Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.
The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.
Overførsel af gener og proteiner i mikro-organismal niveau spiller en central rolle i bakteriel overlevelse og evolution samt infektion processer. Udveksling af DNA mellem bakterier eller mellem en bakterie og en celle kan opnås ved transformation, konjugation eller vektor transduktion. 1,2 Konjugering er unik i forhold til transformation og transduktion ved, at under konjugering mellem gram-negative bakterier, såsom Escherichia coli, overførsel af DNA sker i en donor-styret måde, hvorved en kompleks makromolekylær system forbinder donor- og recipientceller. Konjugation er også den mest direkte måde, hvorpå bakterieceller interagerer med værtsceller at injicere gener, proteiner eller kemikalier i at værtssystemer. 3 Ofte overførsel af midler har bemærkelsesværdige virkninger på værten, der spænder fra patogenese og carcinogenese at være vært evolution og tilpasning. Det er blevet påvist, at konjugerende recombination Forhøjer tilpasningen 3 gange i bakterier med høje mutationsrater under forhold af miljømæssig stress. 4 Desuden konjugering er langt den mest almindelige vej, hvorigennem antibiotikaresistensgener i bakteriestammer er spredt. 5,6
Mikroorganismer har udviklet specialiserede sekretion systemer til at støtte overførsel af makromolekyler tværs cellemembraner; der i øjeblikket 9 typer af sekretion systemer (TSSs) i gram-negative bakterier, der er blevet beskrevet: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, samt Sec (sekretion) og Tat (to-arginin translokation) pathways. 7,8 Hver type sekretionssystem er yderligere opdelt i forskellige undertyper, en nødvendighed på grund af mangfoldigheden af proteiner og særpræg involverede veje, i forskellige bakteriestammer. For eksempel i type IV sekretionssystem (T4SS), Ti og Cag befordrer effektor transport hvorimod F-plasmid, R27 and pKM101 T4SSs lette overførsel af en konjugerende plasmid. 7,9,10 En detaljeret forståelse af de mekanismer, som organismer samler deres respektive sekretion systemer fra deres komponent proteiner og deler cellulære indhold med en modtager eller deres omgivende miljø er en vigtig faktor i udviklingen af målrettede strategier til bekæmpelse af sygdomsfremkaldende mikroorganismer og processer cellulær infektion.
Efter den indledende identifikation konjugation i E. coli ved Lederberg & Tatum, 11 er blevet identificeret og karakteriseret et stort antal mobile og konjugering plasmider. 12 Sådanne mobile plasmider viser betydelig rækkevidde er størrelse (fra 1 til over 200 kilobaser (kb)), men alle mobile plasmider indeholder en relaxase, som anerkender oprindelsen af overførsel (oriT) hvorved transmissionen af plasmidet. Konjugering plasmider yderligere koder gener for samling af en funktionel T4SS samt en typeIV kobling protein. 12 For eksempel 100 kb F plasmid af E. coli koder alle de konjugering gener i en 33,3 kB overførsel (tra) region. 13 Generne i tra region af F-plasmid koder for alle proteiner, der fremmer pilus-dannelse, parring pair formation (MPF), DNA-overførsel og eksklusionskriterier funktioner under konjugativ plasmid overførsel. 10,14,15 En væsentlig mængde af viden er tilgængelig for konjugativ T4SSs dog detaljerede strukturelle undersøgelser af konjugering proteiner og komplekser kun for nylig bliver tilgængelige. 16 – 28
For at samle et overblik over den konjugative proces en kobling af detaljerede strukturelle studier at mutationelle analyser af konjugering transfer proteiner påkrævet. Dette kan opnås gennem konjugering parring assays. For F-plasmid, hvert protein kodet inden for tra region spiller en rolle i F-medieret conjugation; derfor vil knockout / deletion af en overførsel gen afskaffe konjugative kapacitet af cellen (figur 1). Mens mindre mobile plasmider er mere befordrende for standard sletningsprocedurer, for større konjugering plasmider, såsom F, er gen-knockouts mere let opnås via homolog rekombination, hvor målgenet er erstattet med én formidle et distinkt antibiotikaresistensgen. I den nuværende protokol, beskæftiger vi homolog rekombination til at erstatte en overførsel gen af interesse med chloramphenicolacetyltransferase (CAT) i 55 kb F plasmid derivat pOX38-Tc; 29,30 den resulterende knockout plasmid, pOX38-Tc Δgene :: Cm, letter modstand mod chloramphenicol (Cm) i vækstmediet. Donorceller huser pOX38-Tc Δgene :: Cm er ude af stand til at påvirke konjugative DNA-overførsel / parring som observeret ved anvendelse af en dertil passende assay; parring effektiviteten af en pOX38-Tc Δgene :: Cm donor celle og en normal Recipient vil falde eller, oftere, afskaffes. Konjugative overførsel af pOX38-Tc Δgene :: Cm plasmid kan gendannes via en lille opsving plasmid, det målrettede overførsel genet. Dette opsving plasmid kan være en, der giver konstitutiv ekspression, såsom plasmid pK184 (pK184-genet), 31 eller en, der giver inducerbar ekspression så længe denne plasmidet korrekt målretter gen til den korrekte placering i cellen (cytoplasma eller periplasmaet). Følgelig i hinanden passende assays mellem denne nye donor (huser pOX38-Tc Δgene :: Cm + pK184-gen-plasmider) og en modtager celle, forventes parring effektivitet til at gendanne til næsten en normal donor-recipient parring assay. Dette system gør det muligt at undersøge funktionen af det bankede ud genet ved produktion af en række pK184-genkonstruktioner (deletioner eller punktmutationer) og teste hver konstruktion evne til at genoprette den sammenpassende kapacitet pOX38-Tc Δgene :: Cm skjult donorcelles.
Konjugation fremgangsmåde tilvejebringer et middel, hvormed bakterier kan sprede gener tilvejebringe en evolutionær fordel for vækst i udfordrende miljøer, såsom spredning af antibiotikaresistensmarkører. Fordi mange af de konjugering plasmider er så store, 12 funktionelle undersøgelser af involveret i montering af overførsel apparatet gennem mutation af målgener på selve konjugative plasmid proteiner er uhåndterlig. Protokollerne beskrevet heri tilvejebringer et middel, hvormed man kan lettere vu…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev understøttet af en Discovery Grant fra Natural Sciences & Engineering Council of Canada (NSERC).
GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
GeneJet Gel Extraction Kit | Fisher Scientific | K0692 | |
GeneJet PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0554S | |
Broad Range DNA Ladder | New England Biolabs | N0303A | |
Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
Electroporator | Eppendorf | 4309000027 | |
Electroporation cuvettes | Fisher Scientific | FB101 | Cuvettes have a 1 mm gap. |
Enzymes | |||
AvaI | New England Biolabs | R0152S | |
EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
DpnI | New England Biolabs | R0176S | |
Antibiotics | Final Concentrations | ||
Chloramphenicol (Cm) | Fisher Scientific | BP904-100 | 20 µg/mL |
Kanamycin (Km) | BioBasic Inc. | DB0286 | 50 µg/mL |
Nalidixic acid (Nal) | Sigma-Aldrich | N8878-25G | 10 µg/mL |
Rifampicin (Rif) | Calbiochem | 557303 | 20 µg/mL |
Tetracycline (Tc) | Fisher Scientific | BP912-100 | 10 µg/mL |
Streptomycin (Sm) | Fisher Scientific | BP910-50 | 50 µg/mL |