Summary

Конъюгативных Спаривание Анализы для последовательности конкретного анализа переноса белков, участвующих в конъюгации бактерий

Published: January 04, 2017
doi:

Summary

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Abstract

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Introduction

Перенос генов и белков на микро-организменном уровне играет центральную роль в выживаемости бактерий и эволюции, а также инфекционных процессов. Обмен ДНК между бактериями или между бактерией и клеткой может быть достигнуто с помощью трансформации, конъюгации или вектором трансдукции. 1,2 Сопряжение уникальна по сравнению с трансформацией и трансдукции в том , что при конъюгации между грамотрицательных бактерий , таких как кишечная палочка, перенос ДНК происходит в донорной-контролируемым способом , посредством которого комплекс макромолекулярная система соединяет донора и реципиента клетки. Сопряжение также самый прямой путь, в котором бактериальные клетки взаимодействуют с клетками-хозяевами, чтобы ввести гены, белки или химические вещества, чтобы хост-системах. 3 Довольно часто, передача таких агентов имеет замечательные эффекты на хозяина, начиная от патогенеза и канцерогенеза провести эволюцию и адаптацию. Было показано, что конъюгативная recombinatioп увеличивает скорость адаптации в 3 раза у бактерий с высоким уровнем мутаций в условиях экологического стресса. 4 Кроме того, конъюгация на сегодняшний день является наиболее распространенным путем , через который гены устойчивости к антибиотикам в бактериальных штаммов рассредоточены. 5,6

Микроорганизмы развивались специализированные системы секреции для поддержки передачи макромолекул через клеточные мембраны; Есть в настоящее время 9 типов систем секреции (ЦСС) в грамотрицательных бактерий, которые были описаны: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, а также Sec (секреции) и Tat (два-Аргинин транслокации) пути. 7,8 Каждый тип системы секреции дополнительно делится на различные подтипы, необходимость из – за разнообразия белков и своеобразия путей , участвующих в различных бактериальных штаммов. Например, в системе секреции IV типа (T4SS), системы Ti и CAG облегчают эффекторной транспорт в то время как F-плазмиды, Р27й pKM101 T4SSs облегчают передачу конъюгативной плазмиды. 7,9,10 Детальное понимание механизмов , с помощью которых организмы собирают свои системы секреции из их составных белков и разделяют клеточное содержимое с получателем или их окружающей среды является важным фактором в развитии целевых стратегий борьбы с патогенными микроорганизмами и процессы клеточная инфекция.

После первоначальной идентификации конъюгации бактерий в E.coli путем Ледербергом & Tatum, 11 большое количество мобильных и конъюгативных плазмид были идентифицированы и охарактеризованы. 12 Такие мобильные плазмид показывают значительный диапазон размеров (от 1 до более чем 200 т.п.н. (КБ)), однако все мобильные плазмиды содержат relaxase, признающей происхождение передачи (ОРИТ) , тем самым позволяя передачу плазмиды. Конъюгативных плазмид дополнительные гены кодируют для сборки функционального T4SS, а также типIV соединительный белок. 12 Например, 100 кб F плазмиды E.coli , кодирует все конъюгативных гены в пределах 33,3 кБ передачи (TRA) области. 13 Гены ТНС области плазмиды закодировать F все белки , которые способствуют образованию фимбриевый, присоединительными образования пар (MPF), перенос ДНК и функции исключения во время конъюгативного переноса плазмиды. 10,14,15 Значительный объем знаний доступен для конъюгативной T4SSs, однако подробно Структурные исследования конъюгативных белков и комплексов только в последнее время становятся доступными. 16 28

