Summary
Vi beskriver her en optimeret protokol af fluorescerende elektroforetisk mobilitet Shift Analyser (FEMSA) ved hjælp af oprensede SOX-2 proteiner sammen med infrarøde fluorescerende farvestof-mærkede DNA-prober som en case til at tackle en vigtig biologisk spørgsmål.
Abstract
Elektroforetisk mobilitet ændring-assays (EMSA) er en instrumental værktøj til at karakterisere de interaktioner mellem proteiner og deres mål-DNA-sekvenser. Radioaktivitet har været den fremherskende metode til DNA-mærkning i EMSAs. Men de seneste fremskridt inden for fluorescerende farvestoffer og scanningsmetoder bedt brugen af fluorescerende tagging af DNA som et alternativ til radioaktivitet for fordelene ved nem håndtering, hvilket sparer tid, reducere omkostningerne og forbedre sikkerheden. Vi har for nylig brugt fluorescerende EMSA (FEMSA) til succes løse en vigtig biologisk spørgsmål. Vores Femsa analyse giver mekanistisk indsigt i virkningen af en missense-mutation, G73E, i stærkt konserverede HMG transkriptionsfaktor SOX-2 på olfaktoriske neuron typen diversificering. Vi fandt, at mutante SOX-2 G73E protein ændrer specifik DNA bindingsaktivitet, hvorved olfaktoriske transformation neuron identitet. Her præsenterer vi en optimeret og omkostningseffektiv trin-for-trin-protokolfor FEMSA bruger infrarød fluorescerende farvestof-mærkede oligonukleotider indeholder LIM-4 / SOX-2 tilstødende target sites og oprensede SOX-2-proteiner (WT og mutant SOX-2 G73E proteiner) som et biologisk eksempel.
Introduction
EMSAs bruges til at analysere interaktioner mellem DNA og proteiner ved hjælp af nativ polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) for at løse en blanding af et protein af interesse og et mærket DNA probe, der indeholder potentielle målsteder af proteinet 1. En DNA-probe bundet med protein migrerer langsommere sammenlignet med en fri DNA-probe, og er derfor forsinket i sin vandring gennem en polyacrylamidmatrix. Radiomærkning af DNA ved 32 P har været den fremherskende metode til påvisning i EMSAs. Selvom anvendelsen af radioaktiv mærkning i biokemisk forskning har været gavnlig, er metoder til alternativ DNA-mærkning med sammenlignelig følsomhed er ansat på grund af de sikkerheds- og sundhedsmæssige risici forbundet med håndtering af radioaktivitet. Disse alternative fremgangsmåder indbefatter konjugering af DNA med biotin 2 eller digoxigenin (DIG) 3 (begge er derefter detekteret ved kemiluminescens systemer), SYBR green farvning af PAGE-geler 4,eller direkte påvisning af DNA-fluorescerende farvestof-konjugater ved at scanne gelen 5,6.
De opløste geler af EMSAs bruger radioaktivt mærkede DNA-prober kræver postrun behandling gennem autoradiografi film eller et phosphorimager system til at detektere radioaktive signaler 1,7. Geler af EMSAs under anvendelse af biotin- 2 eller DIG-konjugerede 3 DNA-prober skal også behandles og overføres til en egnet membran og derefter detekteret ved kemiluminescens 6. SYBR green farvning af gelen kræver postrun gelfarvning og en fluorescerende scanner 4. Da der kræves postrun gel procestrin for EMSAs bruger disse DNA-teknikker mærkning, kan det løses gel analyseres én gang. I modsætning hertil kan DNA-prober mærket med fluoroforer detekteres direkte i gelen inde glaspladerne af en scanner. Derfor kan DNA-protein-interaktioner overvåges og analyseres flere gange på forskellige tidspunkter under kørslen, hvilketreducerer tid og omkostninger betydeligt. De DNA-fluorescerende farvestof konjugater, der har været anvendt til EMSAs indbefatter Cy3 6,8, Cy5 6,8, fluorescein 9, og infrarøde fluorescerende farvestoffer 4-6.
