Summary
Het kweken van menselijke mesenchymale stromale cellen (hMSCs) met autologe serum, vermindert het risico op afwijzing door xenogene materiaal en andere negatieve effecten. Het staat ook voor het herstel van een subset van mesodermale voorlopercellen, die een frisse hMSCs kan leveren. Inbedding hMSCs in een autoloog fibrinestolsel maakt een eenvoudige bediening en effectieve chirurgische implantatie.
Abstract
Menselijke mesenchymale stromacellen (hMSCs) in vitro worden gekweekt met verschillende media. Beperkingen op het gebruik ervan in klinische settings, echter vooral afhangen van potentieel biologisch en ontsteking risico's die wordt uitgeoefend door xenogene voedingsstoffen voor hun cultuur. Menselijke derivaten of recombinante materialen zijn de eerste keuze kandidaten om deze reacties te verminderen. Daarom cultuur supplementen en materialen van autologe herkomst vertegenwoordigen de beste voedingsstoffen en de veiligste producten.
Hier beschrijven we een nieuw protocol voor de isolatie en kweek van beenmerg hMSCs in autologe omstandigheden - namelijk patiënt afgeleid serum als een supplement voor het kweekmedium en fibrine als een matrix voor hMSC toediening. Inderdaad zouden hMSC / fibrinestolsel constructen zeer nuttig voor verschillende klinische toepassingen. In het bijzonder richten we ons op het gebruik ervan in de orthopedische chirurgie, waar de fibrinestolsel afgeleid van eigen bloed van de donor toegestaaneffectieve cel levering en voedingsstoffen / afval uitwisselingen. Om te zorgen voor een optimale veiligheid, is het van het grootste belang om de risico's van hMSC transformatie en weefsel wildgroei te voorkomen. Daarom is de aanpak beschreven in dit document geeft ook een minimaal ex vivo hMSC expansie naar cel senescentie en morfologische veranderingen, en korte termijn osteo-differentiatie te verminderen vóór implantatie osteogene lineage specificatie induceren, waardoor het risico van latere ongecontroleerde afnemende proliferatie.
Introduction
Menselijke mesenchymale stromacellen (hMSCs) vormen een van de beste bronnen van cellen voor gebruik in weefselmanipulatie voor het bevorderen van osteogenese 1,2. Ze zijn gemakkelijk geïsoleerd uit het beenmerg en andere volwassen weefsels en een automatische typische oppervlak markers zoals CD90, CD105, CD73 1. Bovendien kunnen ze differentiëren in verschillende celtypes, zoals osteoblasten, chondrocyten en adipocyten 3. Hun therapeutische effecten worden toegeschreven aan hun regeneratieve en trofische eigenschappen 4. hMSCs kunnen worden gebruikt in orthopedische chirurgie, en in andere regeneratieve klinische toepassingen. Ze worden bij voorkeur gecombineerd met steigers, het klinische resultaat 5 verbeteren.
In vergelijking met andere materialen, de fibrine gel toont interessante eigenschappen zoals hechting, resorptie en efficiënte transport van voedingsstoffen, waardoor het zeer nuttig zijn voor allerlei toepassingen van weefselmanipulatie 6,7 maken.
Bij onze werkwijze, fibrine gel, verkregen uit bloed van de patiënt en autoloog serum, in vitro hMSCs kweek werden gebruikt als een mogelijke therapeutische oplossing in de orthopedie 8.
Voor klinische doeleinden worden hMSCs meestal toegediend via twee procedures: (i) het "eenstaps" procedure (dat wil zeggen, minimale manipulatie), waarbij de automatische transplantatie van beenmerg maakt het gehele of geconcentreerd (bijvoorbeeld, mononucleaire cellen), tijdens de operatie; en (ii) de "tweestaps" procedure (dwz uitgebreide manipulatie), die is gebaseerd op de ex vivo expansie van hMSCs om hun rendement te verhogen voor implantatie en vereist GMP faciliteiten 9. Interessant kweken van cellen met humaan volwassen serum in plaats van runderkalfserum maakt de terugwinning, met hMSCs van een subset van cellen (1-10% in mononucleaire kweken) genoemd mesodermale progenitorcellen (MPL), kunnen in vitro differentiatie in verse hMSCs 10,11. Aldus kan hMPCs een belangrijke rol in het regeneratieve proces speelt vergelijking met alleen 12,13 hMSCs. Tot slot, op korte termijn osteo-inductie duwt hMSCs om hun differentiatie in de osteogene lineage te starten zonder verlies van hun proliferatieve potentieel en de levensvatbaarheid 12. Deze resultaten bevestigen eerdere studies die hebben gerapporteerd verbeterde in vivo botvorming door hMSCs, gevolgd door een voorkweek in osteogene medium 14. Bovendien kan een autoloog plasma stolsel als matrix voor cel levering gemakkelijk worden gemanipuleerd door de chirurg en gevormd tot de vorm van het bot holte 13 past.
