Summary
Здесь мы опишем оптимизированный протокол флуоресцентных электрофоретической подвижности (анализах сдвига FEMSA) с использованием очищенного SOX-2 белки вместе с инфракрасным флуоресцентным красителем-меченых зондов ДНК в качестве примера для решения важный биологический вопрос.
Abstract
Электрофоретической подвижности сдвига анализа (EMSA) являются инструментальным средством для характеристики взаимодействия белков и их последовательностей ДНК-мишени. Радиоактивность была преобладающим методом мечения ДНК в EMSAs. Тем не менее, последние достижения в области флуоресцентных красителей и методы сканирования побудили применение флуоресцентного мечения ДНК в качестве альтернативы радиоактивности за преимущества простоты управления, экономии времени, снижения затрат и повышению безопасности. Недавно мы использовали флуоресцентный EMSA (FEMSA) успешно решать важный биологический вопрос. Наш анализ FEMSA обеспечивает механистического представление о влиянии миссенс-мутации, G73E, в высококонсервативной ГМГ фактора транскрипции SOX-2 по типу нейрон диверсификации обонятельной. Мы обнаружили , что мутантные SOX-2 G73E белок изменяет специфической ДНК связывающей активностью, вызывая тем самым обонятельный нейрон тождественное преобразование. Здесь мы представляем оптимизированные и экономически эффективный шаг за шагом протоколадля FEMSA с помощью инфракрасного флуоресцентного красителя-меченых олигонуклеотидов , содержащих LIM-4 / SOX-2 смежных целевых сайтов и очищенные SOX-2 белки (WT и мутантных SOX-2 G73E белки) в качестве биологического примера.
Introduction
EMSAs используются для анализа взаимодействия между ДНК и белками, используя нативный электрофорезом на геле полиакриламида (СТР) , чтобы разрешить смесь интересующего белка и меченой ДНК зонда , содержащего потенциальные целевые участки белка 1. ДНК-зонд связан с белком будет мигрировать медленнее по сравнению со свободным ДНК-зондом, и, следовательно, задерживается в его миграции через матрицу полиакриламида. Радиоактивной ДНК 32 Р является основным методом для обнаружения в EMSAs. Хотя применение радиомечения в биохимических исследованиях было выгодным, методы альтернативной маркировки ДНК с сопоставимой чувствительностью в настоящее время используются в связи с риском для здоровья и безопасности, связанных с обработкой радиоактивностью. Эти альтернативные методы включают конъюгацию ДНК с биотином 2 или дигоксигенином (DIG) 3 (оба из которых затем детектируется системами хемилюминесцентные), SYBR зеленый окрашивание ДСН 4,или прямое обнаружение ДНК-флуоресцентного красителя конъюгатов путем сканирования геля 5,6.
Разрешенные гели EMSAs с использованием радиоактивно меченых зондов ДНК требуют postrun обработки через авторадиографии пленок или систему Phosphorimager для обнаружения радиоактивных сигналов 1,7. Гели EMSAs с использованием биотин - 2 или DIG-конъюгированные зондов 3 ДНК также должны быть обработаны и переданы на подходящую мембрану , а затем детектируется хемилюминесценции 6. SYBR зеленого окрашивания геля требует postrun геля окрашивания и флуоресцентный сканер 4. Поскольку этапы обработки postrun гель необходимы для EMSAs с помощью этих методов мечении ДНК, разрешенное гель можно анализировать только один раз. В отличие от этого, ДНК-зондов, меченных флуорофоров могут быть непосредственно обнаружены в геле внутри стеклянных пластин с помощью сканера. Таким образом, ДНК-белковых взаимодействий можно контролировать и несколько раз в различные моменты времени оценивали во время бега, котораязначительно сокращает затраты времени и средств. ДНК-флуоресцентный краситель конъюгаты , которые были использованы для EMSAs включают Су3 6,8, Су5 6,8, флуоресцеин 9 и инфракрасные флуоресцентные красители 4-6.