Transkriptionel regulering kræver protein-DNA interaktioner af transkriptionsfaktorer og deres målgener. Koordinering af disse interaktioner genererer forskellige celletyper fra en fælles stamfader under dyr udvikling. En neutral frem genetisk skærm identificeret en missense-mutation, G73E, i stærkt konserverede HMG DNA-bindende domæne af Caenorhabditis elegans transkriptionsfaktor SOX-2. De mutationen resulterer i en celle identitet transformation af AWB olfaktoriske neuroner i AWC olfaktoriske neuroner på molekylære, morfologiske og funktionelle niveauer 5,10. SOX-2 differentielt regulerer terminal differentiering af AWB og AWC neuroner ved at interagere med kontekstafhængige partner transkriptionsfaktorer og respektiveDNA målsteder 5,10. SOX-2 partnere med LIM-4 (LHX) i klemme AWB neuronal differentiering, mens SOX-2 partnere med CEH-36 (OTX / OTD) i terminal AWC neuronal differentiering. Luciferasereporteren analyser viser, at SOX-2 og mutant SOX-2 G73E proteiner har kooperative interaktioner med transkriptionelle cofaktorer LIM-4 og CEH-36 for at aktivere en promotor udtrykt i AWB og AWC neuroner. Imidlertid SOX-2 og mutant SOX-2 G73E vises forskellen aktiveringsegenskaber af promotoren. For at undersøge den molekylære basis for differential DNA-bindende aktiviteter SOX-2 og SOX-2 G73E, blev fEMSAs udført med disse proteiner og deres potentielle målsteder.
Først blev en bioinformatik tilgang til at identificere det biologisk relevante DNA-bindende sekvenser inden for 1 kb promotorområde anvendt i luciferase assay. Da flere potentielle SOX-2 bindingssteder var til stede under hele promotor, vi fokuseredepå forudsagte SOX-2 bindingssteder støder op til putativ CEH-36 eller LIM-4 bindingssteder og evolutionært konserveret mellem forskellige nematodearter. Disse sekvenser blev slettet eller muteret, og efterfølgende testet in vivo for deres aktivitet til at udtrykke GFP reporter transgener i AWB eller AWC neuroner. Gennem denne fremgangsmåde identificerede vi potentielle LIM-4 / SOX-2 og CEH-36 / SOX-2 tilstødende målsteder, som er specifikt nødvendige for ekspression af GFP i AWB og AWC neuroner, henholdsvis 5. Vi undersøgte de potentielle forskelle i DNA-binding af SOX-2 og SOX-2 G73E hjælp Femsa med de identificerede LIM-4 / SOX-2 og CEH-36 / SOX-2 tilstødende målsteder. Vores EMSA analyse viste, at SOX-2 G73E ikke binde DNA-proben indeholder LIM-4 / SOX-2 tilstødende målsteder (kræves for genekspression i AWB) så effektivt som WT SOX-2 gjorde. Dog SOX-2 og SOX-2 G73E havde ingen forskel i binding af DNA-proben indeholdende det CEH-36 / SOX-2 adjacent målsted (kræves til genekspression i AWC) 5,10. Vores Femsa analyser give mekanistisk indsigt i beskaffenheden af SOX-2 G73E-mutationen i at påvirke specifikke DNA-bindingsaktivitet for AWB-til-AWC celleidentitet transformation fænotype. Her beskriver vi en optimeret protokol FEMSA anvendelse af oprensede 6xHis-SOX-2 eller 6xHis-SOX-2 G73E sammen med infrarød fluorescerende farvestof-mærkede DNA-prober indeholdende LIM-4 / SOX-2 tilstødende målsteder som case til at tackle en vigtig biologisk spørgsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: EMSAs vha fluorescensmærkede DNA-prober eller andre former for mærket DNA deler de samme protokoller til protein eller celleekstrakt præparat, protein-DNA bindingsreaktionen, og PAGE gel forberedelse og kører (figur 1A). De vigtigste forskelle er DNA-procedurer mærkning, post-run gel procestrin, og påvisningsmetoder.
1. Gel Fremstilling
- Forbered 5% nativ polyacrylamidgel indeholdende 0,5 x TBE (45 mM Tris-borat, 1 mM EDTA) og 2,5% glycerol, ved anvendelse af en mini-protein gel-system (8,3 cm bredde x 7,3 cm længde x 0,75 mm tykkelse).
- Til fremstilling 30 ml gelopløsning til 4 geler, bland 5 ml 30% acrylamid / bis (37,5: 1), 3 ml 5x TBE (0,45 M Tris-borat, 10 mM EDTA), 1,5 ml 50% glycerol, 300 pi 10% ammoniumpersulfat, 15 pi TEMED, og 20,2 ml Hedeselskabet 2 O grundigt.
