Summary
otolog serum ile insan Mezenkimal Stromal Hücreleri (hMSCs) Kültürleme, ksenojenik malzeme ve diğer olumsuz etkileri ile reddi riskini azaltır. Aynı zamanda, taze hMSCs sağlayabilir mezodermal progenitörlerin bir alt kümesi, bir geri kazanımını sağlar. otolog fibrin pıhtısı içinde hMSCs gömülmesi kolay kullanım ve etkin bir cerrahi implantasyon sağlar.
Abstract
Insan mezenkimal stromal hücreler (hMSCs) farklı bir ortam ile in vitro olarak kültürlenir. klinik ortamlarda kullanımları Sınırları Ancak, esas olarak kendi kültürü için ksenojenik besin tarafından uygulanan potansiyel biyolojik tehlike ve inflamasyon riskleri bağlıdır. İnsan türevleri veya rekombinant malzemeler bu tepkileri azaltmak için ilk tercihi adaylarıdır. Bu nedenle, kültür takviyeleri ve otolog kökenli malzemeler en iyi besin ve güvenli ürünlerini temsil eder.
Burada, otolog koşullarda izolasyonu ve kemik iliği hMSCs kültür için yeni bir protokol açıklar - yani, bir hastada elde edilen serum hMSC uygulama için bir iskele olarak kültür ortamı ve fibrin için bir ek olarak. Nitekim, hMSC / fibrin pıhtı yapıları çeşitli klinik uygulamalar için son derece yararlı olabilir. Özellikle, donörün kendi kanından elde edilen fibrin pıhtı izin ortopedik cerrahi kullanımları, odaklanmakEtkili hücre teslimat ve besin / atık alışverişi. Optimum güvenlik koşullarını sağlamak için, hMSC dönüşüm ve doku üremesine risklerini önlemek için büyük önem taşımaktadır. Bu nedenlerden dolayı, bu makalede açıklanan yaklaşım ayrıca, böylece daha sonraki kontrolsüz riskini azaltarak, implantasyon öncesi hücre yaşlanması ve morfolojik değişiklikler ve kısa süreli osteo-farklılaşma azaltmak için osteojenik soy özellikleri ikna etmek için, minimal ex vivo hMSC genişleme gösterir çoğalma.
Introduction
İnsan mezenkimal Stromal hücreler (hMSCs) osteogenesisi 1,2 teşvik etmek için doku mühendisliğinde kullanım için en iyi cep kaynaklarından birini temsil etmektedir. Kolayca, kemik iliği ve diğer yetişkin dokulardan izole edilir ve örneğin CD90, CD105, CD73 1 tipik yüzey belirteçleri ifade edilir. Ayrıca, bu tür osteoblastlar, kondrositler ve adipositler 3 gibi çeşitli hücre tipleri, dönüşebilirler. Onların tedavi edici etkileri kendi rejeneratif ve trofik özellikleri 4 atfedilir. hMSCs diğer yenileme klinik uygulamalarda olduğu gibi, ortopedik cerrahide yaygın olarak kullanılabilir. Bunlar tercihen klinik sonuçlar 5 geliştirmek için iskeleler ile birleştirilir.
Diğer malzemelere kıyasla, fibrin jel gibi yapışma, rezorpsiyon ve doku mühendisliği uygulamaları 6,7 çeşitli son derece kullanışlı hale besinlerin verimli ulaşım gibi ilginç özellikler gösteriyor.
Hastanın kendi kanından elde edilen bir yöntem, fibrin jel, ve otolog serum, in vitro hMSCs kültürü için, ortopedik alanda 8 olası bir tedavi solüsyon olarak kullanıldı.
Klinik amaçlar için, hMSCs genellikle iki ana prosedürlerle uygulandı: (i) ya da bütün ya da (yani mononükleer hücreler) konsantre edildi, kemik iliği nakli, otomatik sağlayan "tek aşamalı" yöntemi (yani, en az manipülasyon), ameliyat sırasında, ve (ii) implantasyon öncesi kendi verimini arttırmak için hMSCs ex vivo genişlemesi dayanmaktadır "iki aşamalı" prosedürü (yani, geniş manipülasyon), ve G gerektirirMP tesisleri 9. Taze olarak in vitro farklılaşabilen, - (tek çekirdekli kültürlerinde% 10 1) olarak adlandırılan Mezodermal progenitör hücrelerinin (MPCs) İlginç bir şekilde, yerine buzağı serumu insan yetişkin serumu ile kültür hücreleri, hücrelerin bir alt kümesinin, bir araya hMSCs ile iyileşme sağlar hMSCs 10,11. Bu nedenle, hMPCs hMSCs başına 12,13 ile karşılaştırıldığında rejeneratif sürecinde önemli bir rol oynayabilir. Son olarak, kısa süreli osteo-indüksiyon potansiyeli kendi proliferatif kaybetme ve 12 canlılığı olmaksızın osteojenik soy içine farklılaşma başlatmak için hMSCs iter. Bu sonuçlar osteojenik ortamda 14 bir ön kültür izledi hMSCs tarafından in vivo kemik oluşumunda geliştirilmiş bildirdin önceki çalışmaları, onaylayın. Ayrıca, hücre dağıtımı için bir iskele olarak otolog plazma pıhtısı kolayca cerrah tarafından manipule ve kemik boşluğu 13 şekline uyacak şekilde kalıplanabilir.