Регуляция транскрипции требует белок-ДНК взаимодействия факторов транскрипции и их генов-мишеней. Координация этих взаимодействий порождает различные типы клеток от общего предка во время развития животных. Объективный вперед генетический экран был выявлен миссенс мутации, G73E, в высоко законсервированной HMG ДНК-связывающим доменом Caenorhabditis фактора транскрипции Элеганс SOX-2. Мутация в трансформации идентичности клеток из AWB обонятельных нейронов в текущем AWC обонятельных нейронов на молекулярном, морфологических и функциональных уровнях 5,10. SOX-2 дифференцированно регулирует терминальную дифференцировку AWB и AWC нейронов путем взаимодействия с контекстно-зависимых факторов транскрипции партнер и соответствующийДНК - мишени сайты 5,10. SOX-2 партнеров с LIM-4 (LHX) в терминале AWB дифференцировки нейронов, в то время как SOX-2 партнеров с ЦВЗ-36 (OTX / ОДТ) в терминале AWC дифференцировки нейронов. Люциферазы анализы показывают , что SOX-2 и мутантные SOX-2 G73E белки имеют кооперативные взаимодействия с транскрипционных кофакторов LIM-4 и ЦВЗ-36 , чтобы активировать промотор , выраженный в AWB и AWC нейронов. Тем не менее, SOx-2 и мутант НОСКОВ-2 G73E отображаются свойства дифференциальной активацию промотора. Для изучения молекулярной основы дифференциальной ДНК - связывающим деятельности SOX-2 и SOX-2 G73E, fEMSAs были выполнены с этими белками и их потенциальных сайтов - мишеней.
Во-первых, биоинформатики подход был использован для идентификации биологически активные к ДНК последовательности в пределах области промотора 1 кб, используемого в анализе люциферазы. Поскольку несколько потенциальных SOX-2 сайты связывания присутствовали на протяжении промотора, мы сфокусировалина предсказанных SOX-2 связывающих участков, прилегающих к предполагаемому ЦВЗ-36 или LIM-4 сайты связывания и эволюционно консервативными между различными видами нематод. Эти последовательности были удалены или мутируют, и затем испытывали в естественных условиях для их деятельности , чтобы выразить GFP репортер трансгенов в AWB или AWC нейронов. Благодаря такому подходу, мы определили потенциальные LIM-4 / SOX-2 и Чех-36-2 SOX соседние целевые сайты /, которые конкретно необходимы для экспрессии GFP в AWB и AWC нейронов, соответственно 5. Мы исследовали потенциальные различия в ДНК связывания SOX-2 и SOX-2 G73E использованием FEMSA с выявленными LIM-4 / SOX-2 и ЦВЗ-36 / SOX-2 смежных целевых сайтов. Наш анализ показал , что EMSA SOX-2 G73E не связывает ДНК - зонд , содержащий LIM-4 / SOX-2 смежных целевых сайтов (необходим для экспрессии генов в AWB) столь же эффективно , как WT SOX-2 сделал. Тем не менее, SOX-2 и SOX-2 G73E не было никакой разницы в связывании ДНК - зонд , содержащий ЦВЗ-36 / SOX-2 аdjacent целевой сайт (необходим для экспрессии генов в AWC) 5,10. Наш FEMSA анализ обеспечивают механистической понимание природы G73E мутации SOX-2 в воздействии специфической ДНК - связывающей активности для идентичности клеточного фенотипа трансформации AWB-к-AWC. Здесь мы опишем оптимизированный протокол FEMSA с использованием очищенных 6xHis-SOX-2 или 6xHis-SOX-2 G73E вместе с ИК - флуоресцентных зондов ДНК красителя-меченый , содержащих LIM-4 / SOX-2 смежных целевых сайтов в качестве тематического исследования для решения важный биологический вопрос.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: EMSAs с использованием флуоресцентно меченых зондов ДНК или другие формы меченой ДНК разделяют одни и те же протоколы для белка или препарата клеточного экстракта, белок-ДНК реакции связывания и подготовки PAGE гель и работает (рис 1А). Основные отличия процедуры ДНК маркировки, этапы обработки геля после бежать, и методы обнаружения.
