Summary
Dyrking menneskelige Mesenchymale stromale celler (hMSCs) med autolog serum, reduserer risikoen for avvisning av xenogene materiale og andre negative effekter. Den gjør det også for utvinning av en undergruppe av mesodermal stamfedre, som kan levere ferske hMSCs. Embedding hMSCs i et autologt fibrinaggregat gjør håndteringen enkel og effektiv kirurgisk implantasjon.
Abstract
Menneskelige Mesenchymale stromaceller (hMSCs) dyrket in vitro med forskjellige medier. Begrensninger på deres bruk i kliniske settinger, men først og fremst avhenge av potensielle biohazard og betennelser risikoer som utøves av xenogene næringsstoffer for deres kultur. Menneske derivater eller rekombinante materiale er førstevalget kandidater til å redusere disse reaksjonene. Derfor kulturtilskudd og materialer av autolog opprinnelse representerer de beste næringsstoffer og de sikreste produktene.
Her beskriver vi en ny protokoll for isolering og kultur av benmargs hMSCs i autologe forhold - nemlig pasient-avledet serum som et supplement til kulturmedium og fibrin som et stillas for HMSC administrasjon. Faktisk kan HMSC / fibrinaggregat konstruksjoner være svært nyttig for flere kliniske applikasjoner. Spesielt fokuserer vi på deres bruk i ortopedisk kirurgi, hvor fibrinkoagelen avledet fra giverens eget blod tillatteffektiv celle levering og næringsstoffer / avfallsbørser. For å sikre optimale sikkerhetsforhold, er det av største betydning for å unngå risikoen for HMSC transformasjon og vev gjengroing. Av disse grunner, er metoden som er beskrevet i denne artikkelen indikerer også en minimal ex vivo HMSC ekspansjon, for å redusere celle-senescens og morfologiske forandringer, og kortvarig osteo-differensiering før implantering, for å indusere osteogene avstamning spesifikasjon, og dermed redusere risikoen for etterfølgende ukontrollert spredning.
Introduction
Menneskelig Mesenchymale stromale celler (hMSCs) representerer en av de beste cellekilder for bruk i tissue engineering for å fremme osteogenesis 1,2. De er lett isolert fra benmarg og andre voksne vev, og uttrykker typiske overflatemarkører som CD90, CD105, CD73 1. Videre kan de differensiere til flere celletyper, så som osteoblaster, kondrocytter og adipocytter 3. Deres terapeutiske effekter er knyttet til deres regenererende og trofiske egenskaper 4. hMSCs kunne brukes i ortopedisk kirurgi, så vel som i andre regenerativ kliniske anvendelser. De blir fortrinnsvis kombinert med stillasene, for å forbedre den kliniske resultatet 5.
Sammenlignet med andre materialer, viser fibrin-gelen interessante egenskaper slik som klebrighet, resorpsjon og effektiv transport av næringsmidler, som gjør det svært nyttig for en rekke forskjellige vev tekniske anvendelser 6,7.
I vår fremgangsmåte, fibringel, avledet fra pasientens eget blod, og autologt serum, for in vitro hMSCs kultur, ble anvendt som en mulig terapeutisk løsning på den ortopediske felt 8.
For kliniske formål, er hMSCs vanligvis administreres via to hovedtiltak: (i) "one-step" prosedyren (dvs. minimal manipulasjon), som gjør at bilen transplantasjon av benmarg, enten hele eller konsentrert (dvs. mononukleære celler), under operasjonen; og (ii) "to-trinns" fremgangsmåten (dvs. omfattende manipulasjon), som er basert på ex vivo ekspansjon av hMSCs for å øke utbyttet før implantering, og krever GMP fasiliteter 9. Interessant, dyrking av cellene med et voksent menneske serum i stedet for bovint kalveserum tillater utvinning, sammen med hMSCs, av en undergruppe av celler (1 - 10% i mononukleære kulturer) kalt mesodermal progenitorceller (MPCS), i stand til in vitro differensiering i frisk hMSCs 10,11. Således kan hMPCs spille en betydelig rolle i den regenerative prosessen sammenlignet med hMSCs alene 12,13. Til slutt presser kortsiktig osteo-induksjon hMSCs å starte sin differensiering inn i osteogene avstamning uten å miste sin proliferativ potensial og levedyktighet 12. Disse resultater bekrefter de tidligere studier som har rapportert forsterket in vivo bendannelse ved hMSCs, etterfulgt av en forkultur i osteogene medium 14. Videre kan et autologt plasma blodpropp som et stillas for celle levering lett manipuleres av kirurgen og formet til å passe formen av benhulrommet 13.
therefore, kan denne metoden være svært nyttig for de forskere og klinikere som tar sikte på å oversette deres HMSC basert terapi fra benk til sengen i ortopedisk applikasjoner.
