgenza diabete di tipo 1 e da 4, controlli non imparentati libera da malattia, poi elaborati per la misurazione del DNA INS differenziale metilato mediante PCR digitale. Indicato sono risultati di PCR digitali per non metilato (A) e metilato (B) INS DNA. I dati vengono visualizzati come singoli punti e media ± SEM. Le statistiche sono state analizzate da un studenti parametriche t test a due code. Clicca qui per vedere una versione più grande di This figura.
| controlli | T1D all'esordio | |
| Età (anni) | 10.3 ± 1.3 | 9.2 ± 1.0 |
| Femmina maschio | 1: 3 | 1: 3 |
| BMI Z-Score | 0.30 ± 0.9 | 0.74 ± 0.9 |
| HbA1c (%) | 11.1 ± 0.6 | |
| C-peptide (pmol / L) | 285,5 ± 37,0 |
Tabella 1: Demografia della controlli e soggetti con diabete di tipo 1.
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Discussion
La metilazione del cytosines di DNA metiltransferasi permette il controllo epigenetico della trascrizione in molti geni. Il gene INS nell'uomo è espresso quasi esclusivamente in isolotto β cellule, e sembra che vi sia una correlazione tra la frequenza di metilazione del cytosines nel gene INS per silenziamento della sua trascrizione 11. Come tale, la maggior parte dei tipi di cellule mostrano sostanzialmente frequenze più elevate di metilazione del gene INS a vari cytosines rispetto alle cellule ß 11 - 13. E 'stato proposto che la prevalenza di morte delle cellule β potrebbe essere monitorato attraverso l'analisi dei livelli sierici di cell-free non metilato INS DNA, che deriverebbero in gran parte da morire le cellule beta che liberano il loro DNA 12.
La reazione bisolfito converte cytosines non metilato in uracils, lasciando cytosines denaturato invariato 14. Il sequenziamento o PCR of bisolfito-convertito DNA consente quindi di determinare se la citosina originale era metilato o meno. Metilazione-specifica PCR utilizzando la tecnologia dye-based sfrutta le differenze in termini di efficienza della PCR a causa di 3 'base-coppia squilibri tra primer e modello, e quindi permette distinzione di non metilato contro cytosines denaturato a seguito della conversione bisolfito di DNA 15. Di conseguenza, a base di colorante PCR è stato utilizzato per quantificare il rapporto relativo di metilato di metilato INS nei primi studi di diabete di tipo 1 sottopone 12,16. Tuttavia, la tecnologia PCR dye presenta diversi inconvenienti, tra cui specificità limitata, mancanza di quantificazione assoluta di concentrazioni frammento DNA, e l'incapacità di multiplex (cioè, rilevare entrambe le specie di DNA metilato e non metilato nella stessa reazione). Altri gruppi hanno eseguito il sequenziamento diretto dei frammenti di DNA privi di cellule, una tecnica che consente il monitoraggio di diversi siti CpG differenziale denaturato con molto grandeER specificità 9. Tuttavia, la tecnica di sequenziamento richiede grandi volumi di campione, non è facilmente suscettibili di utilizzare dei campioni paraboliche, ed è costoso.
Come risultato di queste limitazioni, il nostro gruppo e altri hanno impiegato PCR digitale, una tecnica che fornisce quantificazione assoluta di frammenti di DNA, richiede solo quantità microlitri di siero di campioni freschi o sopraelevate, è suscettibile di multiplexing, mostra una maggiore sensibilità rispetto ai tradizionali PCR quantitativa , ed è meno costoso di sequenziamento diretto. La tecnologia digitale PCR implica l'uso di saggi di primer / sonda convenzionali ed un partizionamento microfluidica a base di acqua-in-olio PCR reazione in ~ 20.000 goccioline. Dopo cicli termici della reazione partizionato, le goccioline vengono successivamente analizzati mediante un citometro di flusso per identificare goccioline con segnali positivi e negativi. statistica di Poisson è utilizzato per calcolare le quantità assolute (numero di copie) di ogni specie di DNA. Il d concettualeetails di digital PCR sono state descritte altrove 17.