Для того, чтобы собрать полное представление о конъюгативной процесса, соединительное детальных структурных исследований для мутационный анализ конъюгативных белков переноса требуется. Это может быть достигнуто с помощью конъюгативных сопрягаемых анализов. Для получения плазмиды F, каждый белок , кодируемый в пределах области тра играет определенную роль в F-опосредованного соnjugation; поэтому, нокаута / удаление гена переноса отменит конъюгативных способность клетки (рисунок 1). В то время как более мелкие мобильные Плазмиды являются более благоприятными для стандартных процедур, удаление, для больших конъюгативных плазмид, таких как F, нокаут гена более легко достигается с помощью гомологичной рекомбинации, где ген-мишень заменен одним передать отчетливое ген устойчивости к антибиотику. В текущем протоколе, мы используем гомологичной рекомбинации, чтобы заменить ген переноса интереса с хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) в 55 кб F плазмиды производное pOX38-Tc; 29,30 результирующая Нокаут плазмиду pOX38-Tc Δgene :: Cm, способствует устойчивости к наличию хлорамфеникола (Cm) в ростовой среде. Донорские клетки, несущие pOX38-Tc Δgene :: Cm не могут влиять на конъюгативного переноса ДНК / спаривание, как наблюдаемое за счет использования пробирного сопрягаемой; эффективность спаривание донора клетки pOX38-Tc Δgene :: Cm и нормальный Recipнике, будет уменьшаться или, чаще, быть отменена. Конъюгативных перенос плазмиды pOX38-Tc Δgene :: Cm может быть восстановлен с помощью небольшой плазмиды восстановления укрывает целевого гена переноса. Это восстановление плазмида может быть тот , который обеспечивает конститутивную экспрессию, такой как плазмида pK184 (pK184-гена), 31 или тот , который обеспечивает индуцируемой экспрессии до тех пор , как плазмида правильно ориентирована ген на правильное расположение внутри клетки (цитоплазме или периплазмы). Следовательно, в брачных анализах между этим новым донором (укрывательство pOX38-Tc Δgene :: Cm + pK184-гена плазмид) и клетку-реципиент, эффективность спаривание, как ожидается, восстановление до почти у нормального донора и реципиента сопрягаемой анализа. Эта система дает возможность исследовать функцию выбиты гена через поколение серии pK184-генных конструкций (делеции или точечные мутации) и тестирование способности каждой конструкции, чтобы восстановить брачный потенциал укрывательство pOX38-Tc Δgene :: Cm донор клетокs.

Protocol

1. Получение ДНК-конструктов Проектирование олигомеров для гомологичной рекомбинации гена – мишени Конструкция одного 55-72 п.н. вперед олигомера следующим образом: (а) получить длинную последовательность нуклеотидов 19-32 п.н., которая является гомологичной по…

Representative Results

Процесс F плазмиды управляемой бактериальной конъюгации представляет собой скоординированный процесс , который включает в себя белки переноса в тра области F-плазмиды , которая собирает T4SS для облегчения синтеза фимбриевый и конъюгативных перенос ДНК. Белок TRAF (G…

Discussion

Бактериальный процесс конъюгации обеспечивает средства, с помощью которых бактерии могут распространяться гены обеспечивая эволюционное преимущество для роста в сложных условиях, таких как распространение маркеров устойчивости к антибиотикам. Поскольку многие из конъюгативных пл?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано Discovery Гранта из наук и инженерного совета природного Канады (NSERC).

Materials

GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit Fisher Scientific K0503
GeneJet Gel Extraction Kit Fisher Scientific K0692
GeneJet PCR Purification Kit Fisher Scientific K0702
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit New England Biolabs E0554S
Broad Range DNA Ladder New England Biolabs N0303A
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875713
Electroporator Eppendorf 4309000027
Electroporation cuvettes Fisher Scientific FB101 Cuvettes have a 1 mm gap.
Enzymes
AvaI New England Biolabs R0152S
EcoRI New England Biolabs R0101S
HindIII New England Biolabs R0104L
NdeI New England Biolabs R0111S
Phusion DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S
DpnI New England Biolabs R0176S
Antibiotics Final Concentrations
Chloramphenicol (Cm) Fisher Scientific BP904-100 20 µg/mL
Kanamycin (Km) BioBasic Inc. DB0286 50 µg/mL
Nalidixic acid (Nal) Sigma-Aldrich N8878-25G 10 µg/mL
Rifampicin (Rif) Calbiochem 557303 20 µg/mL
Tetracycline (Tc) Fisher Scientific BP912-100 10 µg/mL
Streptomycin (Sm) Fisher Scientific BP910-50 50 µg/mL