therefore deze werkwijze kunnen zeer nuttig zijn voor de onderzoekers en clinici die tot doel hebben de hMSC-gebaseerde therapie vertalen van de bank om het bed in orthopedische toepassingen.
Protocol
Het huidige protocol is ontwikkeld in overeenstemming met de Verklaring van de World Medical Association van Helsinki met betrekking tot de ethische gedrag van wetenschappelijk onderzoek met mensen. Het werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana.
NOTITIE:
Beenmerg werd verkregen van patiënten die een routinematige totale heupprothese chirurgie (volgens stap 1.1) 15; plasma voor de bereiding stolsel werd verkregen uit autoloog perifeer bloed 13; autoloog serum, als supplement voor het kweekmedium werd verzameld van een autoloog volbloed aferese. Alle patiënten kregen gedetailleerde informatie over de procedure en een schriftelijke toestemming formulier ondertekend.
1. Het verzamelen van de Bone Marrow Sample
- Verzamel beenmerg van de femorale medullaire kanaal na een totale heupprothese chirurgie (voor onderzoek studies). Kort samengevat, tijdens de chirurgische voorbereiding van het medullaire kanaal naar hOuse de prothetische stam, laat het merg bloed dat overloopt (ongeveer 10 - 15 ml, afhankelijk van de prothesemaat) 15.
OF - Verzamel beenmergaspiraat uit het bekken onder plaatselijke verdoving, volgende standaard hematologische procedure ongeveer 20 - 30 d van tevoren (voor klinische toepassingen) 16.
OPMERKING: In beide gevallen gehepariniseerde spuiten (om stolselvorming te voorkomen) moet worden gebruikt voor het beenmerg herstel.
2. Voorbereiding van de autologe Plasma
- Verzamel 20 ml perifeer bloed van de patiënt in vacuüm bloedafname buizen met K3 EDTA (5,4 mg in 3 ml buisjes) en gecentrifugeerd bij 2400 xg gedurende 15 min.
- Zuig het plasma component in een 15 ml buis en invriezen bij -20 ° C tot gebruik.
3. Bereiding van het autoloog serum
- Breng de eenheid van plasma in een transfer zak met behulp van een piek. Koppel de gevulde zak door lassen en Weigh de zak om het volume plasma (figuur 1A) berekenen.
- Coaguleren autoloog plasma door injectie van calciumgluconaat 100 mg / ml bij 10% w / v door de poort (Afbeelding 1B). Na het mengen van de zak, plaats deze op 4 ° CO / N zonder schudden om stolselvorming te vergemakkelijken.
- Centrifugeer de zak bij 4900 xg gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Neem de centrifuge emmer uit de centrifuge en verwijder voorzichtig de zak (volg de richtlijnen van de fabrikant voor de bereiding van bloedplaatjes lysaat) (figuur 1C).
- Isoleer het stolsel net boven de klem filtratie te vergemakkelijken. Sluit de filtratieset de overdracht zak die een piek geplaatst in de uitlaatopening van de filtratie kit.
- Hang de zak en open de blauwe klem om de serum stroom door de zwaartekracht te laten. Oefen geen druk op de filter om de overdracht van fibrine in de zak te voorkomen. Na filtratie, sluit de slang en verwijder de zak (volg de fabriTurer's richtlijnen voor de bereiding van bloedplaatjes lysaat).
- Sluit een speciale lijn naar de laatste zak en de overdracht serum in 50 ml buizen onder een laminaire stroming bankje voor microbiële besmetting te voorkomen.
- Neem een monster met een spuit aan het ontbreken van fibrinogeen testen en voer een steriliteitstest voor aërobe en anaërobe bacteriële kweken 17. Label de buizen op de juiste wijze en vries ze op - 20 ° C tot gebruik.