Protocol
Den nåværende protokollen ble utviklet i henhold til World Medical Association er Helsinkideklarasjonen om etisk framferd i forskning som involverer mennesker. Den ble godkjent av etisk komité for Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana.
NOTAT:
Benmarg ble innhentet fra pasienter som gjennomgår rutine total hofteprotesekirurgi (i henhold til punkt 1.1) 15; plasma for clot preparatet ble erholdt fra autologe perifere blod 13; autologt serum, som et supplement til kulturmediet, ble samlet inn fra en autolog hel-blod-aferese. Alle pasientene fikk detaljert informasjon om fremgangsmåten og undertegnet en skriftlig samtykkeerklæring.
1. Innsamling av benmargsprøven
- Samle benmarg fra femoral margkanalen etter en total hofteprotesekirurgi (for forskningsstudier). I korthet, i løpet av den kirurgiske forberedelse av benmargskanalen til hOuse protesestammen, samle margen blod som flyter over (ca. 10 - 15 ml, avhengig av protesen størrelse) 15.
ELLER - Samle benmargsaspirat fra hoftekam under lokalbedøvelse, følgende standard hematologisk prosedyre om 20-30 d på forhånd (for kliniske formål) 16.
MERK: I begge tilfeller hepariniserte sprøyter (for å hindre dannelse av blodpropper) må brukes for benmargs utvinning.
2. Utarbeidelse av Autolog Plasma
- Samle 20 ml perifert blod fra pasienten i vakuum blodprøverør inneholdende K3 EDTA (5,4 mg i 3 ml rør) og sentrifuger ved 2400 x g i 15 min.
- Aspirer plasmakomponent i et 15 ml rør og fryse ved -20 ° C inntil bruk.
3. Utarbeidelse av Autolog Serum
- Overfør den enhet av plasma inn i en overføringspose ved hjelp av en pigg. Koble den fylte posen ved sveising og weigh posen til å beregne volumet av plasma (figur 1A).
- Koagulere det autologe plasma ved å injisere kalsiumglukonat 100 mg / ml ved 10% vekt / volum gjennom portkoblingen (figur 1B). Etter blanding posen, legg den ved 4 ° CO / N uten risting for å lette dannelse av blodpropper.
- Sentrifuger posen ved 4900 x g i 15 min ved RT. Ta sentrifugen bøtte ut av sentrifugen og fjerne posen forsiktig (følg produsentens retningslinjer for utarbeidelse av blodplatelysatet) (figur 1C).
- Isoler blodpropp like over klemmen for å lette filtrering. Koble filtrering kit til overføringspose ved hjelp av en pigg plassert inn i åpningen av filtrerings kit.
- Heng posen og åpne den blå klemmen å la serum flyt av tyngdekraften. Ikke legg press på filter for å unngå overføring av fibrin i posen. Etter filtrering forsegle røret og fjerne posen (følg fabrikatTURER retningslinjer for utarbeidelse av blodplatelysatet).
- Koble en dedikert linje til den endelige pose og overføring serum i 50 ml rør under en laminær strøm benk for å unngå mikrobiell kontaminering.
- Ta en prøve med en sprøyte for å teste fravær av fibrinogen og utføre en test for sterilitet aerobe og anaerobe bakteriekulturer 17. Merk rørene på riktig måte og fryse dem på - 20 ° C til bruk.
4. Utarbeidelse av Expansion Medium
- Forbered 500 ml av komplett spredning medium. Å Dulbeccos Modified Eagle Medium - Low Glukose (DMEM-LG), tilsett 10% autologt serum (oppnådd som beskrevet i kapittel 3), 2 mM glutamin, 1% antibiotika løsning og 1% antimycotic løsning. Steril-filter fullstendig spredning medium.