References

  1. Dobrindt, U., Hochhut, B., Hentschel, U., Hacker, J. Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms. Nat Rev Microbiol. 2 (5), 414-424 (2004).
  2. Furuya, E. Y., Lowy, F. D. Antimicrobial-resistant bacteria in the community setting. Nat Rev Microbiol. 4 (1), 36-45 (2006).
  3. Griffiths, A., Miller, J., Suzuki, D., Lewontin, R., Gelbart, W. . An Introduction to Genetic Analysis, 7th Edition. , (2000).
  4. Cooper, T. F., Barton, N. H. Recombination Speeds Adaptation by Reducing Competition between Beneficial Mutations in Populations of Escherichia coli. PLoS Biol. 5 (9), 225 (2007).
  5. Lujan, S. A., Guogas, L. M., Ragonese, H., Matson, S. W., Redinbo, M. R. Disrupting antibiotic resistance propagation by inhibiting the conjugative DNA relaxase. Proc Natl Acad Sci. 104 (30), 12282-12287 (2007).
  6. Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
  7. Shala, A., Ferraro, M., Audette, G. F., Bawa, R., Audette, G. F., Rubenstein, I. Bacterial Secretion Systems: Nanomachines for Infection and Genetic Diversity. Handbook of Clinical Nanomedicine: Nanoparticles, Imaging, Therapy and Clinical Applications. , 657-686 (2016).
  8. Tseng, T. T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 2 (2009).
  9. Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
  10. Lawley, T. D., Klimke, W. A., Gubbins, M. J., Frost, L. S. F factor conjugation is a true type IV secretion system. FEMS Microbiol Lett. 224 (1), 1-15 (2003).
  11. Lederberg, J., Tatum, E. L. Gene Recombination in Escherichia Coli. Nature. 158 (4016), 558-558 (1946).
  12. Smillie, C., Garcillan-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P. C., de la Cruz, F. Mobility of Plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
  13. Willetts, N., Skurray, R. The Conjugation System of F-Like Plasmids. Annu Rev Genet. 14 (1), 41-76 (1980).
  14. Frost, L. S., Ippen-Ihler, K., Skurray, R. A. Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the F sex factor. Microbiol Rev. 58 (2), 162-210 (1994).
  15. Audette, G. F., Manchak, J., Beatty, P., Klimke, W. A., Frost, L. S. Entry exclusion in F-like plasmids requires intact TraG in the donor that recognizes its cognate TraS in the recipient. Microbiology. 153, 442-451 (2007).
  16. Christie, P. J., Atmakuri, K., Krishnamoorthy, V., Jakubowski, S., Cascales, E. Biogenesis, Architecture, and Function of Bacterial Type Iv Secretion Systems. Annu Rev Microbiol. 59 (1), 451-485 (2005).
  17. Christie, P. J. Type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems. Biochim Biophys Acta – Mol Cell Res. 1694 (1-3), 219-234 (2004).
  18. Bhatty, M., Laverde Gomez, J. a., Christie, P. J. The expanding bacterial type IV secretion lexicon. Res Microbiol. 164 (6), 620-639 (2013).
  19. Christie, P. J., Cascales, E. Structural and dynamic properties of bacterial Type IV secretion systems (Review). Mol Membr Biol. 22 (1-2), 51-61 (2005).
  20. Christie, P. J. Type IV secretion: Intercellular transfer of macromolecules by systems ancestrally related to conjugation machines. Mol Microbiol. 40 (2), 294-305 (2001).
  21. Christie, P. J., Whitaker, N., González-Rivera, C. Mechanism and structure of the bacterial type IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1578-1591 (2014).
  22. Cascales, E. The type VI secretion toolkit. EMBO Rep. 9, 735 (2008).
  23. Silverman, J. M., Brunet, Y. R., Cascales, E., Mougous, J. D. Structure and Regulation of the Type VI Secretion System. Annu Rev Microbiol. 66 (1), 453-472 (2012).