therefore, bu yöntem ortopedik uygulamalarda hasta yatağına tezgah kendi hMSC bazlı tedavi çeviri amaçlayan bu araştırmacılar ve klinisyenler için son derece yararlı olabilir.
Protocol
Mevcut protokol araştırma içeren insanların etik davranış konusunda Helsinki Dünya Tabipler Birliği Bildirgesi uyarınca geliştirilmiştir. Bu Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana Etik Komitesi tarafından onaylandı.
NOT:
Kemik iliği rutin total kalça protezi ameliyatı geçiren hastalarda elde edildi 15 (1.1 adıma göre); Pıhtı hazırlanması için, plazma otolog periferik kan 13 elde edilmiştir; otolog serum, kültür ortamı için bir destek olarak, otolog tam kan aferez toplanmıştır. Tüm hastalar prosedür hakkında detaylı bilgi aldı ve bir yazılı onam formunu imzaladı.
Kemik İliği 1. Numunenin toplanması
- (Araştırma çalışmaları için) bir total kalça protezi ameliyatından sonra femur medüller kanal kemik iliği toplayın. h medüller kanal cerrahi hazırlama sırasında kısa bir süre,(- protez büyüklüğüne bağlı olarak 15 mL, yaklaşık 10) 15 protez kök ouse, taşması iliği kan toplamak.
VEYA - (Klinik uygulamalar için) önceden 30 d 16 - 20 hakkında standart hematolojik prosedürü izleyerek, lokal anestezi altında iliak kemik iliği aspirat toplayın.
NOT: şırıngalar heparinize Her iki durumda da (pıhtı oluşumunu önlemek için), kemik iliği kurtarma için kullanılmalıdır.
Otolog Plazma 2. Hazırlık
- 15 dakika için 2400 x g'de K3 EDTA içeren vakumlu kan toplama tüplerinde hasta (3 mL tüplerinde 5.4 mg) ve santrifüj periferik kan 20 mL toplayın.
- 15 ml bir tüp içinde, plazma bileşeni aspire ve kullanıma kadar -20 ° C'de dondurun.
Otolog Serum 3. hazırlanması
- Bir başak kullanarak bir transfer torbaya plazma ünitesi aktarın. kaynak ve Weig doldurulmuş torba ayırınh çanta plazma (Şekil 1A) hacmini hesaplamak için.
- Noktası konektörünün (Şekil 1B) ile a / h% 10 kalsiyum glukonat, 100 mg / ml enjekte otolog plazma koyulaştırınız. çanta karıştırıldıktan sonra, pıhtı oluşumunu kolaylaştırmak için sallayarak olmadan 4 ° CO / N de yerleştirin.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 4900 x g'de Poşeti Santrifüj. Santrifüj dışına santrifüj kova alın ve (Şekil 1C) (trombosit lizat hazırlanması için üreticinin yönergeleri izleyin) dikkatlice poşeti çıkarın.
- süzülmesini kolaylaştırmak için sadece kelepçe yukarıdaki pıhtıyı izole edin. filtrasyon kitinin çıkış portuna yerleştirilen bir başak kullanarak aktarma torbasına filtrasyon seti bağlayın.
- çanta asmak ve yerçekimi ile serum akışına izin mavi kelepçeyi açın. torbaya fibrin transferini önlemek için filtreye baskı uygulamayın. Süzüldükten sonra, tüp mühür ve Üretici izleyin (poşeti çıkarıntrombosit lizat hazırlanması için tavsiyelerine uyulmalıdır en yönergeler).
- mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için bir laminer akış tezgah altında 50 ml tüpler içine nihai çanta ve transfer serum özel bir hat bağlayın.
- Fibrinojen yokluğunu test etmek ve aerobik ve anaerobik bakteri kültürleri 17 için bir kısırlık testi gerçekleştirmek için bir şırınga ile bir örnek almak. uygun tüpler Etiket ve onları dondurmak - 20 ° C kadar kullanım.