1. Гель Приготовление
- Готовят 5% геля, содержащего нативный полиакриламидный 0.5x TBE (45 мМ Трис-борат, 1 мМ ЭДТА) и 2,5% глицерина, с использованием мини-гель системы белка (8,3 см ширина х 7,3 см толщина длина х 0,75 мм).
- Для приготовления 30 мл раствора геля для 4 гелей, смешать 5 мл 30% акриламид / бис (37.5: 1), 3 мл 5х КЭ (0,45 М Трис-борат, 10 мМ ЭДТА), 1,5 мл 50% глицерине, 300 мкл 10% персульфата аммония, 15 мкл TEMED, и 20,2 мл DDH 2 O тщательно.
Примечание: акриламид вреден и токсичен, ручка с соответствующими средствами индивидуальной защиты. - Cast раствора геля сразу. После полимеризации, обертывают гели в прозрачной пластиковой пленкой предварительно смачивать 0,5 × КЭ и хранить их при температуре 4 ° С.
2. Получение ИК-флуоресцентным красителем-меченых зондов
Примечание: Держите инфракрасные флуоресцентным красителем-меченных в защищенном от света как можно больше во время приготовления, хранения и экспериментов.
- Дизайн и порядок олигонуклеотиды.
- Дизайн длинный олигонуклеотид в течение ~ 51-меров.
Примечание: Длинная последовательность олигонуклеотида / SOX-2 зонда LIM-4 TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC. Длинные олигонуклеотиды не требуют PAGE или очистки ВЭЖХ. - Разработка дополнительных коротких олигонуклеотидов в течение ~ 14-меров с модификацией красителем инфракрасного флуоресцентного на 5'-конца (5'Dye) и температурой плавления выше 37 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: короткая последовательность олигонуклеотида LIM-4 / SOX-2 зонд 5'Dye-GGGAGAAGATTTTG. Минимальный масштаб синтеза 5'Dye-меченых коротких олигонуклеотидов составляет 100 нМ. Таким образом, олигонуклеотиды требуют очистки ВЭЖХ.
- Дизайн длинный олигонуклеотид в течение ~ 51-меров.
- Ресуспендируют олигонуклеотиды в 1x Трис-ЭДТА буфере (ТЕ: 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0; 1 мМ ЭДТА) до конечной концентрации 100 мкМ.
- Отжиг Short (5'Dye) и длинные олигонуклеотиды.
- Смешайте 0,6 мкл 5'Dye-Short олиго (100 мкМ), 1,2 мкл олиго (Long 100 мкМ), и 28,2 мкл натрия хлорид-трис-ЭДТА буфера (СТЭ: 100 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0; 1 мМ ЭДТА) в 1,5 мл трубки.
- Поместите пробирку в кипящей воде в течение 5 мин. Выключите источник тепла и дайте воде с отожженные олигонуклеотиды охлаждения O / N в темноте.
- Заполните свесами 5 'отожженных 5'Dye-короткий / длинный олигомеров с Кленова ДНК-полимеразы, чтобы двухцепочечные ДНК-зондов.
- Готовят реакцию путем смешивания30 мкл размороженного коротких / длинных олигомеров с 5'Dye теге, 8,5 мкл 10х буфера Кленова, 1,7 мкл 10 мМ дНТФ, 1,7 мкл Кленова (3 '-> 5' экзо-) (5 ед / мкл), и 43,1 мкл DDH 2 O в 0,2 мл ПЦР - пробирку.
- Инкубировать 60 мин при 37 ° С в машине ПЦР.