  24. Chandran, V., et al. Structure of the outer membrane complex of a type IV secretion system. Nature. 462 (7276), 1011-1015 (2009).
  25. Rivera-Calzada, A., et al. Structure of a bacterial type IV secretion core complex at subnanometre resolution. EMBO J. 32 (8), 1195-1204 (2013).
  26. Waksman, G., Fronzes, R. Molecular architecture of bacterial type IV secretion systems. Trends Biochem Sci. 35, 691 (2010).
  27. Fronzes, R., Christie, P. J., Waksman, G. The structural biology of type IV secretion systems. Nat Rev Microbiol. 7 (10), 703-714 (2009).
  28. Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12 (7), 5-9 (2015).
  29. Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. Identification of a sex-factor-affinity site in E. coli as gamma delta. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 45, 135-140 (1981).
  30. Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
  31. Jobling, M. G., Holmes, R. K. Construction of vectors with the pl5a replicon, kanamycin resistance, inducible lacZα and pUC18 or pUC19 multiple cloning sites. Nucleic Acids Res. 18 (17), 5315 (1990).
  32. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose P(BAD) promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
  33. Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5978-5983 (2009).
  34. Lawley, T. D., Gilmour, M. W., Gunton, J. E., Standeven, L. J., Taylor, D. E. Functional and Mutational Analysis of Conjugative Transfer Region 1 (Tra1) from the IncHI1 Plasmid R27. J Bacteriol. 184 (8), 2173-2180 (2002).
  35. Elton, T. C., Holland, S. J., Frost, L. S., Hazes, B. F-Like Type IV Secretion Systems Encode Proteins with Thioredoxin Folds That Are Putative DsbC Homologues. J Bacteriol. 187 (24), 8267-8277 (2005).
  36. Hazes, B., Frost, L. Towards a systems biology approach to study type II/IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1778, 1839-1850 (2008).
  37. Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F., Tsolis, R. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590 (3), 376-386 (2016).
  38. Audette, G. F., Van Schaik, E. J., Hazes, B., Irvin, R. T. DNA-binding protein nanotubes: Learning from nature’s nanotech examples. Nano Lett. 4, 1897-1902 (2004).
  39. Harris, R. L., Silverman, P. A. Tra proteins characteristic of F-like type IV secretion systems constitute an interaction group by yeast two-hybrid analysis. J Bacteriol. 186 (16), 5480-5485 (2004).
  40. Moore, D., et al. Characterization of the F-Plasmid Conjugative Transfer Gene traU. J Bacteriol. 172 (8), 4263-4270 (1990).
  41. Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
  42. Klimke, W. A., Frost, L. S. Genetic analysis of the role of the transfer gene, traN, of the F and R100-1 plasmids in mating pair stabilization during conjugation. J Bacteriol. 180 (16), 4036-4043 (1998).
  43. Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69 (1), 209-228 (2015).
  44. Dahlberg, C., Bergstrom, M., Andreasen, M., Christensen, B. B., Molin, S., Hermansson, M. Interspecies bacterial conjugation by plasmids from marine environments visualized by gfp expression. Mol Biol Evol. 15 (4), 385-390 (1998).

Play Video

Cite This Article
Erdogan, F., Lento, C., Yaseen, A., Nowroozi-Dayeni, R., Kheyson, S., Audette, G. F. Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation. J. Vis. Exp. (119), e54854, doi:10.3791/54854 (2017).

View Video