Genişletme maddesi 4. hazırlanması
- Tam proliferasyon ortamında 500 mL hazırlayın. Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı - düşük glikoz (DMEM-LG), (bölüm 3'te tarif edildiği gibi elde edilmiştir),% 10 otolog serumu, 2 mM glutamin,% 1 antibiyotik solüsyon ve% 1 antimikotik solüsyon ilave edin. Steril filtre tam çoğalması ortamı.
Kemik İliği gelen hMSCs 5. İzolasyon
- 50 ml konik tu içine şırınga - (10 mL 5) kemik iliği örneği aktarmakolabilir ve steril tuzlu su ile seyreltilmiş (oran 1: 4). 30 s hücre kümeleri ayrıştırmak için 50 ml tüp Vortex.
- Yoğunluk 15 mL numune 20 ml ekleyerek yoğunluk gradyanı üzerinde (her iki katmanın karıştırma önlemek için), kullanılmadan önce oda sıcaklığına ve yavaşça seyreltildi kemik iliği katman, yoğunluğu gradyanı (Malzeme Tabloya bakınız yoğunluğu 1.077 g / L) Sıcak her bir 50 ml tüp (Şekil 2A) için gradyan.
- 30 dakika boyunca 25 ° C 'de fren yapmadan, 400 x g'de santrifüje, daha sonra sıvı-sıvı ara yüzeyindeki tek çekirdekli fraksiyonu toplamak ve 5 ml steril bir pipet kullanarak yeni bir 50 ml tüp aktarın.
- Tam proliferasyon ortam ile iki kez toplandı mononükleer fraksiyonu yıkanır ve hücre pelletleri elde etmek için 25 ° C'de 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj tüpleri.
- Süpernatant atılır ve yavaşça tam çoğalması ortamın 5 mL'si, her hücre pelletini. Hücre sayımı için 100: 1 oranında de seyreltilir.
- hücre canlılığı değerlendirmek Tripan mavi boyama ile 1 sıvı: 1 sonra hemasitometre kullanarak hücreleri sayın.
Otolog Serum Varlığında hMSCs 6. Kültür
- Taze tamamlanmış proliferasyon ortamında 15 mL, iki ya da daha çok 75 cm2 doku kültürü (TC) şişeler doldurun ve kullanıma kadar CO2 37 ° C'de bir hücre kültür inkübatörü aktarmak ve% 5.
- tohum 0.3 - 0.5 x 10 6 hücre / cm2 (37.5 x 10 6 hücre, taze tam çoğalma ortamı / 15 mL) ve 48 st için CO 2, 37 ° C'de inkübe ve% 5.
- Aynı zamanda, koloni oluşturucu birim taze tam çoğalması ortamın 5 mL'si ile 25 cm2 TC şişede tohumu 1 x 10 6 hücre - akciğer fibroblast (CFU-E) deneyi. 2 hafta Kültürü (bölüm 12 devam edilecek).
- orta atın ve yavaşça rem tam çoğalma ortamı ile adım 6.2 şişeler yıkayınnonadherent hücreleri ve enkaz ove. , Şişelere taze orta ekleyin ve bir haftada iki kez yarısını yerine 70 kadar -% 80 confluency (primer kültür, Passage 0 (P0)) (Şekil 2B).
- Ve 10 dakika boyunca CO2 37 ° C'de inkübe ve% 5, belirli bir yeniden birleştirici bir hayvan içermeyen proteaz kullanarak hücreleri kurtarma (üretici tarafından tavsiye edildiği gibi kap başına 3 mL kullanılan malzemeler ve tabloya bakınız). şişeye başına tam çoğalma ortamı 6 ml ekleyin ve bir 50 ml tüp içinde toplamak. Adımı tekrarlayın 5.6.
NOT: ÖNEMLİ: yerine tripsin bu proteaz kullanımı dirençli tripsin kültürün bulunan bazı Mezodermal Progenitörler Hücreleri (MPCs), kurtarma sağlar. - 3000 hücre, yeni 75 cm2 TC şişeler (P1) 'de / cm2 (Şekil 2C) - daha da genişlemesi için, 2,000 hücre süspansiyonu replate.
- MKH farklılaşma potansiyellerini değerlendirmek için hücrelerin hacimde kullanınosteojenik, adipojenik ve kondrojenik soy doğru. Üreticinin tavsiyelerini (Şekil 2B) Aşağıdaki farklılaşma analizleri gerçekleştirin.
NOT: Farklı boyama yöntemleri multilinaj farklılaşma değerlendirmek için de kullanılabilir.
İlaç Takviyeler ile osteojenik Orta 7. Hazırlık
- Askorbik asit çözeltisi (çözeltiler, 1A. Askorbik asit, 200 mg / ml (), bir 20 mg / ml çözelti (Çözelti 1B elde etmek üzere, DMEM-LG ile çalışma çözeltisi Malzemelerin Tablo) 01:10 bakınız çözeltiler 1A Hazır alikotları ve kullanıma kadar -20 ° C'de 1B.