BEMÆRK: Akrylamid er skadeligt og giftigt, håndtag med passende personlige værnemidler. - Kast gel løsning med det samme. Efter polymerisering, wrap geler i klar plast wrap pre-fugtet med 0,5x TBE og opbevare dem ved 4 ° C.
2. Fremstilling af infrarød fluorescerende farvestof-mærkede prober
BEMÆRK: Hold de infrarøde fluorescerende farvestof-mærkede oligonukleotider væk fra lys så meget som muligt under forberedelse, opbevaring og eksperimenter.
- Design og bestil oligonukleotider.
- Design lange oligonukleotid for ~ 51-mer.
BEMÆRK: Den lange oligonucleotidsekvens af LIM-4 / SOX-2 sonden er TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC. Lange oligonucleotider kræver ikke PAGE eller HPLC-oprensning. - Design komplementære korte oligonukleotider til ~ 14-merer med infrarødt fluorescerende farvestof modifikation ved 5'-terminalen (5'Dye) og en smeltetemperatur over 37 ° C.
BEMÆRK: Den korte oligonukleotidsekvens af LIM-4 / SOX-2 sonden er 5'Dye-GGGAGAAGATTTTG. Den mindste syntese omfanget af 5'Dye-mærkede korte oligonukleotider er 100 nM. Derfor oligonukleotiderne kræver HPLC-oprensning.
- Design lange oligonukleotid for ~ 51-mer.
- Resuspender oligonukleotider i 1x Tris-EDTA-puffer (TE: 10 mM Tris-HCI, pH 8,0; 1 mM EDTA) til en slutkoncentration på 100 uM.
- Anneal Short (5'Dye) og lange oligonukleotider.
- Bland 0,6 pi 5'Dye-Short oligo (100 uM), 1,2 pi Long oligo (100 uM), og 28,2 pi natriumchlorid-Tris-EDTA-buffer (STE: 100 mM NaCI; 10 mM Tris-HCI, pH 8,0; 1 mM EDTA) i et 1,5 ml rør.
- Glasset anbringes i kogende vand i 5 minutter. Sluk varmekilden og lad vandet med de annealede oligoer køle O / N i mørke.
- Udfylde 5'-fremspringene annealede 5'Dye-kort / lang oligoer med Klenow DNA-polymerase for at gøre dobbeltstrengede DNA-prober.
- Forbered reaktionen ved at blande30 pi annealede korte / lange oligoer med 5'Dye tag, 8,5 pi 10x Klenow-puffer, 1,7 pi 10 mM dNTP'er, 1,7 pi Klenow (3 '-> 5' exo) (5 U / pl), og 43,1 uL af Hedeselskabet 2 O i et 0,2 ml PCR-rør.
- Inkuber 60 min ved 37 ° C i en PCR-maskine.
- Tilføj 3.4 pi 0,5 M EDTA for at standse reaktionen og varmeinaktiveres ved 75 ° C i 20 minutter i en PCR-maskine.
- Fortynd udfyldte prober (0,7 uM) i STE til slutkoncentration på 0,1 uM.
- Opbevar oligoer ved -20 ° C i mørke, indtil klar til brug. Oligoer kan opbevares i op til et år i denne tilstand.
BEMÆRK: For at generere DNA-prober med mutant bindingssteder, der muterede versioner af lange oligonukleotider udglødet med 5'Dye-mærkede korte oligonukleotider, efterfulgt af fill-in af 5 'overhæng med Klenow. Det er blevet vist, at sonden med én streng mærket med et infrarødt fluorescerendefarvestof har kun 30% intensitet af sonden med begge strenge mærket med farvestoffet. Hvis signal intensitet skal styrkes, er lange oligoer af begge strenge mærket med infrarød fluorescerende farvestoffer ved 5 'termini og afhærdet at gøre infrarød fluorescerende farvestof-mærkede prober.
3. Forberedelse af umærket / Kolde Probes (Konkurrenter)
Bemærk: Lange oligonukleotider med komplementære sekvenser (Lange og longr) blev udglødet at gøre umærkede sonder for konkurrence analyse med infrarød fluorescerende farvestof-mærkede prober.
- Bland 20 pi 100 uM Long, 20 pi 100 uM longr oligonukleotider, og 60 pi STE i et 1,5 ml rør.
- Glasset anbringes i kogende vand i 5 minutter, slukke for varmekilden og lad vandet med de annealede oligoer køle natten over.