Questo protocollo descrive la misurazione della morte cellulare β nell'uomo misurando differenzialmente metilata DNA INS mediante PCR digitale. I nostri dati presentati qui e altrove 6 mostrano che le combinazioni di primer / sonda che rilevano differenziale metilazione della citosina alla posizione -69 (rispetto al sito di inizio della trascrizione di INS) presentano una specificità sufficiente sia per la citosina non metilato (sonda FAM) o la citosina metilata ( sonda VIC) (vedere Figura 1A e B). Miscugli di plasmidi contenenti frammenti INS sia metilato e non metilato nella posizione -69 bp (ossia bisolfito convertito DNA aventi una uracile o citosina alla posizione -69 bp) segnali goccioline presentano contenenti uno o l'altro plasmide, o entrambi plasmidi (double-positivi nella Figura 1C). Il calcolo statistico di Poisson utilizza °numeri gocciolina e che sono positivi per un dato sonda (se singolo o doppio positivo-positivo) per ricavare i numeri copia di ogni frammento di DNA metilato o non metilato.
Quando si utilizza siero umano per la misurazione del cytosines differenziale denaturato alla posizione -69 bp nel DNA cell-free (figura 3), i nostri dati dimostrano due caratteristiche fondamentali: (1) i livelli di INS denaturato sono 5-10 volte maggiore in questi soggetti che non metilato INS (a prescindere dalla diagnosi), e (2) i livelli assoluti di entrambi INS non metilato e denaturato sono più elevati nei soggetti con diabete di tipo 1 di nuova insorgenza rispetto ai controlli. Considerando che i livelli più elevati di INS denaturato rispetto ai non metilato INS probabilmente riflettono il maggior carico di DNA cell-free proveniente da cellule non-beta, i livelli più elevati di entrambe le specie di INS nei soggetti T1D nuova insorgenza probabilmente riflette sia un aumento della β prevalente morte cellulare (IN unmethylatedS), e forse la morte / fatturato di altri tipi di cellule che sono associati con lo stato di malattia (ad esempio, innata e adattativa cellule del sistema immunitario). Ulteriori speculazioni sulle elevazioni di entrambe le specie di INS nei soggetti T1D nuova insorgenza è stata discussa in precedenza 6. Indipendentemente dalle fonti di entrambe le specie di INS nel siero da questi individui, è da notare che la misurazione dei rapporti di non metilato a metilato INS (come riportato da altri ricercatori utilizzando tinture a base di PCR) non avrebbe raccolto le differenze significative nei livelli assoluti descritto qui e nella nostra recente pubblicazione 6, sottolineando così il potere di PCR digitale per questo tipo di analisi biomarker.
Va notato alcune precauzioni e limitazioni. Riteniamo che sia importante che il sangue viene elaborato entro 4 ore di raccolta e subito sia utilizzato per l'isolamento del DNA o conservato a -80 ° C per un uso futuro. In studi non pubblicati, abbiamo osserved certa perdita di recupero del DNA dopo 4 ore di raccolta, forse a causa degradazione del DNA, come visto in studi di stoccaggio a lungo termine di campioni 18. A causa della maggiore sensibilità della PCR digitale, particolare attenzione deve essere presa per evitare la contaminazione dei campioni che altrimenti non essere evidente nel tradizionale qPCR. Infine, una limitazione fondamentale della tecnica è l'analisi di campioni in cui la generazione gocciolina non superiore ~ 10.000 goccioline. Questi campioni non forniscono statistiche affidabili Poisson, e come tali possono essere considerati non interpretabile. Molteplici le cause di tale bassa generazione di goccioline potrebbero includere errori tecnici di manipolazione dei campioni, problemi tecnici con il generatore di gocce, o le questioni relative alla qualità dei reagenti usati.
In sintesi, la presente relazione descrive il protocollo dettagliato per la misurazione del differenziale metilato, cell-free DNA INS alla posizione -69 bp mediante PCR digitale. Il protocollo qui descritto può essere adattato a qualsiasispecie di DNA per cui il rilevamento di cytosines differenzialmente metilati è desiderato, sia dalla circolazione o da cellule isolate e tessuti, e possono fornire la quantificazione assoluta dei frammenti di DNA.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl2 and MgCl2) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 ml PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
References
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