5. Isolering av hMSCs fra benmargen
- Overfør benmargsprøven (5 - 10 ml) fra sprøyten inn i en 50 ml konisk tuvære og fortynne den med sterilt saltvann (forhold 1: 4). Vortex 50 ml rør i 30 s for å disaggregert celleklynger.
- Varm densitet-gradient (densitet 1,077 g / l; se tabell of Materials) til romtemperatur før bruk og laget av den fortynnede benmargen forsiktig (for å forhindre blanding av begge lag) ut mot densitetsgradient den ved tilsetning av 20 ml av prøven til 15 ml av tetthet gradient for hver 50 ml tube (figur 2A).
- Sentrifuger ved 400 x g uten brems ved 25 ° C i 30 min, og samle det mononukleære fraksjonen ved væske-væske-grensesnittet og overføre den til en ny 50 ml rør ved hjelp av en steril 5 ml pipette.
- Vask den oppsamlede mononukleære fraksjon to ganger med komplett medium spredning og sentrifugere rørene ved 400 x g i 10 minutter ved 25 ° C for å oppnå celle-pellets.
- Kast supernatanten og resuspender forsiktig hver celle pelleten i 5 ml fullstendig medium spredning. Fortynn ved en 1: 100-forhold for celletelling.
- Tell cellene ved bruk av et hemocytometer etter en 1: 1 fortynning med Trypan blå farging for å evaluere cellelevedyktighet.
6. kultur hMSCs i nærvær av Autolog Serum
- Fylle to eller flere 75 cm2 vevskultur (TC) kolber med 15 ml friskt komplett medium proliferasjon og overføre dem til en cellekulturinkubator ved 37 ° C og 5% CO2 inntil bruk.
- Seed 0.3 - 0,5 x 10 6 celler / cm2 (37,5 x 10 6 celler / 15 ml friskt komplett spredning medium) og inkubert ved 37 ° C og 5% CO2 i 48 timer.
- På samme tid, frø 1 x 10 6 celler i en 25 cm to TC-kolbe med 5 ml friskt komplett spredning medium for den kolonidannende enhet - fibroblast (CFU-F) assay. Kultur for 2 uker (for å bli videreført i § 12).
- Kast medium og vask forsiktig flaskene fra trinn 6.2 med full spredning medium til remOve-festede celler og rusk. Legg friskt medium til kolbene og erstatte halvparten av det to ganger i uken, kommer til 70 - 80% sammenflytning (primærkultur, Passage 0 (P0)) (figur 2B).
- Utvinne cellene ved hjelp av en spesiell rekombinant animalsk fri protease (se tabell of Materials, bruke 3 ml av løsningen pr kolbe som anbefalt av produsenten) og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 10 min. Tilsett 6 ml komplett spredning medium pr kolbe og samles i en 50 ml tube. Gjenta trinn 5.6.
MERK: Viktig Bruken av denne protease i stedet for trypsin tillater utvinning av enkelte mesodermal progenitorceller celler (MPCS) til stede i kulturen, som er trypsinresistent. - For ytterligere ekspansjon, replate cellesuspensjonen på 2000 - 3000 celler / cm 2 i nye 75 cm 2 TC kolber (P1) (Figur 2C).
- Bruk porsjoner av celler for å evaluere differensierings potensialene for MSCermot osteogene, adipogenic og chondrogenic linjene. Utfør differensierings analyser etter produsentens anbefalinger (figur 2D).
MERK: Ulike fargemetoder kan brukes til å vurdere multilineage differensiering.
7. Utarbeidelse av en osteogent Medium Farmasøytiske kosttilskudd
- Fortynn askorbinsyre oppløsning (oppløsning 1A:. Askorbinsyre 200 mg / ml (se tabell of Materials) 1:10 med DMEM-LG, for å oppnå en 20 mg / ml oppløsning (oppløsning 1B, arbeidsløsning) arkiv porsjoner av oppløsninger 1A og 1B ved -20 ° C inntil bruk.
- Resuspender 1 g hydrokortison i 10 ml sterilt vann (oppløsning 2A: hydrokortison 100 mg / ml (se tabell of Materials) fortynnet oppløsning 2A ved 1:. 1000 med DMEM-LG for å oppnå et 100 mikrogram / ml oppløsning (Oppløsning 2B, arbeider oppløsning). arkiv porsjoner av oppløsninger 2A og 2B ved -20 ° C inntil bruk.