4. bindingsreaktion og Elektroforese
- Forbered 1 ml 5x bindingsbuffer ved blanding 50 pi60; 1 M Tris-HCI, pH 7,5; 10 pi af 5 M NaCl; 200 pi 1 M KCI, 5 pi 1 M MgCl2, 10 pi 0,5 M EDTA, pH 8,0; 5 pi 1 M DTT; 25 pi 10 mg / ml BSA, og 695 pi Hedeselskabet 2 O.
BEMÆRK: 5x Binding Buffer kan alikvoteret og opbevaret ved -20 ° C. Et andet punkt at overveje er, at forskellige transkriptionsfaktorer vil have forskellige modifikationer af bindende buffer. - Lige før opsætning bindende reaktioner, pre-køre 5% indfødte polyacrylamid gel i 0,5x TBE + 2,5% glycerol til at fjerne alle spor af ammonium persulfat ved 80 V i 30 - 60 min, eller indtil den aktuelle ikke længere varierer med tiden.
- Opsætning bindingsreaktionen i den endelige volumen på 20 uL.
- Bland 4 pi 5x bindingsbuffer, 80 - 200 ng oprenset protein A (i 50% glycerol, dvs. SOX-2), 1 pi 0,1 uM Dye-konjugeret sonde (slutkoncentrationentration: 5 nM), og Hedeselskabet 2 O.
- Valgfrit: Når der kræves kolde probe konkurrenter, tilføje forskellige koncentrationer (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, etc.) af kolde sonder.
- Valgfrit: Når interaktionen mellem proteiner A og B (dvs. SOX-2 og LIM-4) testes, tilsættes 80 - 200 ng oprenset protein B (i 50% glycerol, dvs. LIM-4).
- Valgfrit: Når der anvendes kerneekstrakt forberedelse og specifik binding af protein A, der skal valideres, tilsæt antistof specifikt til protein A (dvs. anti-6xHis, anti-FLAG, etc.).
- Inkuber ved R / T i mørke i 15 min.
- Indlæse alle de bindingsreaktion på gelen og køre gelen ved 10 V / cm til ønskede afstand.
5. Imaging
BEMÆRK: Gelen blev scannet direkte i glaspladerne med en avanceret infrarød billeddannelse system. Derfor kan gelen løses længere og scannes gentagne gange (figur 1C og
- Rengør sengen af scanneren med Hedeselskabet 2 O og tør godt før scanning. Tør tørre glasplader gelen og placere plader, der indeholder gelen på scannerpladen.
- Åbn infrarød billeddannelse software og gå til fanen "Acquire". Når tyndere plade (1 mm) er placeret på scanneren sengen, skal du bruge indstillingerne for Channel: 700, Intensitet: Auto, Opløsning: 169 um, Kvalitet: medium, og Focus offset: 1,5 mm. Når tykkere plade (3 mm) er placeret på scanneren sengen, skal du bruge indstillingerne for Channel: 700, Intensitet: Auto, Opløsning: 84 pm, Kvalitet: medium, og Focus offset: 3,5 mm. Fokus offset afhænger aftykkelse af glaspladen.
- Vælg det område, at gelen optager på scanneren. Klik på 'Start' for at starte scanningen.
- Gentag elektroforese og scanne derudover efter behov.
- Til fremstilling 30 ml gelopløsning til 4 geler, bland 5 ml 30% acrylamid / bis (37,5: 1), 3 ml 5x TBE (0,45 M Tris-borat, 10 mM EDTA), 1,5 ml 50% glycerol, 300 pi 10% ammoniumpersulfat, 15 pi TEMED, og 20,2 ml Hedeselskabet 2 O grundigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Orange G loading dye (6x: 0,12 g orangefarvet G i 100 ml 30% glycerol) kan tilsættes til bindingsreaktionen før påsætning at visualisere forløbet af elektroforese. Andre lastning farvestoffer herunder bromphenolblåt vil blive opdaget under scanningen, og derfor forstyrrer billedanalyse (figur 1B).
I nogle tilfælde af EMSAs, især hvis der anvendes kerneekstrakt forberedelse, poly deoxyinosinic-deoxycytidylic (di-dC) er inkluderet i bindingsreaktionen at mindske ikke-specifik binding af proteiner til DNA 11. , 50 ug / ml Dl-dC afskaffet imidlertid bindingen af oprensede 6xHis-SOX-2 med 5'Dye DNA-prober (figur 1b).