- Добавить 3.4 мкл 0,5 М ЭДТА, чтобы остановить реакцию, и нагревать инактивированную при 75 ° С в течение 20 мин в машине ПЦР.
- Развести заполненные зондов (0,7 мкМ) в СТЭ для конечной концентрации 0,1 мкМ.
- Храните олигонуклеотиды при -20 ° С в темноте до готовности к использованию. Олигонуклеотиды могут храниться до года в этом состоянии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для создания ДНК-зондов с мутантными сайтами связывания, мутантные варианты длинных олигонуклеотидов отжигали с 5'Dye-меченых коротких олигонуклеотидов, а затем заполняются в 5 'свесы Кленова. Было показано, что зонд с одной цепью маркированы с инфракрасным флуоресцентнымкраситель имеет только 30% интенсивность зонда с обеих нитей, меченные красителем. Если интенсивность сигнала должна быть усилена, длинные олигонуклеотиды обеих нитей помечены с помощью инфракрасных флуоресцентных красителей на 5 'концах и отжигают, чтобы сделать инфракрасный флуоресцентный краситель меченных зондов.
3. Подготовка немеченых / хол Зонды (конкурентный)
Примечание: Длинные олигонуклеотиды комплементарных последовательностей (длинные и LongR) отжигали сделать немаркированные зондов для анализа конкуренции с помощью инфракрасного флуоресцентного красителя-меченых зондов.
- Смешайте 20 мкл 100 мкМ в длину, 20 мкл 100 мкМ LongR олигонуклеотиды, и 60 мкл СТЭ в 1,5 мл трубки.
- Поместите пробирку в кипящей воде в течение 5 минут, выключите источник тепла и дайте воде с отожженные олигонуклеотиды остыть в течение ночи.
4. Обязательность реакции и электрофорез
- Подготовка 1 мл 5-кратного буфера для связывания путем смешивания 50 мкл60; 1 М Трис-HCl, рН 7,5; 10 мкл 5 М NaCl; 200 мкл 1 М KCl, 5 мкл 1 М MgCl 2, 10 мкл 0,5 М ЭДТА, рН 8,0; 5 мкл 1 М DTT; 25 мкл 10 мг / мл бычьего сывороточного альбумина, и 695 мкл DDH 2 O.
Примечание: 5х буфера для связывания может быть аликвоты и хранили при -20 ° С. Еще один момент, рассмотреть вопрос о том, что различные факторы транскрипции будут иметь различные модификации в связывающем буфере. - Право перед установкой реакции связывания, предварительно не запускать нативный полиакриламидный гель, 5% 0,5 × КЭ + 2,5% глицерина, чтобы удалить все следы персульфата аммония при 80 В в течение 30 - 60 мин, или до тех пор пока ток больше не изменяется со временем.
- Настройка реакции связывания в конечном объеме 20 мкл.
- Смешать 4 мкл 5 - кратного буфера для связывания, 80 - 200 нг очищенного белка A (в 50% глицерине, то есть, SOx-2), 1 мкл 0,1 мкМ Краситель-конъюгированного зонда (конечная концentration: 5 нМ), и DDH 2 O.
- Дополнительно: Когда конкуренты холодный зонд требуется, добавлять различные концентрации (2x, 10x, 25x, 50x, 100x и т.д.) холодных зондов.
- Дополнительно: Когда взаимодействие между белками А и В (то есть, SOx-2 и LIM-4) проверяется, добавить 80 - 200 нг очищенного белка B (в 50% глицерина, т.е. LIM-4).
- Дополнительно: Когда препарат ядерный экстракт используется и специфическое связывание белка А быть подтверждено, добавляют антитела , специфичные к протеином А (то есть, анти-6xHis, анти-FLAG, и т.д.).
- Инкубировать при R / T в темноте в течение 15 мин.
- Загрузите все реакции связывания на гель и запустить гель при 10 В / см до требуемого расстояния.
