JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Konjugativ Parning Analyser för sekvensspecifik analys av Transfer proteiner involverade i konjugation

Published: January 04, 2017
doi:
10.3791/54854
, , , , ,
1Department of Chemistry,York University, 2The Centre for Research on Biomolecular Interactions,York University

Summary

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Abstract

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Introduction

Överföringen av gener och proteiner i mikroorganismnivå spelar en central roll i bakteriell överlevnad och utveckling samt infektionsprocesser. Utbyte av DNA mellan bakterier eller mellan en bakterie och en cell kan uppnås genom transformation, konjugation eller vektor transduktion. 1,2 Konjugation är unik i jämförelse med transformation och transduktion av att under konjugering mellan gramnegativa bakterier såsom Escherichia coli, sker överföringen av DNA i en donator-kontrollerat sätt varigenom ett komplex makromolekylärt system ansluter donator- och mottagarceller. Konjugation är också det mest direkta sättet på vilket bakterieceller interagerar med värdceller för att injicera gener, proteiner eller kemikalier i till värdsystem. 3 Ganska ofta, överföring av sådana medel har anmärkningsvärda effekter på värden, som sträcker sig från patogenes och cancer att vara värd evolution och anpassning. Det har visats att konjugativ recombination ökar graden av anpassning 3-faldigt i bakterier med höga mutationshastigheter under förhållanden av miljöstress. 4 Dessutom är konjugering i särklass vanligaste vägen genom vilken antibiotikaresistensgener i bakteriestammar sprids. 5,6

Mikroorganismer har utvecklats specialiserade sekretionssystem för att stödja överföring av makromolekyler över cellmembran; Det finns för närvarande 9 typer av sekretionssystem (TSSs) i gramnegativa bakterier som har beskrivits: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, liksom Sec (utsöndring) och Tat (två-arginin translokation) vägar. 7,8 Varje typ av sekretionssystemet är indelad i olika undertyper, en nödvändighet på grund av mångfalden av proteiner och särskiljningsförmåga involverade i olika bakteriestammar. Till exempel i den typ IV sekretionssystem (T4SS), Ti och Cag system underlättar effektor transport medan F-plasmiden, R27 ennd pKM101 T4SSs underlätta överföring av en konjugativ plasmid. 7,9,10 En detaljerad förståelse av de mekanismer genom vilka organismer monterar sina respektive sekretionssystem från sina komponentproteiner och dela cellulära innehåll med en mottagare eller deras omgivning är en viktig faktor i utvecklingen av riktade strategier för att bekämpa patogena mikroorganismer och processer cellulär infektion.

Efter den inledande identifieringen konjugation i E. coli av Lederberg & Tatum, 11 ett stort antal mobila och konjugering plasmider har identifierats och karakteriserats. 12 Sådana mobila plasmider visar avsevärt område är storlek (från 1 till över 200 kilobaser (kb)), men alla mobila plasmider innehåller en relaxase, som erkänner ursprung överföring (oriT) varigenom överföring av plasmiden. Konjugering plasmider ytterligare kodar gener för hopsättning av en funktionell T4SS samt en typIV kopplingsprotein. 12 Till exempel 100 kb F plasmiden av E. coli kodar alla konjugering gener inom en 33,3 kB transfer (tra) region. 13 Generna i tra regionen av F-plasmiden koda alla proteiner som underlättar pilus bildande, parning parbildning (MPF), DNA-överföring och uteslutnings funktioner under konjugativ plasmid överföring. 10,14,15 En betydande mängd kunskap är tillgänglig för konjugativ T4SSs dock detaljerade strukturstudier av konjugering proteiner och komplex endast nyligen blivit tillgängliga. 16-28