4. Voorbereiding van de Expansion Medium
- Bereid 500 ml compleet medium proliferatie. Om Dulbecco's Modified Eagle Medium - Lage glucose (DMEM-LG), voeg 10% autoloog serum (verkregen zoals beschreven in paragraaf 3), 2 mM glutamine, 1% antibiotica-oplossing en 1% antimycotische oplossing. Steriel-filter de complete proliferatie medium.
5. Isolatie van hMSCs uit het beenmerg
- Breng het monster beenmerg (5-10 ml) van de spuit in een 50 ml conische tuen verdunnen met steriele zoutoplossing (verhouding 1: 4). Vortex de 50 ml buis gedurende 30 s op de celgroepen splitsen.
- Warm de dichtheidsgradiënt (dichtheid 1,077 g / l; zie tabel of Materials) tot kamertemperatuur vóór gebruik en laag het verdunde beenmerg voorzichtig (ter voorkoming van vermenging beide lagen) op de dichtheidsgradiënt door toevoeging van 20 mL van het monster 15 ml dichtheid gradiënt per 50 ml buis (figuur 2A).
- Centrifugeer bij 400 xg zonder rem bij 25 ° C gedurende 30 minuten, verzamel de mononucleaire fractie aan het vloeistof-vloeistof-grensvlak en overgebracht naar een nieuwe buis van 50 ml met een steriele 5 ml pipet.
- Was de verzamelde mononucleaire fractie tweemaal met compleet medium proliferatie en centrifugeer de buizen bij 400 xg gedurende 10 min bij 25 ° C naar cel pellets te verkrijgen.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer voorzichtig elke cel pellet in 5 ml compleet medium proliferatie. Verdun met een 1: 100 verhouding voor celtelling.
- Tel de cellen met een hemocytometer na een 1: 1 verdunning met Trypan Blue kleuring voor levensvatbaarheid van de cellen te evalueren.
6. Cultuur van hMSCs in aanwezigheid van autoloog serum
- Vul twee of meer 75 cm2 weefselkweek (TC) flessen met 15 ml vers compleet medium proliferatie en overbrengen naar een cel incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 tot gebruik.
- zaad 0,3 - 0,5 x 10 6 cellen / cm2 (37,5 x 10 6 cellen / 15 ml vers medium volledige proliferatie) en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 48 uur.
- Tegelijkertijd zaad 1 x 10 6 cellen in een 25 cm2 kolf met TC 5 ml vers compleet medium proliferatie voor het kiemgetal - fibroblast (CFU-F) test. Cultuur voor 2 weken (wordt vervolgd in hoofdstuk 12).
- Gooi de middellange en voorzichtig te wassen de kolven van stap 6.2 met volledig proliferatie middellange tot remove hechtende cellen en puin. Voeg vers medium aan de kolven en een week vervang de helft van het twee keer, tot 70 - 80% samenvloeiing (primaire cultuur, Passage 0 (P0)) (figuur 2B).
- Herstel de cellen door een specifiek recombinant dier vrij protease (zie Tabel materiaal, gebruik 3 ml van de oplossing per kolf zoals aanbevolen door de fabrikant) en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 10 minuten. Voeg 6 ml van complete proliferatie medium per fles en het verzamelen in een 50 ml buis. Herhaal stap 5.6.
LET OP: LET OP: Het gebruik van dit protease in plaats van trypsine maakt het herstel van een aantal mesodermale voorouders Cells (MTR) aanwezig in de cultuur, die wordt trypsine resistent. - Voor verdere uitbreiding replate de celsuspensie bij 2000 - 3000 cellen / cm2 in nieuwe 75 cm 2 TC kolven (P1) (figuur 2C).
- Gebruik aliquots van cellen om de differentiatie van MSCs mogelijkheden evaluerenaan osteogene, chondrogene adipogene en lijnen. Voer differentiatie assays volgende aanbevelingen van de fabrikant (figuur 2D).
OPMERKING: verschillende kleuringen kan worden gebruikt om differentiatie multilineage beoordelen.
7. Bereiding van een osteogeen middelmatig Pharmaceutical Supplementen
- Verdund ascorbinezuuroplossing (Oplossing 1A. Ascorbinezuur 200 mg / ml (zie tabel of Materials) 01:10 DMEM-LG, een 20 mg / ml (oplossing 1B verkrijgen werkoplossing) De hoeveelheden van oplossingen 1A en 1B bij -20 ° C tot gebruik.