- Ved bruk prepare frisk osteogene medium som følger: legge til DMEM-LG med 10% autologt serum, 50 ug / mL askorbinsyre og 0,4 ug / ml hydrokortison. Steril-filter det osteogene medium.
8. osteogene Pre-induksjon og gjenoppretting av hMSCs
- Fjerne spredning medium og tilsett osteogene mellom 96 h før celle høsting (dvs. 80 - er 90% samløpet vanligvis nås på 7 d). Gi en ekstra osteogene medium endring 24 timer før celle høsting.
- Løsne cellene som beskrevet i trinn 6.5 og forsiktig resuspender pelleten tilsette 2 ml av fullstendig spredning medium i et 50 ml rør.
MERK: Cellenes levedyktighet kan bli redusert (ca. 10%) som et resultat av osteoinduction. Cellular aggregater kan observeres. - Etter telling, vask cellene med proliferasjon fullstendig medium og sentrifuger ved 300 x g i 5 min. Resuspender pellet forsiktig på 1-2 x 10 6 levedyktige celler / 2ml autolog plasma (se punkt 2) per 50 ml tube.
9. Utarbeidelse av HMSC / fibrinaggregat konstruerer
- Tilsett 150 ul av kalsiumglukonat ved 100 mg / ml til hver 50 ml rør oppnådd i trinn 8.3. og resuspender cellene under forsiktig risting.
- Inkuber cellene ved 37 ° C og 5% CO2 i 15 - 30 minutter for å oppnå HMSC / fibrinklump konstrukter (figur 3A). Fremstille en fibrinklump konstruksjon uten cellene til å bli brukt som en kontroll.
MERK: Viktig: Det anbefales å fremstille denne styring klump minst 2 timer før den celleviabilitet analysen, som det tar 30 minutter eller mer for å tverrbinde.
10. celleviabilitet Assay
- Fjern væsken fra 50 ml rør og tilsett 1 ml komplett spredning medium inneholdende 10% volum / volum cellenes levedyktighet reagens (AB; se tabell of Materials), i henhold til produsentens retningslinjer.
- Inkuber the rør ved 37 ° C og 5% CO 2 i 3 timer. Mål absorbansen ved 570 nm med en referansebølgelengde på 600 nm (AB ved tid 0, t0).
- Kast supernatanten og tilsett 2 ml av fersk komplett spredning medium. Inkuber ved 37 ° C, 5% CO 2 O / N. Neste dag (AB ved 24 h, t24), gjenta trinn 10.01 til 10.03 (figur 3B).
11. histologisk vurdering av Cell Livskraftig og kalsium deponering inne fibrinaggregat konstruerer
- Fix HMSC / fibrinaggregat konstruksjoner i 4% vekt / volum nøytral bufret formalin O / N ved 4 ° C. Vask 4x i D-PBS i 15 min og butikken i 70% etanol.
- Dehydrere prøvene ved 40 ° C i en serie av gradert etanol: 80% en gang i 30 min, 95% to ganger i 45 min og 3 x 100% i 1 time. Klargjøre to ganger i xylen i 45 minutter ved 40 ° C.
- Skyll prøvene i flytende parafin ved 60 ° C i 2 timer og legge dem. Skjær parafin blokk med en mikrotom og monter than seksjoner (5 um) på glassplater.
- Flekk deparaffinized seksjoner ved hjelp av standard Hematoxylin og eosin (H & E) metoden (Figur 3C).
- Utføre von Kossa-farging ved behandling av seksjoner med 1% sølvnitrat i 15 min, 0,5% Pyrogallol i 2 min, og 5% natriumtiosulfat i 2 min. Counterstain seksjonene med 0,1% kjerne fast red fortynnet i en oppløsning inneholdende 5 g aluminiumsulfat i 5 minutter og skylle dem i vann fra springen i 5 min. Monter delene med en monteringsmiddel.
- Vurdere mineralavsetning som svarte partikler i henhold lysmikroskop (400X forstørrelse) (Figur 3D).