- Steril su, 10 ml içinde süspanse 1 gr hidrokortizon (Çözelti 2A: hidrokortizon 100 mg / mL (Malzemelerin Tablo bakınız), 1 çözeltiler, 2A. DMEM-LG ile 1000 çalışma, 100 ug / ml solüsyon (Çözelti 2B elde etmek üzere çözeltisi). kullanıma kadar -20 ° C'de çözeltiler 2A ve 2B'de stok alikotları.
- Kullanım p üzerineaşağıdaki şekilde, taze osteojenik orta onarılması:% 10 otolog serum, 50 | ig / ml, askorbik asit ve 0.4 ug / ml hidrokortizon içeren DMEM-LG ilave edin. Steril filtre osteojenik ortam.
8. osteojenik Ön indüksiyon ve hMSCs Kurtarma
- Tamamen çoğalma ortamı çıkarın ve hücre hasat öncesi osteojenik orta 96 saat ekleyin (yani, 80-90% izdiham genellikle 7 gün içinde ulaşılır). Ek osteojenik orta bir değişiklik hücre hasat öncesi 24 saat sağlayın.
- Aşama 6.5 anlatılan ve yavaşça 50 ml bir tüp içinde tam bir proliferasyon orta 2 ml ekleyerek pelet gibi hücreler ayırın.
Not: Hücre canlılığı, osteoendüksiyon bir sonucu olarak (yaklaşık% 10) indirgenebilir. Hücresel agregalar görülebilir. - sayımının ardından 5 dakika boyunca 300 x g'de tam çoğalma ortamı ve santrifüj ile hücreler yıkayın. 2 x 10 6 canlı hücre / 2-1 yavaşça peletotolog plazma ml bir 50 ml tüp başı (bakınız bölüm 2).
hMSC / fibrin pıhtısı Yapılar 9. hazırlanması
- Aşama 8.3 elde edilen her bir 50 ml tüp 100 mg / ml kalsiyum glukonat 150 ul ekle. ve nazik sallayarak altında hücreleri tekrar süspansiyon.
- HMSC / fibrin pıhtısı yapıları (Şekil 3A) elde etmek üzere, 30 dakika - 15 CO2, 37 ° C'de inkübe hücreleri ve% 5. hücre içermeyen bir fibrin pıhtısı yapı hazırlayın, bir kontrol olarak kullanılır.
NOT: ÖNEMLİ: çapraz bağlantısı için 30 dakika veya daha fazla sürer gibi, en az 2 saat hücre canlılığı tahlil önce bu kontrol pıhtı hazırlamak için tavsiye edilir.
10. Hücre Canlılık Testi
- 50 ml tüpler sıvının ve% 10 v / v hücre canlılığı, reaktifi ihtiva eden tam bir proliferasyon ortam 1 ml (AB; Malzemelerin Tablo), üreticinin talimatlarına göre yöntem.
- th inkübeE 37 ° C'de tüpler ve% 5, 3 saat boyunca CO2. (; T0 0 zamanında AB) 600 nm'lik bir referans dalga boyu ile 570 nm'deki absorbansı ölçülür.
- Süpernatantı atın ve taze tam çoğalması orta 2 mL ekleyin. % 5, 37 ° C'de inkübe edilir CO2 O / N. Ertesi gün (AB süresi 24 saatte, t24), tekrar 10.1 10.3 için (Şekil 3B) yineleyin.
Fibrin pıhtısı Yapıları içinde Hücre Canlılığı ve Kalsiyum Biriktirme 11. Histolojik Değerlendirilmesi
- nötr tamponlu formalin O v / / N 4 ° C'de w% 4 hMSC / fibrin pıhtı yapıları düzeltmek. % 70 etanol içinde 15 dakika ve mağaza D-PBS içinde yıkama 4x.
- 45 dakika boyunca iki kez 30 dakika,% 95 için bir kez% 80 ve 1 saat boyunca% 100 3x: dereceli etanol serisi içinde, 40 ° C'de numune kurutmak. 40 ° C 'de 45 dakika süre ile, ksilen içinde iki kez açıklık getirmektedir.
- 2 saat boyunca 60 ° C 'de sıvı parafin örnekleri durulayıp yerleştirin. t mikrotom ile parafin blok kesin ve montajcam slaytlar o bölümler (5 um).
- Standart hematoksilen ve eozin (H & E) yöntemini (Şekil 3C) kullanılarak deparafinize bölümleri Leke.