- Resuspendeer 1 g hydrocortison in 10 ml steriel water (oplossing 2A: hydrocortison 100 mg / ml (zie tabel of Materials) Verdunde Oplossing 2A 1. 1000 met DMEM-LG een 100 ug / ml (oplossing 2B verkrijgen, werken oplossing). De hoeveelheden van oplossingen 2A en 2B bij -20 ° C tot gebruik.
- Bij het gebruik van pnog repareren osteogene vers medium als volgt: voeg DMEM-LG met 10% autoloog serum, 50 ug / ml ascorbinezuur en 0,4 ug / ml hydrocortison. Steriel filter osteogene medium.
8. osteogeen Pre-inductie en herstel van hMSCs
- Volledig te verwijderen van de proliferatie medium en voeg osteogene medium 96 uur voor het oogsten cel (dat wil zeggen, 80 - is 90% samenvloeiing doorgaans bereikt in 7 d). Zorg voor een extra osteogene medium verandering 24 uur voordat cel oogsten.
- Maak de cellen zoals beschreven in stap 6.5 en voorzichtig resuspendeer de pellet toevoegen van 2 ml compleet medium proliferatie in een 50 ml buis.
OPMERKING: Cellevensvatbaarheid worden verminderd (ongeveer 10%) als gevolg van osteo-inductie. Cellulaire aggregaten worden waargenomen. - Na tellen, was de cellen met volledige proliferatie medium en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer de pellet voorzichtig 1 - 2 x 10 6 levensvatbare cellen / 2ml autoloog plasma (zie hoofdstuk 2) per 50 ml buis.
9. Voorbereiding van de hMSC / fibrinestolsel constructen
- Voeg 150 ul van calciumgluconaat op 100 mg / ml tot 50 ml per buis verkregen bij stap 8.3. en resuspendeer de cellen onder zachtjes schudden.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 15-30 min bij hMSC / fibrinestolsel constructen (figuur 3A) te verkrijgen. Bereid een fibrinestolsel construct zonder cellen worden gebruikt als een controle.
OPMERKING: Belangrijk: Het verdient aanbeveling om dit besturingselement stolsel te bereiden ten minste 2 uur vóór de cellevensvatbaarheid assay als het duurt 30 min of meer te verknopen.
10. levensvatbaarheid van de cellen Assay
- Verwijder de vloeistof uit de 50 ml buizen en voeg 1 mL volledig medium dat proliferatie 10% v / v cellevensvatbaarheid reagens (AB, zie tabel of Materials), volgens de richtlijnen van de fabrikant.
- Incubate the buizen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 3 uur. Meet de absorptie bij 570 nm met een referentie golflengte van 600 nm (AB op tijdstip 0; t0).
- Verwijder het supernatant en voeg 2 ml vers compleet proliferatie medium. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 O / N. De volgende dag (AB op het moment 24 uur, T24), herhaalt u stap 10,1-10,3 (Figuur 3B).
11. Histologische evaluatie van de levensvatbaarheid van de cellen en Calcium Deposition binnen fibrinestolsel constructen
- Bevestig de hMSC / fibrinestolsel constructen in 4% w / v neutraal gebufferde formaline O / N bij 4 ° C. Wassen 4x in D-PBS gedurende 15 min en opslaan in 70% ethanol.
- Dehydrateren de monsters bij 40 ° C in een reeks van gegradeerde ethanol: 80% na 30 min, 95% tweemaal gedurende 45 min en 3x 100% gedurende 1 uur. Verduidelijken tweemaal in xyleen gedurende 45 minuten bij 40 ° C.
- Spoel de monsters in vloeibare paraffine bij 60 ° C gedurende 2 uur en insluiten. Snijd de paraffine blok met een microtoom en monteer tHij secties (5 urn) op glasplaatjes.
- Vlekken op de paraffine ontdaan secties met behulp van de standaard hematoxyline en eosine (H & E) methode (Figuur 3C).
- Voer von Kossa kleuring door behandeling van de secties met 1% zilvernitraat gedurende 15 min, 0,5% Pyrogallol gedurende 2 min, en 5% natriumthiosulfaat gedurende 2 min. Tegenkleuring de secties met 0,1% kernechtrood verdund in een oplossing die 5 g aluminiumsulfaat gedurende 5 min en spoelen in leidingwater gedurende 5 minuten. Monteer de secties met een montage-agent.
- Evalueer de minerale afzetting als zwarte korrels onder lichte microscoop (400X vergroting) (Figuur 3D).