12. CFU-F-analyse
- Vask 25 cm2 kolbe (fra trinn 6.3.) Med D-PBS. Flekk ved hjelp av standard May-Grunwald / Giemsa metoden. Visuelt kvantifisere HMSC nummer etter scoring individuelle kolonier (figur 4) under et lysmikroskop.
MERK: Hvisbenmargen blir tatt som i trinn 1.2. og seksjonene 2-9 er utført i Good Manufacturing Practice (GMP) med nødvendig regulatorisk godkjenning, kan HMSC / fibrinaggregat konstruksjoner implanteres for ortopediske applikasjoner.
Representative Results
Utarbeidelse av autologt serum
Plasmakoagulasjon, utført ved tilsetning av kalsiumglukonat til overføringspose, tillater gjenvinning av autologt serum i store mengder, slik det kreves for HMSC kulturen. Faktisk, med denne teknikken, er det mulig å oppnå opp til 200 ml av serum (figur 1).
HMSC isolasjon, kultur og differensiering ved hjelp av autologt serum
Benmarg mononukleære celler isoleres ved hjelp av en densitetsgradient, noe som gir opphav til en mellomliggende ring lag (figur 2A). Ved utsåing av disse cellene og fjerning av de ikke-adherente de med vasking, er det mulig å isolere hMSCs (figur 2B). Under autologe dyrkningsforhold, er en undergruppe av celler, kalt MPCS, oppdaget ved P0 og i prosenter opp to 10%, avhengig av pasient variabilitet (figur 2B). MPCS fremdeles er til stede etter replating (dvs. P1) hvis protease blir benyttet for celleaging (figur 2C). hMSCs isolert og dyrket i et autologt innstillingen opprettholde sin evne til å skille mot de tre kjente mesodermal linjene (osteogene, adipogenic, og chondrogenic). Den differensieringsanalyser ble utført for å sammenligne HMSC populasjonen identitet med de som ble oppnådd ved anvendelse av standard (nonautologous) dyrkningsbetingelser. Som funksjonalitet analyser for denne protokollen, von Kossa flekker, osmiumtetroksyd flekker, og Alcian blå flekker ved pH 1 ble valgt i stedet for de som er foreslått av differensiering media produsenten (se tabell of Materials) (figur 2D).
Forberedelse, levedyktighet og histologisk karakterisering av MSC / fibrinaggregat konstruksjoner
(figur 3A). Inne i disse plasma blodpropp, de hMSCs er levedyktig, som demonstrert av fargeendring av cellen levedyktighet fargestoff t24 fra blått (kontroll uten celler) til rosa (cellularized koagulere) (figur 3B). Celleviabilitet inne blodpropp er bekreftet av H & E farging, viser en godt bevart celle morfologi (Figur 3C). Videre, en minimal osteoinduction like før den andre cellen høsting gir opphav til foreløpig kalsium deponering av stimulerte hMSCs (figur 3D).
Kolonidannende enhet
Tilstedeværelsen av HMSC kolonier etter 2 uker i kultur er vist ved CFU-F-analysen (figur 4).
s = "jove_step" fo: keep-together.within-page = "1"> Bruk av MSC / fibrinkoagel konstruere i bein uorganiserte
HMSC / fibrin blodpropp konstruksjoner oppnådd som beskrevet i denne metoden (trinn 1.1) ble vellykket anvendt for å behandle alvorlige overekstremitet nonunions i 8 medfølende tilfeller 13. Langsiktig (maks 7,6 måneder) vurdering bekreftet vellykkede kliniske og funksjonelle utfall for alle pasienter, uten tegn på vev vekst eller tumordannelse.
Figur 1. Utarbeidelse av Autolog Serum.
(A) Plasmaenheten overføres i en overføringsposen med pigg; (B) Den plasma koaguleres ved å injisere kalsiumglukonat via portkoblingen; (C) En blodpose sentrifuge blir anvendt for å separere serumet./files/ftp_upload/54845/54845fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. HMSC Isolasjon, kultur og Differensiering ved hjelp av Autolog Serum.