- 15 dakika sonra 2 dakika süre ile% 0.5 pirogalol ve 2 dakika boyunca,% 5 sodyum tiyosülfat% 1 gümüş nitrat ile bölümleri muamele edilmesiyle von Kossa Boyama gerçekleştirin. 5 dakika boyunca 5 g alüminyum sülfat ihtiva eden bir çözelti içerisinde seyreltildi,% 0.1 nükleer hızlı kırmızı bölümleri karşıt ve 5 dakika musluk suyu ile durulayın. Bir montaj ajanı ile bölümleri monte edin.
- Işık mikroskobu (400X büyütme) (Şekil 3B) altında siyah granüller gibi mineral birikimi değerlendirin.
12. CFU-E Deneyi
- (Adım 6.3.) 25 cm2 şişeye yıkayın D-PBS ile. Standart May-Grunwald / Giemsa yöntemi ile Leke. Görme ışık mikroskobu altında bireysel koloniler (Şekil 4) puanlama hMSC sayısını ölçmek.
NOT: EğerKemik iliği adım 1.2 olarak kabul edilir. ve 2 bölüm - 9 gerekli düzenleyici onayı ile Good Manufacturing Practice (GMP) gerçekleştirilir, hMSC / fibrin pıhtı yapıları ortopedik uygulamalar için implante edilebilir.
Representative Results
otolog serum hazırlanması
hMSC kültürü için gereken aktarım çantasına kalsiyum glukonat ilave edilerek gerçekleştirilir plazma koagülasyonu, büyük miktarlarda, otolog serum iyileşme sağlar. Gerçekten de, bu teknik ile, serum, 200 mL (Şekil 1) kadar elde etmek mümkün olmaktadır.
otolog serum kullanarak hMSC izolasyon, kültür ve farklılaşma
Kemik iliği tek çekirdekli hücreleri bir ara halka tabakası (Şekil 2A) neden olan bir yoğunluk gradyanı kullanılarak izole edilir. Bu kaplama hücreleri ve yıkama uyumsuz olanlar kaldırarak, hMSCs (Şekil 2B) izole edilmesi mümkündür. Otolog kültür koşulları altında, PPM'ler adı hücrelerinin bir alt kümesi, P0 ve t kadar yüzde olarak algılanır% 10 o hasta değişkenliği (Şekil 2B) bağlı olarak değişebilir. PPM'lerin de proteaz hücre pasajlarının (Şekil 2C) için kullanılır (yani, P1) şarjı sonra mevcut olan. hMSCs izole edildi ve otolog ortamda kültüre üç tanınmış mezodermal soy (osteojenik, adipogenic ve kondrojenik) doğru ayırt etmek için kendi yeteneği korumak. farklılaşma deneyleri, standart (nonautologous) ön gördüğü kültür koşulları kullanılarak elde edilenler ile hMSC popülasyon kimlik karşılaştırma yapıldı. PH 1 bu protokolü von Kossa boyaması, osmiyum tetroksit boyama ve Alcian Mavi boyaması için işlevsellik deneyleri farklılaşma medya üreticisi tarafından önerilen olanların yerine seçildi (Şekil 2B) (Malzeme Tablo).
Hazırlık, canlılık ve MSC / fibrin pıhtı yapıları histolojik karakterizasyonu
(Şekil 3A) ile çevrili bir jöle diskin oluşumuna yol açan, bir 50 ml tüp içinde, kalsiyum glukonat ile çapraz bağlanmış olan plazma içinde disperse edilir. (Cellularized pıhtı) (Şekil 3B) pembe (hücreler olmadan kontrol) maviden hücre canlılığı boya T24 renk değişimi ile gösterildiği gibi, bu plazma pıhtıları, içinde, hMSCs, yaşayabilir. Pıhtı içindeki Hücre canlılığı, iyi korunmuş bir hücre morfolojisi (Şekil 3C) gösteren, H & E boyama ile teyit edilir. Ayrıca, sadece ikinci hücre hasattan önce en az bir osteoindiksiyon uyarılan hMSCs (Şekil 3B) tarafından ön kalsiyum birikimine yol açmaktadır.
Koloni Oluşturma Birimi
Kültür 2 hafta sonra hMSC kolonilerin mevcudiyetinde, CFU-E tahlilinde (Şekil 4) ile gösterilmektedir.
s = "jove_step" fo: keep-together.within-page = "1"> MSC / fibrin pıhtısı Uygulama kemik olmayan birliğe inşa
Bu yöntem (adım 1.1) de tarif edildiği gibi elde edilen hMSC / fibrin pıhtısının konstruktları başarıyla 8 acil durumlar için 13 şiddetli üst ekstremite psödoartrozlarının tedavi uygulanmıştır. Uzun vadeli (maksimum 7.6 ay) değerlendirme doku aşırı çoğalma veya tümör oluşumu kanıt olmadan, tüm hastalar için başarılı klinik ve fonksiyonel sonuçları doğruladı.
Otolog Serum 1. Hazırlık Şekil.