12. CFU-F Assay
- Was de 25 cm 2 kolf (uit stap 6.3.) Met D-PBS. Vlekken op met behulp van de standaard May-Grunwald / Giemsa-methode. Visueel kwantificeren hMSC aantal door het scoren van individuele kolonies (figuur 4) onder een lichtmicroscoop.
LET OP: Alshet beenmerg wordt genomen in stap 1,2. en de onderdelen 2-9 worden uitgevoerd in Good Manufacturing Practice (GMP) van de nodige wettelijke goedkeuring, kan de hMSC / fibrinestolsel constructen worden geïmplanteerd voor orthopedische toepassingen.
Representative Results
Bereiding van autoloog serum
Plasmacoagulatie, uitgevoerd door het toevoegen van calcium gluconaat de overdrachtszak, kan de terugwinning van autoloog serum in grote hoeveelheden, zoals vereist voor de hMSC cultuur. Inderdaad, met deze techniek is het mogelijk om tot wel 200 ml serum (figuur 1).
HMSC isolement, cultuur en differentiatie met behulp van autoloog serum
Beenmerg mononucleaire cellen geïsoleerd met behulp van een dichtheidsgradiënt, die tot een tussenring laag (Figuur 2A) geeft. Door uitplating deze cellen en het verwijderen van de hechtende die met wassen, is het mogelijk om hMSCs (figuur 2B) te isoleren. Onder autologe kweekomstandigheden, een subset van cellen, de zogenaamde MTR, worden gedetecteerd op P0 en in procenten omhoog to 10%, afhankelijk van de variabiliteit (figuur 2B). MPL nog steeds aanwezig is na opnieuw platen (dwz P1) wanneer de protease wordt gebruikt voor cellulaire passage (figuur 2C). hMSCs geïsoleerd en gekweekt in een autologe setting behouden hun vermogen om te differentiëren tot de drie bekende mesodermale lineages (osteogeen, adipogene en chondrogene). De differentiatie assays werden uitgevoerd om de hMSC populatie identiteit met die verkregen onder toepassing van standaard (autologe) kweekomstandigheden vergelijken. Als functionaliteit assays voor dit protocol, von Kossa kleuring, osmiumtetroxide kleuring en Alcian Blue kleuring bij pH 1 in de plaats van de door de fabrikant differentiatie media gesuggereerd werden gekozen (zie tabel of Materials) (figuur 2D).
Voorbereiding, levensvatbaarheid en histologische karakterisering van MSC / fibrinestolsel constructen
(Figuur 3A). Binnen deze plasmastolsels de hMSCs levensvatbaar, zoals blijkt uit de kleurverandering van de cellevensvatbaarheid kleurstof t24 van blauw (controle zonder cellen) naar roze (cellularized stolsel) (Figuur 3B). Levensvatbaarheid van de cellen in het stolsel wordt bevestigd door H & E kleuring, met een goed bewaard gebleven celmorfologie (figuur 3C). Bovendien is een minimale osteoinductie net voor de tweede celoogst leidt voorlopige kalkafzetting door gestimuleerde hMSCs (Figuur 3D).
Kiemgetal
De aanwezigheid van hMSC kolonies na 2 weken in kweek blijkt uit de CFU-F-test (Figuur 4).
s = "jove_step" fo: keep-together.within-page = "1"> Toepassing van MSC / fibrinestolsel te bouwen in bot non-union
HMSC / fibrinestolsel constructen verkregen volgens deze werkwijze (stap 1,1) werden met succes toegepast op ernstige bovenste ledematen nonunions behandelen 8 compassionate gevallen 13. Op lange termijn (maximaal 7,6 maanden) evaluatie bevestigde succesvolle klinische en functionele resultaten voor alle patiënten, zonder bewijs van weefsel overgroei of tumorvorming.
Figuur 1. Bereiding van autoloog serum.
(A) De eenheid plasma wordt overgebracht in een overbrengingszak met de piek; (B) Het plasma wordt gecoaguleerd door injectie calciumgluconaat via de poortaansluiting; (C) Een bloed-zak centrifuge wordt gebruikt om het serum te scheiden./files/ftp_upload/54845/54845fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. hMSC Isolatie, Cultuur en differentiatie met behulp van autoloog serum.