(A) Det mononukleære cellelaget (i den blå linje vindu) ble oppnådd etter benmargssentrifugering med en densitetsgradient; (B) Den cellekultur slik det vises på P1; (C) Cell kultur som det ser ut ved P0 (primær kultur); (B - C) Piler viser tilstedeværelse av MPCS i MSC kultur. Scale bar er 100 mikrometer; (D) histokjemiske resultatene av multilineage differensieringsanalyser. Osteogene differensiering er vurdert ved hjelp av von Kossa farging for mineral matrise deponering i svart, adipogenic differensiering er vist ved tilstedeværelsen av fettstoffer vakuoler, farget i svart av osmium tetroxide, og chondrogenic differensiering vises ved tilstedeværelsen av sulfaterte glykosaminoglykaner som er farget i blått med Alcian blå farging ved pH 1. Skala bar er 50 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Forberedelse, Livskraftig og Histologisk Karakterisering av MSC / fibrinaggregat konstruksjoner.
(A) HMSC / fibrinaggregat konstruere som det ser ut etter kryssbinding; (B) Utfall av AB analysen: den MSC er levedyktige inne fibrinaggregat, som demonstrert av fargeendring av cellen levedyktighet fargestoff (t24), fra blått (kontroll uten celler, til høyre) til rosa (cellularized blodpropp, på venstre). (C - D) histokjemiske resultatene av HMSC / fibrinkoagel konstruksjoner. Scale bar er50 um. (C) Hematoxylin og Eosin farging og viser levedyktige celler som er innleiret i den fibrin-matrise; (D) Mineral matrise deponering farget i svart ved von Kossa flekker, noe som bekrefter en innledende osteogenesis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. CFU-F analysen.
Bilde av en kolbe dyrket med hMSCs farget av May-Grunwald / Giemsa metoden. Den zoomet inn området er en lett-mikrograf viser morfologi av en HMSC koloni. Scale bar er 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Bruk av HMSC / fibrin Clot Konstruer i Bone nonunion.
(A) X-ray av øvre lem av en pasient påvirket av pseudartrose; (B) HMSC / fibrinaggregat konstruere like før implantasjon; (C) Kirurgisk anvendelse av HMSC / fibrinkoagel konstruksjon; (D) X-ray av øvre lem av samme pasient etter 5 år. Dette tallet er republisert fra Giannotti S. et al. med minimale modifikasjoner 13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
De kritiske trinn av denne protokoll har med bruk av et voksent menneske serum og protease, noe som tillater å oppnå en BIOSAFE HMSC terapi. Spesielt gjør at menneske voksen serum isolasjon og vedlikehold, mens protease sikrer avling, av MPCS. Disse er umodne celler i benmargen som kan gi opphav til nye hMSCs, og dermed sikre et reservoar av levedyktige hMSCs langs kulturen tid. Ikke alle MPCS kan samles, ettersom øke eksponeringstiden til den protease-aktivitet er skadelig for HMSC levedyktighet. Av denne grunn ble en 10 min inkubasjon protease valgt til optimalt kompromiss mellom utvinning av MPCS og levedyktigheten til hMSCs. Et annet kritisk punkt er osteodifferentiation tid. Faktisk ville en utstrakt in vitro osteodifferentiation betraktelig redusere cellenes levedyktighet, og dermed påvirke slutt bendannelse in vivo. Den siste kritiske trinnet består i availing av en autolog bioresorberbart stillaset, hh oppnås ved å bygge cellene (hMSCs og MPCS) i en fibrin gel fra plasma clotting.
Et viktig skritt for å forbedre utbyttet av MPCS er i frø mononukleære celler ved høyere konsentrasjon. Ved hjelp av aferese for å oppnå plasma og behandle det med kalsiumglukonat gjør det mulig å oppnå autologt serum i store mengder. Det har blitt observert at humant serum som et medium supplement er sammenlignbare med føtalt bovint serum (FBS) i HMSC kulturer. Men i vår erfaring, en komplett medium supplert med FBS bidrar til raskere alderdom enn voksent menneske serum. Et viktig skritt er at tilførsel av en minimal osteoinduction til hMSCs. Faktisk, dette fører behandling cellene for enkelt å skille mot osteogene avstamning, og dermed være nyttig for å unngå ytterligere celle transformasjon in vivo. For å opprettholde en god levedyktigheten til minimal osteoinduced hMSCs, anbefales det å følge nøye anbefalingene beskrevet i trinn 6.5. end 8.2., inkludert håndtering, sentrifugering og mellom beløp som skal legges til. Hvis en aferese prosedyre ikke er tilgjengelig, er det fortsatt mulig å gjennomføre denne protokollen ved å utføre flere blod trekker til pasienten, eller i alternativ, ved å kjøpe samlet AB sera. Selvfølgelig, for å bringe denne protokollen fra benken til sengen, er det obligatorisk å ha GMP cellefabrikker eller ekvivalenter, tilgjengelig.