(A) plazma birimi başak ile bir transfer torbaya transfer edilir; (B) plazma port konnektörü ile kalsiyum glukonat enjekte edilerek koagüle edilir; (C) bir kan torbası santrifüj serumun ayrılması için kullanılır./files/ftp_upload/54845/54845fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Otolog Serum kullanarak Şekil 2. hMSC İzolasyon, Kültür ve Farklılaşma.
Kemik iliği yoğunluk gradyanı ile santrifüjleme sonrası elde edilen (A), (mavi çizgi penceresinde) mononükleer hücre tabakası; (B) P1 göründüğü gibi hücre kültürü; (C) Hücre kültürü o P0 (birincil kültür) de göründüğü gibi; (B - C) Oklar MSC kültüründe MPCs varlığını göstermektedir. Ölçek çubuğu 100 mikron olduğu; (D) multilinaj farklılaşma tahlillerin histokimyasal sonuçları. siyah, adipogenic farklılaşma mineral matriks birikimi için von Kossa boyama kullanılarak değerlendirilir osteojenik farklılaşma osmiyum tetroxi siyah lekeli, yağlı vakuol varlığı ile gösterilirde ve kondrojenik farklılaşma pH 1. Ölçek barda Alsiyan mavi boyama ile mavi boyanır sülfatlanmış glikozaminoglikanlar varlığı ile gösterildi: 50 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Hazırlık MSC / fibrin pıhtısı Yapılar Canlılık ve Histolojik Karakterizasyonu.
Çapraz bağlama sonra göründüğü gibi (A) hMSC / fibrin pıhtı oluşturmak; (B) AB testinin Sonuçları: (sağda, kontrol hücreleri hariç) maviden, hücre canlılığı boya (t24) renk değişikliği gösterdiği gibi MKH, fibrin pıhtısı içinde yaşayabilir üzerinde, (cellularized pıhtı pembe sol). (C - D) hMSC / fibrin pıhtı yapıları histokimyasal sonuçları. Ölçek çubuğu bulunur50 um. (C) Hematoksilen ve fibrin matriks içine gömülü canlı hücreleri gösteren Eosin boyama; Ilk osteogenezis teyit von Kossa boyaması, siyah lekeli (D) Mineral matris birikimi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
4. CFU-F Testi Şekil.
May-Grunwald / Giemsa yöntemi ile boyanan hMSCs ile kültüre bir balonun resmi. uzaklaştırdınız-alan bir hMSC koloni morfolojisi gösteren bir ışık mikrografiğidir. Ölçek çubuğu 100 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
HMSC / fibrin pıhtısı Şekil 5. Uygulama Kemik Kaynamamanın içinde oluşturun.
Psödoartrozu etkilenen bir hastanın üst ekstremite (a) X-ışını; (B) sadece implantasyon öncesi hMSC / fibrin pıhtı oluşumu; (C) hMSC / fibrin pıhtı yapısının Cerrahi uygulama; 5 yıl sonra aynı hastada üst ekstremite (D) X-ışını. Bu rakam Giannotti S. ve ark gelen yayınlanamaz edilir. en az değişikliklerle 13. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Bu protokol, ilgi kritik adım Güvenli bir hMSC tedavi elde etmek için izin insan yetişkin serumu ve proteaz kullanımı. proteaz MPCs, hasat sağlar iken, özellikle insan yetişkin serumu, izolasyon ve bakım sağlar. Bu nedenle, kültür süresi boyunca uygun bir hMSCs bir rezervuar temin taze hMSCs ortaya çıkmasına neden olabilir, kemik iliğinde bulunan olgunlaşmamış hücrelerdir. proteaz aktivitesine pozlama süresini artırarak hMSC canlılığı için zararlı olduğundan değil, tüm PPM'ler toplanabilir. Bu nedenle, 10 dakika proteaz inkübasyon MPCs kurtarma ve hMSCs canlılığı arasında optimum uzlaşma olarak seçildi. Diğer önemli adım osteodifferentiation zamanıdır. Nitekim, in vitro osteodifferentiation geniş bir ölçüde böylece in vivo olarak nihai kemik oluşumunu etkileyen, hücre canlılığı azaltacaktır. son kritik adım bir otolog biorezorbabl iskele availing oluşur, yüklenebileceğiniH, plazma pıhtılaşma Bir fibrin jel hücreleri (hMSCs ve MPCs) gömme ile elde edilir.