(A) De mononucleaire cellaag (in de blauwe lijn venster) verkregen na beenmerg centrifugeren met een dichtheidsgradiënt; (B) De kweek cel zoals weergegeven in P1; (C) Cell cultuur zoals het destijds P0 (primaire kweek) verschijnt; (B - C) Pijlen tonen aanwezigheid van mediterrane partnerlanden in het MSC cultuur. Schaal bar is 100 micrometer; (D) histochemische resultaten van multilineage differentiatie assays. Osteogene differentiatie wordt beoordeeld op basis von Kossa kleuring voor minerale matrix afzetting in zwart, adipogene differentiatie wordt getoond door de aanwezigheid van vet vacuolen, gekleurd in het zwart door osmium tetroxide en chondrogene differentiatie wordt weergegeven door de aanwezigheid van gesulfateerde glycosaminoglycanen, die in cyaan worden gekleurd door Alcian Blue kleuring bij pH 1. Schaalbalk is 50 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Voorbereiding, levensvatbaarheid en histologische karakterisering van MSC / fibrinestolsel constructen.
(A) De hMSC / fibrinestolsel construct zoals deze na het vernetten; (B) Resultaten van AB assay: de MSC levensvatbaar binnen fibrinestolsel, zoals blijkt uit de kleurverandering van de cellevensvatbaarheid kleurstof (T24), van blauw (controle zonder cellen, rechts) naar roze (cellularized stolsel op links). (C - D) histochemische resultaten van hMSC / fibrinestolsel constructen. Schaal bar is50 urn. (C) met hematoxyline en eosine kleuring tonen levensvatbare cellen ingebed in de fibrinematrix; (D) Mineral matrix afzetting gekleurd in het zwart door von Kossa kleuring, die een eerste osteogenesis bevestigt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. CFU-F Assay.
Beeld van een kolf gekweekt met hMSCs gekleurd met May-Grunwald / Giemsa-methode. De ingezoomde gebied is een lichte vergroting toont de morfologie van een hMSC kolonie. Schaal bar is 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Toepassing van hMSC / fibrinestolsel Construct in Bone nonunion.
(A) X-ray van de bovenste ledematen van een patiënt getroffen door pseudartrose; (B) hMSC / fibrinestolsel construct net voor de implantatie; (C) chirurgische toepassing van de hMSC / fibrinestolsel construct; (D) X-ray van de bovenste ledematen van dezelfde patiënt na 5 jaar. Dit cijfer wordt gepubliceerd van Giannotti S. et al. met minimale aanpassingen 13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De kritische stappen van dit protocol betreffen het gebruik van menselijke volwassen serum en protease, die het mogelijk maken om een BIOSAFE hMSC therapie te verkrijgen. Vooral de volwassen mens serum maakt isolatie en onderhoud, terwijl protease zorgt de oogst van MTR. Deze onrijpe cellen aanwezig in het beenmerg die aanleiding kunnen geven tot nieuwe hMSCs, waardoor een reservoir van levensvatbare hMSCs langs de kweekperiode. Niet alle MPL worden verzameld, omdat het verhogen van de belichtingstijd voor de protease activiteit schadelijk voor hMSC levensvatbaarheid. Daarom werd een 10 min incubatie protease gekozen als optimaal compromis tussen het herstel van MTR en levensvatbaarheid van hMSCs. Een andere belangrijke stap is osteodifferentiation tijd. Inderdaad, een uitgebreide in vitro osteodifferentiation aanzienlijk zou verminderen levensvatbaarheid van de cellen, waardoor de uiteindelijke botvorming in vivo beïnvloeden. De laatste cruciale stap bestaat uit het gebruikmaken van een autologe bioresorbeerbaar schavot which wordt verkregen door het inbedden van de cellen (hMSCs en MPL) in een fibrine gel van plasma stolt.
Een belangrijke stap om de opbrengst van MPL te verbeteren is om mononucleaire cellen zaad bij hogere concentraties. Afereseprocedures gebruikt om plasma te verkrijgen en behandelen met calciumgluconaat maakt het mogelijk autoloog serum verwezenlijken in grote hoeveelheden. Het is waargenomen dat humaan serum als een mediumsupplement vergelijkbaar met foetaal runderserum (FBS) in hMSC culturen. Echter, in onze ervaring, een compleet medium aangevuld met FBS draagt bij aan een snellere veroudering dan volwassen mens serum. Een belangrijke stap is dat het toedienen van een minimale osteoinductie om hMSCs. Inderdaad, deze behandeling leidt de cellen eenvoudig te differentiëren tot de osteogene lineage, dat is handig verdere celtransformatie in vivo voorkomen. Om een goede levensvatbaarheid van minimaal osteoinduced hMSCs te handhaven, is het raadzaam om voorzichtig de in stappen 6.5 beschreven aanbevelingen op te volgen. eend 8.2., onder andere bij hantering, centrifugeren en middelgrote bedragen die moeten worden toegevoegd. Als een aferese procedure niet beschikbaar is, is het toch mogelijk dit protocol worden uitgevoerd vóór het uitvoeren van meerdere bloedafnames voor de patiënt of, subsidiair, door de aankoop van samengevoegde sera AB. Uiteraard, om dit protocol van de bank naar bed te brengen, is het verplicht om GMP celfabrieken of equivalenten beschikbaar.