For at vise bindingsspecificitet af de infrarøde fluorescerende farvestof-mærkede DNA-prober, vi brugte WT eller mutant kolde sonder som konkurrenter (
Bindingsspecificiteten af proteiner, kan bestemmes ved udførelse supershift assays af protein-DNA interaktion under anvendelse af antistoffer specifikke for proteinerne eller tags, især når præparatet kerneekstrakt anvendes til assayet 1. SOX-2 blev mærket med 6xHis og FLAG epitoper. Tilsætning af 1 ug anti-6xHis eller 2,5 ug anti-FLAG M2 Antibo matricer resulteret i et supershift SOX-2-DNA-bånd (fig 2).
Figur 1. FEMSA hjælp Infrarød fluorescerende farvestof-mærkede oligonukleotider. (A) Flow diagram af FEMSA. (B) Effekten af bromphenolblåt farvestof, orange G, og di-dC (1 pg) på FEMSA. 5 nM 5'Dye-LIM-4 / SOX-2-probe blev anvendt. (C) Femsa viser bindingsspecificitet af 6xHis-SOX-2 G73E til SOX-2 målsted af LIM-4 / SOX-2 element. 5 nM 5'Dye-LIM-4 / SOX-2-probe blev anvendt. LIM-4 / SOX-2 (M), mutante målsteder. Gelerne blev scannet ved 20 og 40 min efter elektroforese. Det scannede billede opnået ved 40 min efter elektroforese blev anvendt til at kvantificere den fluorescerende bånd intensitet, som blev normaliseret ved intensiteten af lane uden kold probe. AU, vilkårlig enhed.ource.jove.com/files/ftp_upload/54863/54863fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. supershift Analyser af SOX-2-DNA Complex hjælp FEMSA og antistoffer. SOX-2 blev mærket med både 6xHis og FLAG epitoper. Tilsætning af anti-6xHis eller anti-FLAG-antistoffer forårsagede en supershift af SOX-2-DNA-kompleks. 5'Dye-LIM-4 / SOX-2-probe blev anvendt. Gel billeder blev splejset mellem bane 2 og 3 for at udelukke irrelevante baner. Gelen blev scannet ved 40, 60, og 90 min efter elektroforese. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
fEMSAs er et effektivt værktøj til at undersøge protein-DNA interaktioner, og er et alternativ til radioaktiv mærkning af DNA. Fluorescerende farvestoffer, såsom infrarøde farvestoffer er kommercielt tilgængelige, og giver en mere sikker og miljøvenlig metode sammenlignet med radioaktivt DNA-mærkning. EMSAs med infrarøde stråler fluorescerende farvestof-mærkede oligonukleotider kræver ikke postrun gel behandlingstrin, og derfor spare tid og omkostninger i forhold til andre DNA-mærkning teknikker. Tiden til at detektere bånd vha radioaktive EMSAs kan variere fra 30 min til adskillige dage, afhængigt af radioaktivitet og koncentration af de testede 1 DNA-prober. I modsætning hertil scanning af FEMSA geler tager i gennemsnit 25 min, og derved betydelig reduktion protokol tid. fEMSAs også give en betydelig fordel i forhold radioaktiv mærkning, da gelen ikke behøver at blive fjernet fra glaspladerne til analyse. Dette tillader gelen til scannes igen, hvis den første kørsel tid ikke er tilstrækkeligat løse protein-DNA-komplekser. Muligheden for at udvide elektroforese er ikke tilgængelig ved hjælp af radioaktive isotoper eller biotin / streptavidin. Vigtigst, håndtering af radioaktivt materiale udgør en sikkerhedsrisiko for lab personale, mens fluorescerende mærkning af DNA-sonder ikke er farligt, og kan bortskaffes nemt. Anvendelsen af streptavidin kræver også en længere periode, indtil detektion (ca. 3 timer) 12. Protokollen og resultater præsenteret her viser, at FEMSA er en effektiv og praktisk værktøj for biomedicinsk forskning. Vi har med succes brugt Femsa at tilvejebringe mekanistisk indsigt i virkningen af SOX-2 G73E-mutationen på specifik DNA-bindingsaktivitet, der fører til olfaktoriske neuron identitet transformation 5,10.