Begrensninger i anvendelsen av denne teknikken bekymring blodfattig, hematologiske-onkologi og ortopediske pasienter rammet av osteomyelitt., Tegning store mengder blod fra anemiske pasienter, bør unngås. I onkologiske pasienter, er kvaliteten på celleprøver påvirket av kjemoterapi behandlinger, mens i osteomyelitt pasienter infeksjonen kan påvirke det endelige resultatet. I alle tilfeller der autolog serum er utilstrekkelig eller uegnet, samlet mannlig AB sera representere et godt alternativ.
Ved hjelp av celle / fibrin cloT-konstruksjoner for mulige kliniske applikasjoner er avgjørende for å slippe en helt autolog celleterapi, som kan være lett å håndtere og mugg under operasjonen, noe som resulterer i gode resultater for å behandle bein ikke-fagforeninger 13. For kliniske formål, blir hMSCs vanligvis administreres via to hovedtiltak: minimal manipulasjon og omfattende manipulering 9. For å overvinne problemene knyttet til en omfattende ex vivo kultur, som for eksempel avvik i cellemorfologi og størrelse 18, utførte vi en kort tid ex vivo celleutvidelse og osteo-differensiering (bare 4 d).
The Xeno-free-protokollen er beskrevet i denne artikkelen, sammen med de korte celle ekspansjon og osteodifferentiation ganger vist seg å være relevant i klinikker for å få rask bein produksjon in vivo, uten tegn på vev gjengroing og transformasjon, og dermed bekrefter sin effekt og lang -term sikkerhet i bein reparasjon (figur 5) 13.
Metodikken presenteres i denne rapporten er rettet mot å demonstrere effekt og sikkerhet av HMSC in vitro ekspansjon i autologe vilkår for mulig bruk i ortopedisk kirurgi. Denne protokollen benytter hMSCs isolert fra benmarg og dyrket i et medium supplert med autologt serum og innleiret i autologe fibrinkoagel, og dermed sikre en fullstendig autolog celle terapi. De to-fold osteogene induksjon, like før den andre løsgjøring, forbedrer HMSC evne til å differensiere til osteoblaster. Som et resultat, er denne teknikken spesielt egnet for anvendelser i bendefekter, siden den ikke er begrenset til pseudartrose. Mulige fremtidige søknader kan innebære Talos cyste og bentap ledelse.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triple Select (1x) | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 12563-029 | cell culture |
| Trypan blue stain | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
| DMEM-LG, no glutamine, no phenol red | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 11880-028 | cell culture |
| Glutamax (100x) | Gibco, Life Technologies | 35050038 | cell culture |
| Penicillin/Streptomycin sol. | Gibco, Life Technologies | 15140122 | cell culture |
| Alamar Blue (AB) | Gibco, Life Technologies | DAL1025 | proliferation/viability assay |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-14440-02 | cell culture |
| D-PBS | Gibco, Life Technologies | 14190-094 | cell culture |
| StemMACS AdipoDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-677 | cell culture |
| StemMACS ChondroDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-679 | cell culture |
| hMSC Osteogenicdiff BulletKit | Euroclone | LOPT3002 | cell culture |
| Vitamin C (ascorbic acid) | Bayer | ATC Code: A11GA01 | Pharmaceutical grade drug |
| Flebocortid Richter (hydrocortisone) | Aventis Pharma | ATC Code: H02AB09 | Pharmaceutical grade drug |
| Victor X3, reader | PerkinElmer | 2030 multilabel reader | proliferation/viability assay |
| Silver nitrate | Sigma Aldrich | 209139 | histological assay |
| Pyrogallol | Sigma Aldrich | 16040 | histological assay |
| Sodium Thiosulphate | Sigma Aldrich | S8503 | histological assay |
| Histoplast LP | Thermo Scientific | 8332 | histological assay |
| Methanol | Sigma Aldrich | 32213 | histological assay |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | histological assay |