Beperkingen betreffende de toepassing van deze techniek betreffen de bloedarmoede, hematologische-oncologie en orthopedische patiënten die lijden aan osteomyelitis., Tekening grote hoeveelheden bloed van anemische patiënten, moeten worden vermeden. Oncologische patiënten is de kwaliteit van de celmonsters die door chemotherapie behandelingen, terwijl bij osteomyelitis patiënten de infectie kan het eindresultaat beïnvloeden. In alle gevallen waarin de autoloog serum onvoldoende of ongeschikte, samengevoegde mannelijke AB sera vormen een goed alternatief.
Met behulp van mobiele / fibrine clot constructen voor eventuele klinische toepassingen is cruciaal voor een volledig autologe celtherapie, die gemakkelijk te hanteren en matrijs tijdens de operatie kan staan, zodat uitstekende resultaten op het bot non-unions 13 behandelen vrijgeven. Voor klinische doeleinden worden hMSCs meestal toegediend via twee procedures: minimaal manipulatie en uitgebreide manipulatie 9. Om de problemen in verband met een uitgebreide ex vivo kweken zoals afwijkingen in celmorfologie en maat 18 te overwinnen, hebben we een kort ex vivo celexpansie en osteo-differentiatie (slechts 4 d).
De xeno-vrije protocol beschreven in dit document, samen met de korte celexpansie en osteodifferentiation keer aangetoond relevant klinieken om snel botaanmaak in vivo te verkrijgen, zonder bewijs weefsel overgroei en transformatie, hetgeen bevestigt de werkzaamheid en lange -term veiligheid botherstel (figuur 5) 13.
De in dit rapport gepresenteerde methode is gericht op het aantonen van de werkzaamheid en veiligheid van hMSC in vitro expansie in autologe voorwaarden voor eventueel gebruik bij orthopedische chirurgie. Dit protocol maakt gebruik hMSCs geïsoleerd uit beenmerg en gekweekt in een medium aangevuld met autoloog serum en ingebed in autologe fibrine stolsel, waardoor een volledig autologe celtherapie. De tweevoudige osteogene inductie, net voor de tweede onthechting, verbetert hMSC vermogen om te differentiëren in osteoblasten. Daardoor is deze techniek bijzonder geschikt voor toepassingen in botdefecten, aangezien het niet beperkt tot pseudartrose. Mogelijke toekomstige toepassingen kunnen talus cyste en botverlies het management te betrekken.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triple Select (1x) | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 12563-029 | cell culture |
| Trypan blue stain | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
| DMEM-LG, no glutamine, no phenol red | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 11880-028 | cell culture |
| Glutamax (100x) | Gibco, Life Technologies | 35050038 | cell culture |
| Penicillin/Streptomycin sol. | Gibco, Life Technologies | 15140122 | cell culture |
| Alamar Blue (AB) | Gibco, Life Technologies | DAL1025 | proliferation/viability assay |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-14440-02 | cell culture |
| D-PBS | Gibco, Life Technologies | 14190-094 | cell culture |
| StemMACS AdipoDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-677 | cell culture |
| StemMACS ChondroDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-679 | cell culture |
| hMSC Osteogenicdiff BulletKit | Euroclone | LOPT3002 | cell culture |
| Vitamin C (ascorbic acid) | Bayer | ATC Code: A11GA01 | Pharmaceutical grade drug |
| Flebocortid Richter (hydrocortisone) | Aventis Pharma | ATC Code: H02AB09 | Pharmaceutical grade drug |
| Victor X3, reader | PerkinElmer | 2030 multilabel reader | proliferation/viability assay |
| Silver nitrate | Sigma Aldrich | 209139 | histological assay |
| Pyrogallol | Sigma Aldrich | 16040 | histological assay |
| Sodium Thiosulphate | Sigma Aldrich | S8503 | histological assay |
| Histoplast LP | Thermo Scientific | 8332 | histological assay |
| Methanol | Sigma Aldrich | 32213 | histological assay |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | histological assay |