I tilfælde af at ingen eller svagt signal detekteres ved analysen af gelen, kan koncentrationen af DNA-proben forøges. DNA-proberne anvendes i vores forsøg er mærket med et infrarødt fluorescerende farvestof på enenkelt streng. Selv om denne fremgangsmåde har fungeret succesfuldt for sonder, vi har testet, er det blevet rapporteret, at fluorescerende mærkning af en enkelt streng har 30% intensitet af prober, der er blevet mærket på begge strenge. Hvis intensitet viser sig at være for lav, anbefales det at mærke begge strenge af DNA-proben med et infrarødt fluorescerende farvestof. Hvis der ikke observeres flyttet bands, kan protein-DNA-kompleks være ustabil. Glycerol er afgørende i denne protokol til at stabilisere protein-DNA interaktioner. Glycerol er inkluderet i støbte geler, bindingsreaktionen, og løbebufferen. Et andet punkt i betragtning er valg af farvestof ved sporing progression af prøver gennem gelen under kørslen. Orange G er ideel til dette formål som andre typer af lastning farvestoffer såsom bromphenolblåt kan forstyrre scanning af gelen. Prerunning gelen er også vigtigt at sikre ammoniumpersulfat fjernes fra før isætning af prøver gelen. Desuden kan anvendelse af poly dI-dC forstyrre binding eng af proteinet af interesse med DNA-proben i fEMSAs. Renhed af proteinet af interesse og mål-DNA integritet er også vigtigt for deres interaktion. Det er også vigtigt at sikre korrekte scanningsindstillinger ved brug af imaging software. Den passende fokus offset og parametre intensitet vælges i overensstemmelse med tykkelsen af gel plader og intensiteten af DNA-prober.
Tidligere protokoller er blevet beskrevet til at udføre fluorescerende EMSAs 13,14. Imidlertid har disse protokoller krævet anvendelse af di-dC, og / eller pumper anvendes til cirkulation vand for at opretholde en bestemt temperatur. Den her beskrevne protokol giver en meget mere detaljeret metode, og kræver ikke brug af pumper.
Fremtidige ansøgninger til denne protokol omfatter overvågning konkurrencemæssige analyser i realtid. Fluorescens-mærkede prober giver os denne ekstra indsigt, som geler kan scannes flere gange på forskellige elektroforese tid points. Desuden kan DNA-prober af interesse og konkurrent sonder mærkes med forskellige infrarøde fluorescerende farvestoffer, der giver mulighed for to-farve billedbehandling. Som med alle teknikker, der er begrænsninger for anvendelse af fluorescerende EMSAs. Højere koncentrationer af protein er brug sammenlignet med traditionelle EMSAs følge af forholdsvis lavere følsomhed. En anden begrænsning er kravet om en specifik billeddannelsessystem med høj opløsning til at detektere den infrarøde fluorescerende farvestof. Selv om den oprindelige pris er høj til at købe scanneren, langvarig brug af infrarødt fluorescerende farvestof mærkning er omkostningseffektiv. På trods af disse begrænsninger, fluorescerende EMSAs en vigtig metode til at behandle betydelige biologiske spørgsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 1610158 | Acrylamide is harmful and toxic. |
| 6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8) | ThermoFisher | MA1-21315 | |
| Anti-Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165-.2MG | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade | New England Biolabs | B9000S | |
| 5'IRDye700-labeled DNA Oligos | Integrated DNA Technologies | Custom DNA oligo | These are referred to as "5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos" in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100 μM scale synthesis and HPLC purification. |
| Klenow Fragment (3'-->5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| LightShif Poly (dI-dC) | ThermoFisher | 20148E | |
| Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | This is referred to as a 'mini protein gel system' in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size. |
| Odyssey CLx Infrared Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey CLx Infrared Imagng System | This is referred to as an 'advanced infrared imaging system' in the manuscript. |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System | This is referred as a 'near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots' in the manuscript. |
| Image Studio software (version 4.0) | LI-COR Biotechnology | Image Studio software | This is referred to as a 'particular imaging software' in the manuscript. |
| Orange G | Sigma-Aldrich | O3756-25G | |
| 6x Orange loading dye | 0.25% Orange G; 30% Glycerol | ||
| 0.5x TBE | 45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA | ||
| 1x TE | 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA | ||
| 1x STE | 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA | ||
| 5x Binding Buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 μg/mL BSA |
References
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions. Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).
- Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations. Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).
- Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels. Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).
- Alqadah, A., et al. Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2. EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).
- Jullien, N., Herman, J. P. LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure. Biotechniques. 51, 267-269 (2011).
- Poulin-Laprade, D., Burrus, V. Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes. Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).
- Ruscher, K., et al. A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay. J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
- Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. Sox2 goes beyond stem cell biology. Cell cycle. , (2016).
- Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins. Biotechniques. 20, 439-444 (1996).
- Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe. Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).
- Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes. Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).
- Steiner, S., Pfannschmidt, T. Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).