| Nuclear fast red | Sigma Aldrich | 60700 | histological assay |
| Formalin | Bio-optica | 05-K01009-X40 | histological assay |
| Eosin B | Sigma Aldrich | 45260 | histological assay |
| DPX | Sigma Aldrich | 6522 | histological assay |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich | H3136 | histological assay |
| Aluminium Sulphate | Sigma Aldrich | 202614 | histological assay |
| Xylol | Sigma Aldrich | 534056 | histological assay |
| Microtome | Leika | histological assay | |
| May Grunwald | Sigma Aldrich | MG1L-1L | histological assay |
| Giemsa | Sigma Aldrich | 32884-250ML | histological assay |
| Transfer bag | Biomérieux | BC0300031 | cell culture |
| Filtration kit | Macopharma | BC0800010 | cell culture |
| Calcium Gluconate | Galenica Senese | Pharmaceutical grade drug | |
| Bact Alert | Biomérieux | 259790 anaerobic | microbiological assay |
| Bact Alert | Biomérieux | 259789 aerobic | microbiological assay |
| Steryle Luer-Lok Syringe 50 mL | BD Plastipak | 300865 | cell processing |
| Heraeus Cryofuge 6000i | Thermo Scientific | blood bag centrifuging | |
| SL16R Centrifuge | Thermo Scientific | blood tube centrifuging |
References
- Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7, 393-395 (2005).
- Kassem, M., Abdallah, B. M. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: biological characteristics and potential role in therapy of degenerative diseases. Cell Tissue Res. 331, 157-163 (2008).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Bonfield, T. L., Nolan Koloze, M. T., Lennon, D. P., Caplan, A. I. Defining human mesenchymal stem cells efficacy in vivo. J Inflamm. (Lond). 25 (7), 51 (2010).
- Pneumaticos, S. G., Triantafyllopoulos, G. K., Chatziioannou, S., Basdra, E. K., Papavassiliou, A. G. Biomolecular strategies of bone augmentation in spinal surgery. Trends Mol. Med. 17 (4), 215-222 (2011).
- Amhed, T. A. E., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: A versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Engineering Part B. 14 (2), 199-215 (2008).
- Silbertein, L. E., Williams, L. J., Huglett, M. A., Magee, D. A., Weisman, R. A. An autologous fibrinogen-based adhesive for use in oncologic surgery. Transfusion. 28 (4), 319-321 (1988).
- Jockenhoevel, S., et al. Fibrin gel advantages of a new scaffold in cardiovascular tissue engineering. Eur. J. Cardiothorac Surg. 19 (4), 424-430 (2001).
- Veronesi, F., et al. Clinical use of bone marrow, bone marrow concentrate, and expanded bone marrow mesenchymal stem cells in cartilage disease. Stem Cells Dev. 22 (2), 181-192 (2013).
- Petrini, M., et al. Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow. Stem Cells Dev. 18 (6), 857-866 (2009).
- Trombi, L., et al. Selective culture of mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 18 (8), 1227-1234 (2009).
- Trombi, L., et al. Human autologous plasma-derived clot as a biological scaffold for mesenchymal stem cells in treatment of orthopedic healing. J. Orthop. Res. 26 (2), 176-183 (2008).
- Giannotti, S., et al. Use of autologous human mesenchymal stromal cell/fibrin clot constructs in upper limb non-unions: long term assessment. PlosOne. 8 (8), 73893 (2013).
- Castano-Izquierdo, H., et al. Pre-culture period of mesenchymal stem cells in osteogenic media influences their in vivo bone forming potential. J. Biomed. Mater. Res. A. 82 (1), 129-138 (2007).
- Malkani, A. L., Fitzgerald, R. H., Kaufer, H. Orthopaedics. , Mosby. St. Louis, MO. Chapters 86-87 (2002).
- Lee, S. H., et al. ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. Int J Lab Hematol. 30 (5), 349-364 (2008).
- Bugno, A., et al. Application of the BacT/ALERTR 3D system for sterility testingof injectable products. Braz J Microbiol. 46 (3), 743-747 (2015).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cells in vitro. BMC Cell Biology. 7, 14 (2006).