| Nuclear fast red | Sigma Aldrich | 60700 | histological assay |
| Formalin | Bio-optica | 05-K01009-X40 | histological assay |
| Eosin B | Sigma Aldrich | 45260 | histological assay |
| DPX | Sigma Aldrich | 6522 | histological assay |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich | H3136 | histological assay |
| Aluminium Sulphate | Sigma Aldrich | 202614 | histological assay |
| Xylol | Sigma Aldrich | 534056 | histological assay |
| Microtome | Leika | histological assay | |
| May Grunwald | Sigma Aldrich | MG1L-1L | histological assay |
| Giemsa | Sigma Aldrich | 32884-250ML | histological assay |
| Transfer bag | Biomérieux | BC0300031 | cell culture |
| Filtration kit | Macopharma | BC0800010 | cell culture |
| Calcium Gluconate | Galenica Senese | Pharmaceutical grade drug | |
| Bact Alert | Biomérieux | 259790 anaerobic | microbiological assay |
| Bact Alert | Biomérieux | 259789 aerobic | microbiological assay |
| Steryle Luer-Lok Syringe 50 mL | BD Plastipak | 300865 | cell processing |
| Heraeus Cryofuge 6000i | Thermo Scientific | blood bag centrifuging | |
| SL16R Centrifuge | Thermo Scientific | blood tube centrifuging |
References
- Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7, 393-395 (2005).
- Kassem, M., Abdallah, B. M. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: biological characteristics and potential role in therapy of degenerative diseases. Cell Tissue Res. 331, 157-163 (2008).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Bonfield, T. L., Nolan Koloze, M. T., Lennon, D. P., Caplan, A. I. Defining human mesenchymal stem cells efficacy in vivo. J Inflamm. (Lond). 25 (7), 51 (2010).
- Pneumaticos, S. G., Triantafyllopoulos, G. K., Chatziioannou, S., Basdra, E. K., Papavassiliou, A. G. Biomolecular strategies of bone augmentation in spinal surgery. Trends Mol. Med. 17 (4), 215-222 (2011).
- Amhed, T. A. E., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: A versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Engineering Part B. 14 (2), 199-215 (2008).
- Silbertein, L. E., Williams, L. J., Huglett, M. A., Magee, D. A., Weisman, R. A. An autologous fibrinogen-based adhesive for use in oncologic surgery. Transfusion. 28 (4), 319-321 (1988).
- Jockenhoevel, S., et al. Fibrin gel advantages of a new scaffold in cardiovascular tissue engineering. Eur. J. Cardiothorac Surg. 19 (4), 424-430 (2001).
- Veronesi, F., et al. Clinical use of bone marrow, bone marrow concentrate, and expanded bone marrow mesenchymal stem cells in cartilage disease. Stem Cells Dev. 22 (2), 181-192 (2013).
- Petrini, M., et al. Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow. Stem Cells Dev. 18 (6), 857-866 (2009).
- Trombi, L., et al. Selective culture of mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 18 (8), 1227-1234 (2009).
- Trombi, L., et al. Human autologous plasma-derived clot as a biological scaffold for mesenchymal stem cells in treatment of orthopedic healing. J. Orthop. Res. 26 (2), 176-183 (2008).
- Giannotti, S., et al. Use of autologous human mesenchymal stromal cell/fibrin clot constructs in upper limb non-unions: long term assessment. PlosOne. 8 (8), 73893 (2013).
- Castano-Izquierdo, H., et al. Pre-culture period of mesenchymal stem cells in osteogenic media influences their in vivo bone forming potential. J. Biomed. Mater. Res. A. 82 (1), 129-138 (2007).
- Malkani, A. L., Fitzgerald, R. H., Kaufer, H. Orthopaedics. , Mosby. St. Louis, MO. Chapters 86-87 (2002).
- Lee, S. H., et al. ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. Int J Lab Hematol. 30 (5), 349-364 (2008).
- Bugno, A., et al. Application of the BacT/ALERTR 3D system for sterility testingof injectable products. Braz J Microbiol. 46 (3), 743-747 (2015).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cells in vitro. BMC Cell Biology. 7, 14 (2006).