För att montera en heltäckande bild av konjugativ processen, krävs en koppling detaljerade strukturstudier att mutationsanalyser av konjugering överföringsproteiner. Detta kan uppnås genom konjugering passande analyser. För F-plasmiden, varvid varje protein som kodas inom tra regionen spelar en roll i F-medierad conjugation; Därför kommer knockout / radering av en genöverföring avskaffa konjugativ kapacitet av cellen (Figur 1). Medan mindre mobila plasmider är mer gynnsam för standardförfaranden radering, för större konjugering plasmider såsom F, är genen knockouts mer lätt uppnås via homolog rekombination, där målgenen är ersatt med en transport av en distinkt gen för antibiotikaresistens. I det nuvarande protokollet, använder vi homolog rekombination för att ersätta en genöverföring av intresse med kloramfenikolacetyltransferas (CAT) i 55 kb F plasmidderivat pOX38-Tc; 29,30 den resulterande knockout-plasmiden, pOX38-Tc Δgene :: Cm underlättar motstånd mot förekomst av kloramfenikol (Cm) i tillväxtmediet. Donatorceller som härbärgerar pOX38-Tc Δgene :: Cm är oförmögna att påverka konjugativ DNA-överföring / parning såsom observeras genom användning av en passande analys; parnings effektiviteten hos en pOX38-Tc Δgene :: Cm donatorcell och en normal recipient kommer att minska eller, oftare, avskaffas. Konjugativ överföring av pOX38-Tc Δgene :: Cm plasmid kan återställas via en liten återhämtning plasmid riktade genöverföring. Denna återhämtning plasmid kan vara en som ger konstitutiv expression, såsom plasmiden pK184 (pK184-gen), 31 eller ett som ger inducerbar expression så länge som denna plasmid är inriktad på rätt sätt den gen till rätt läge inuti cellen (cytoplasman eller periplasman). Följaktligen i passande analyser mellan denna nya givare (hyser pOX38-Tc Δgene :: Cm + pK184-gen-plasmider) och en mottagare cell är parnings effektivitet förväntas återställa nästan som en normal givare och mottagare parning analys. Detta system gör det möjligt för en att sondera funktion av den utslagna genen genom generering av en serie av pK184-genkonstruktioner (deletioner eller punktmutationer) och testa varje konstruktion förmåga att återupprätta den hoppassande kapaciteten hos pOX38-Tc Δgene :: Cm hysande donatorcells.

Protocol

1. Framställning av DNA-konstruktioner Utforma Oligomerer för homolog rekombination av målgenen Utforma ett enhetligt 55-72 bp framåt oligomer enligt följande: (a) välja en 19-32 bp lång nukleotidsekvens som är homolog med en DNA-sekvens i regionen 10-100 bp uppströms om 5 'startstället för kloramfenikolacetyltransferasgenen i den kommersiella pBAD33 plasmiden, 32 och (b) välja ett 36-54 bp lång nukleotidsekvens homolog med en region 10-150 bp nedströms o…

Representative Results

Processen för F-plasmid-driven konjugation är en koordinerad process som involverar överföringsproteiner inom tra regionen av F-plasmid som monterar en T4SS att underlätta pilus syntes och konjugativ DNA-överföring. Proteinet TRAF (GenBank anslutning # BAA97961, UniProt ID P14497) krävs för konjugativ F-pilus bildande. 10,14,35 – 37 Proteinet innehåller en C-terminal tioredoxin-liknande domänen, även om det inte har den katalytiska CX…

Discussion

Konjugation process bildar ett medel med vilka bakterier kan spridas gener som ger en evolutionär fördel för tillväxten i krävande miljöer, såsom spridning av antibiotikaresistensmarkörer. Eftersom många av de konjugering plasmider är så stor, 12 funktionella studier på proteiner som är involverade i montering av överföringsapparaten genom mutation av målgener på konjugativ plasmiden själv är otymplig. De protokoll som beskrivs häri tillhandahåller ett medel med vilket en kan lättare bed…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna forskning stöds av en Discovery Grant från Naturvetenskaps & Engineering Council of Canada (NSERC).