MPCs verimini arttırmak için bir anahtar aşama, daha yüksek bir konsantrasyonda mononükleer hücreleri tohum etmektir. plazma elde etmek için aferez prosedürler kullanılarak ve kalsiyum glukonat ile muamele ile de büyük miktarlarda, otolog serum elde etmeyi mümkün kılar. Bir orta ek olarak insan serum hMSC kültürlerinde fetal sığır serumu (FBS) ile karşılaştırılabilir olduğu görülmüştür. Ancak, bizim deneyim, FBS ile takviye tam orta insan yetişkin serumu daha hızlı yaşlanma katkıda bulunur. Önemli bir adım olduğunu hMSCs bir asgari osteoindüksiyonu tatbik etmektedir. Gerçekten de bu tedavi ve böylece in vivo olarak daha fazla hücre dönüşümü önlemek için yararlı olan, kolay osteojenik soy doğru ayırt etmek için hücreleri neden olur. minimal osteoinduced hMSCs iyi canlılığını korumak için, dikkatli adımlarla 6.5 açıklanan önerileri takip önerilir. bird 8.2., taşıma, santrifüj ve orta miktarlarda dahil eklenecek. Bir aferez işlemi mevcut değilse, havuza AB sera satın alarak, alternatif olarak, hastaya berabere ya da birden fazla kan gerçekleştirerek bu protokolü yürütmek mümkündür. Açıkçası, tezgah arası başucunda bu protokolü getirmek için, mevcut GMP hücre fabrikaları veya eşdeğerleri olması zorunludur.
Osteomiyelit etkilenen bu tekniğin endişe anemik, hematolojik onkoloji ve ortopedi hastalarının uygulamaya Sınırlamalar., anemik hastaların büyük miktarda kan Çizim, kaçınılmalıdır. osteomiyelit hastalarında enfeksiyon nihai sonucunu etkileyebilecek ise onkolojik hastalarda, hücre örneklerinin kalitesi, kemoterapi tedavileri etkilenir. otolog serum yetersiz veya uygun olmayan olduğu tüm durumlarda, toplanmış erkek AB sera iyi bir alternatif oluşturmaktadır.
Hücre / fibrin clo kullanarakMümkün klinik uygulamalar için t yapıları kemik olmayan sendikalar 13 tedavi etmek için mükemmel sonuçlar sonuçlanan ameliyat sırasında ele almak ve kalıp kolay olabilir tamamen otolog hücre tedavisi, serbest bırakmak için önemlidir. Az manipülasyon ve detaylı manipülasyon 9: klinik amaçlar için, hMSCs genellikle iki ana prosedürlerle uygulanır. Bu, hücre morfolojisi ve boyutu 18 anormallikler olarak geniş ex vivo kültür ile ilgili problemleri aşmak için, ex vivo hücre genişlemesi ve osteo-farklılaşma (sadece 4 gün) kısa bir kez gerçekleştirilir.
Gösterdi kısa hücre genişlemesi ve osteodifferentiation süreleri ile birlikte, bu yazıda anlatılan xeno ücretsiz protokol, doku üremesine ve dönüşüm delil olmaksızın, in vivo olarak hızlı kemik üretimi elde etmek için kliniklerde ilgili olduğu, bu nedenle teyit etkinliği ve uzun kemik tamir uzun dönem güvenlik (Şekil 5) 13.
Bu raporda sunulan metodoloji ortopedik cerrahide olası kullanım için otolog koşullarda in vitro genişlemesi hMSC etkinliğini ve güvenilirliğini gösteren hedefleniyor. Bu protokol, ortam otolog serumu ile desteklenmiş ve bu nedenle tamamen otolog hücre tedavisi sağlanması otolog fibrin pıhtısı gömülü kemik iliği ve kültürlenmiş izole hMSCs kullanmaktadır. iki kat osteojenik indüksiyon, sadece ikinci dekolmanı önce, osteoblast içine ayırt etmek hMSC yeteneğini geliştirir. Bu psödoartrozu sınırlı değildir, çünkü, bir sonuç olarak, bu teknik, kemik defektlerinin uygulamalar için özellikle uygundur. Gelecekteki olası uygulamalar talus kist ve kemik kaybı yönetimini içerebilir.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triple Select (1x) | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 12563-029 | cell culture |
| Trypan blue stain | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
| DMEM-LG, no glutamine, no phenol red | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 11880-028 | cell culture |
| Glutamax (100x) | Gibco, Life Technologies | 35050038 | cell culture |
| Penicillin/Streptomycin sol. | Gibco, Life Technologies | 15140122 | cell culture |
| Alamar Blue (AB) | Gibco, Life Technologies | DAL1025 | proliferation/viability assay |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-14440-02 | cell culture |
| D-PBS | Gibco, Life Technologies | 14190-094 | cell culture |
| StemMACS AdipoDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-677 | cell culture |
| StemMACS ChondroDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-679 | cell culture |
| hMSC Osteogenicdiff BulletKit | Euroclone | LOPT3002 | cell culture |
| Vitamin C (ascorbic acid) | Bayer | ATC Code: A11GA01 | Pharmaceutical grade drug |