Materials

GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit Fisher Scientific K0503
GeneJet Gel Extraction Kit Fisher Scientific K0692
GeneJet PCR Purification Kit Fisher Scientific K0702
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit New England Biolabs E0554S
Broad Range DNA Ladder New England Biolabs N0303A
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875713
Electroporator Eppendorf 4309000027
Electroporation cuvettes Fisher Scientific FB101 Cuvettes have a 1 mm gap.
Enzymes
AvaI New England Biolabs R0152S
EcoRI New England Biolabs R0101S
HindIII New England Biolabs R0104L
NdeI New England Biolabs R0111S
Phusion DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S
DpnI New England Biolabs R0176S
Antibiotics Final Concentrations
Chloramphenicol (Cm) Fisher Scientific BP904-100 20 µg/mL
Kanamycin (Km) BioBasic Inc. DB0286 50 µg/mL
Nalidixic acid (Nal) Sigma-Aldrich N8878-25G 10 µg/mL
Rifampicin (Rif) Calbiochem 557303 20 µg/mL
Tetracycline (Tc) Fisher Scientific BP912-100 10 µg/mL
Streptomycin (Sm) Fisher Scientific BP910-50 50 µg/mL
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dobrindt, U., Hochhut, B., Hentschel, U., Hacker, J. Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms. Nat Rev Microbiol. 2 (5), 414-424 (2004).
  2. Furuya, E. Y., Lowy, F. D. Antimicrobial-resistant bacteria in the community setting. Nat Rev Microbiol. 4 (1), 36-45 (2006).
  3. Griffiths, A., Miller, J., Suzuki, D., Lewontin, R., Gelbart, W. . An Introduction to Genetic Analysis, 7th Edition. , (2000).
  4. Cooper, T. F., Barton, N. H. Recombination Speeds Adaptation by Reducing Competition between Beneficial Mutations in Populations of Escherichia coli. PLoS Biol. 5 (9), 225 (2007).
  5. Lujan, S. A., Guogas, L. M., Ragonese, H., Matson, S. W., Redinbo, M. R. Disrupting antibiotic resistance propagation by inhibiting the conjugative DNA relaxase. Proc Natl Acad Sci. 104 (30), 12282-12287 (2007).
  6. Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
  7. Shala, A., Ferraro, M., Audette, G. F., Bawa, R., Audette, G. F., Rubenstein, I. Bacterial Secretion Systems: Nanomachines for Infection and Genetic Diversity. Handbook of Clinical Nanomedicine: Nanoparticles, Imaging, Therapy and Clinical Applications. , 657-686 (2016).
  8. Tseng, T. T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 2 (2009).
  9. Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
  10. Lawley, T. D., Klimke, W. A., Gubbins, M. J., Frost, L. S. F factor conjugation is a true type IV secretion system. FEMS Microbiol Lett. 224 (1), 1-15 (2003).
  11. Lederberg, J., Tatum, E. L. Gene Recombination in Escherichia Coli. Nature. 158 (4016), 558-558 (1946).
  12. Smillie, C., Garcillan-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P. C., de la Cruz, F. Mobility of Plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
  13. Willetts, N., Skurray, R. The Conjugation System of F-Like Plasmids. Annu Rev Genet. 14 (1), 41-76 (1980).
  14. Frost, L. S., Ippen-Ihler, K., Skurray, R. A. Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the F sex factor. Microbiol Rev. 58 (2), 162-210 (1994).
  15. Audette, G. F., Manchak, J., Beatty, P., Klimke, W. A., Frost, L. S. Entry exclusion in F-like plasmids requires intact TraG in the donor that recognizes its cognate TraS in the recipient. Microbiology. 153, 442-451 (2007).
  16. Christie, P. J., Atmakuri, K., Krishnamoorthy, V., Jakubowski, S., Cascales, E. Biogenesis, Architecture, and Function of Bacterial Type Iv Secretion Systems. Annu Rev Microbiol. 59 (1), 451-485 (2005).
  17. Christie, P. J. Type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems. Biochim Biophys Acta – Mol Cell Res. 1694 (1-3), 219-234 (2004).
  18. Bhatty, M., Laverde Gomez, J. a., Christie, P. J. The expanding bacterial type IV secretion lexicon. Res Microbiol. 164 (6), 620-639 (2013).
  19. Christie, P. J., Cascales, E. Structural and dynamic properties of bacterial Type IV secretion systems (Review). Mol Membr Biol. 22 (1-2), 51-61 (2005).
  20. Christie, P. J. Type IV secretion: Intercellular transfer of macromolecules by systems ancestrally related to conjugation machines. Mol Microbiol. 40 (2), 294-305 (2001).