| Flebocortid Richter (hydrocortisone) | Aventis Pharma | ATC Code: H02AB09 | Pharmaceutical grade drug |
| Victor X3, reader | PerkinElmer | 2030 multilabel reader | proliferation/viability assay |
| Silver nitrate | Sigma Aldrich | 209139 | histological assay |
| Pyrogallol | Sigma Aldrich | 16040 | histological assay |
| Sodium Thiosulphate | Sigma Aldrich | S8503 | histological assay |
| Histoplast LP | Thermo Scientific | 8332 | histological assay |
| Methanol | Sigma Aldrich | 32213 | histological assay |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | histological assay |
| Nuclear fast red | Sigma Aldrich | 60700 | histological assay |
| Formalin | Bio-optica | 05-K01009-X40 | histological assay |
| Eosin B | Sigma Aldrich | 45260 | histological assay |
| DPX | Sigma Aldrich | 6522 | histological assay |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich | H3136 | histological assay |
| Aluminium Sulphate | Sigma Aldrich | 202614 | histological assay |
| Xylol | Sigma Aldrich | 534056 | histological assay |
| Microtome | Leika | histological assay | |
| May Grunwald | Sigma Aldrich | MG1L-1L | histological assay |
| Giemsa | Sigma Aldrich | 32884-250ML | histological assay |
| Transfer bag | Biomérieux | BC0300031 | cell culture |
| Filtration kit | Macopharma | BC0800010 | cell culture |
| Calcium Gluconate | Galenica Senese | Pharmaceutical grade drug | |
| Bact Alert | Biomérieux | 259790 anaerobic | microbiological assay |
| Bact Alert | Biomérieux | 259789 aerobic | microbiological assay |
| Steryle Luer-Lok Syringe 50 mL | BD Plastipak | 300865 | cell processing |
| Heraeus Cryofuge 6000i | Thermo Scientific | blood bag centrifuging | |
| SL16R Centrifuge | Thermo Scientific | blood tube centrifuging |
References
- Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7, 393-395 (2005).
- Kassem, M., Abdallah, B. M. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: biological characteristics and potential role in therapy of degenerative diseases. Cell Tissue Res. 331, 157-163 (2008).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Bonfield, T. L., Nolan Koloze, M. T., Lennon, D. P., Caplan, A. I. Defining human mesenchymal stem cells efficacy in vivo. J Inflamm. (Lond). 25 (7), 51 (2010).
- Pneumaticos, S. G., Triantafyllopoulos, G. K., Chatziioannou, S., Basdra, E. K., Papavassiliou, A. G. Biomolecular strategies of bone augmentation in spinal surgery. Trends Mol. Med. 17 (4), 215-222 (2011).
- Amhed, T. A. E., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: A versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Engineering Part B. 14 (2), 199-215 (2008).
- Silbertein, L. E., Williams, L. J., Huglett, M. A., Magee, D. A., Weisman, R. A. An autologous fibrinogen-based adhesive for use in oncologic surgery. Transfusion. 28 (4), 319-321 (1988).
- Jockenhoevel, S., et al. Fibrin gel advantages of a new scaffold in cardiovascular tissue engineering. Eur. J. Cardiothorac Surg. 19 (4), 424-430 (2001).
- Veronesi, F., et al. Clinical use of bone marrow, bone marrow concentrate, and expanded bone marrow mesenchymal stem cells in cartilage disease. Stem Cells Dev. 22 (2), 181-192 (2013).
- Petrini, M., et al. Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow. Stem Cells Dev. 18 (6), 857-866 (2009).
- Trombi, L., et al. Selective culture of mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 18 (8), 1227-1234 (2009).
- Trombi, L., et al. Human autologous plasma-derived clot as a biological scaffold for mesenchymal stem cells in treatment of orthopedic healing. J. Orthop. Res. 26 (2), 176-183 (2008).
- Giannotti, S., et al. Use of autologous human mesenchymal stromal cell/fibrin clot constructs in upper limb non-unions: long term assessment. PlosOne. 8 (8), 73893 (2013).
- Castano-Izquierdo, H., et al. Pre-culture period of mesenchymal stem cells in osteogenic media influences their in vivo bone forming potential. J. Biomed. Mater. Res. A. 82 (1), 129-138 (2007).
- Malkani, A. L., Fitzgerald, R. H., Kaufer, H. Orthopaedics. , Mosby. St. Louis, MO. Chapters 86-87 (2002).
- Lee, S. H., et al. ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. Int J Lab Hematol. 30 (5), 349-364 (2008).
- Bugno, A., et al. Application of the BacT/ALERTR 3D system for sterility testingof injectable products. Braz J Microbiol. 46 (3), 743-747 (2015).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cells in vitro. BMC Cell Biology. 7, 14 (2006).