  21. Christie, P. J., Whitaker, N., González-Rivera, C. Mechanism and structure of the bacterial type IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1578-1591 (2014).
  22. Cascales, E. The type VI secretion toolkit. EMBO Rep. 9, 735 (2008).
  23. Silverman, J. M., Brunet, Y. R., Cascales, E., Mougous, J. D. Structure and Regulation of the Type VI Secretion System. Annu Rev Microbiol. 66 (1), 453-472 (2012).
  24. Chandran, V., et al. Structure of the outer membrane complex of a type IV secretion system. Nature. 462 (7276), 1011-1015 (2009).
  25. Rivera-Calzada, A., et al. Structure of a bacterial type IV secretion core complex at subnanometre resolution. EMBO J. 32 (8), 1195-1204 (2013).
  26. Waksman, G., Fronzes, R. Molecular architecture of bacterial type IV secretion systems. Trends Biochem Sci. 35, 691 (2010).
  27. Fronzes, R., Christie, P. J., Waksman, G. The structural biology of type IV secretion systems. Nat Rev Microbiol. 7 (10), 703-714 (2009).
  28. Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12 (7), 5-9 (2015).
  29. Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. Identification of a sex-factor-affinity site in E. coli as gamma delta. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 45, 135-140 (1981).
  30. Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
  31. Jobling, M. G., Holmes, R. K. Construction of vectors with the pl5a replicon, kanamycin resistance, inducible lacZα and pUC18 or pUC19 multiple cloning sites. Nucleic Acids Res. 18 (17), 5315 (1990).
  32. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose P(BAD) promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
  33. Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5978-5983 (2009).
  34. Lawley, T. D., Gilmour, M. W., Gunton, J. E., Standeven, L. J., Taylor, D. E. Functional and Mutational Analysis of Conjugative Transfer Region 1 (Tra1) from the IncHI1 Plasmid R27. J Bacteriol. 184 (8), 2173-2180 (2002).
  35. Elton, T. C., Holland, S. J., Frost, L. S., Hazes, B. F-Like Type IV Secretion Systems Encode Proteins with Thioredoxin Folds That Are Putative DsbC Homologues. J Bacteriol. 187 (24), 8267-8277 (2005).
  36. Hazes, B., Frost, L. Towards a systems biology approach to study type II/IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1778, 1839-1850 (2008).
  37. Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F., Tsolis, R. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590 (3), 376-386 (2016).
  38. Audette, G. F., Van Schaik, E. J., Hazes, B., Irvin, R. T. DNA-binding protein nanotubes: Learning from nature’s nanotech examples. Nano Lett. 4, 1897-1902 (2004).
  39. Harris, R. L., Silverman, P. A. Tra proteins characteristic of F-like type IV secretion systems constitute an interaction group by yeast two-hybrid analysis. J Bacteriol. 186 (16), 5480-5485 (2004).
  40. Moore, D., et al. Characterization of the F-Plasmid Conjugative Transfer Gene traU. J Bacteriol. 172 (8), 4263-4270 (1990).
  41. Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
  42. Klimke, W. A., Frost, L. S. Genetic analysis of the role of the transfer gene, traN, of the F and R100-1 plasmids in mating pair stabilization during conjugation. J Bacteriol. 180 (16), 4036-4043 (1998).
  43. Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69 (1), 209-228 (2015).
  44. Dahlberg, C., Bergstrom, M., Andreasen, M., Christensen, B. B., Molin, S., Hermansson, M. Interspecies bacterial conjugation by plasmids from marine environments visualized by gfp expression. Mol Biol Evol. 15 (4), 385-390 (1998).

Tags

Conjugative Mating AssaysTransfer ProteinsBacterial ConjugationType Four Secretion ComplexHomologous RecombinationPBAD33 PlasmidCat CassettePCR AmplificationElectrocompetent DY330R CellsPOX38-Tc Plasmid

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Erdogan, F., Lento, C., Yaseen, A., Nowroozi-Dayeni, R., Kheyson, S., Audette, G. F. Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation. J. Vis. Exp. (119), e54854, doi:10.3791/54854 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image