5. обработки изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Гель сканировали непосредственно в стеклянные пластины с передовой инфракрасной системы визуализации. Таким образом, гель может быть решена в дальнейшем и сканировать несколько раз (Рисунки 1C и
- Очистите слой сканера с DDH 2 O и хорошо высохнуть перед сканированием. Насухо протирать стеклянные пластины геля и помещают пластины, содержащие гель на планшете сканера.
- Откройте инфракрасное программное обеспечение визуализации и перейдите на вкладку 'Acquire'. Когда тоньше пластина (1 мм) помещается на планшете сканера, используйте настройки канала: 700, Интенсивность: Авто, разрешение: 169 мкм, Качество: среднее, и фокус смещение: 1,5 мм. Когда толще пластины (3 мм) помещается на планшете сканера, используйте настройки канала: 700, Интенсивность: Авто, разрешение: 84 мкм, Качество: среднее, и смещение фокуса: 3,5 мм. Направление смещения зависит оттолщина стеклянной пластины.
- Выберите область, что гель занимает на сканере. Нажмите кнопку "Пуск", чтобы начать сканирование.
- Повторите электрофорез и сканирования дополнительно по мере необходимости.
- Для приготовления 30 мл раствора геля для 4 гелей, смешать 5 мл 30% акриламид / бис (37.5: 1), 3 мл 5х КЭ (0,45 М Трис-борат, 10 мМ ЭДТА), 1,5 мл 50% глицерине, 300 мкл 10% персульфата аммония, 15 мкл TEMED, и 20,2 мл DDH 2 O тщательно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Оранжевый G красителем (6х: 0,12 г Оранжевый G в 100 мл 30% глицерина) может быть добавлен к реакции связывания перед загрузкой визуализировать ход электрофореза. Другие красители , включая погрузочные бромфенолового синего будут обнаружены во время сканирования и , следовательно , мешают анализу изображений (рис 1B).
В некоторых случаях EMSAs, особенно если препарат ядерный экстракт используется, поли deoxyinosinic-deoxycytidylic (ди-ПСТ) включается в реакции связывания для уменьшения неспецифического связывания белков с ДНК 11. Тем не менее, 50 мкг / мл деионизованной-ПСТ отменило связывание очищенного 6xHis-SOX-2 с помощью зондов 5'Dye ДНК (Фигура 1В).
Для того, чтобы показать специфичность связывания инфракрасных флуоресцентных зондов ДНК красителем меченый, мы использовали WT или мутантного холодных зондов в качестве конкурентов (
Специфичность связывания белков может быть определена путем проведения анализов supershift взаимодействия белок-ДНК с использованием антител , специфичных для белков или меток, особенно когда препарат ядерный экстракт используется для анализа 1. SOX-2 был помечен с 6xHis и FLAG эпитопов. Добавление 1 мкг анти-6xHis или 2,5 мкг анти-FLAG M2 antibo умирает в результате supershifted SOX-2-ДНК группы (рисунок 2).
Рисунок 1. FEMSA с помощью ИК - флуоресцентным красителем-меченных. (A) Блок - схема FEMSA. (Б) Эффект бромофенолового синего красителя, оранжевый G, и ди-ПСТ (1 мкг) на FEMSA. использовали 5 нМ 5'Dye-LIM-4 / SOX-2 зонда. (С) FEMSA показывающий специфичность связывания 6xHis-НОСКОВ-2 G73E на целевой сайт SOX-2 элемента LIM-4 / SOX-2. использовали 5 нМ 5'Dye-LIM-4 / SOX-2 зонда. LIM-4 / SOX-2 (М), мутантные сайты-мишени. Гели сканировали при 20 и 40 мин после электрофореза. Сканированное изображение, полученное при 40 мин после того, как электрофорез используют для количественного определения интенсивности флуоресценции группы, которая была нормализована по интенсивности полосы движения без какого-либо холодного зонда. AU, произвольная единица.ource.jove.com/files/ftp_upload/54863/54863fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Supershift Анализ комплекса SOX-2-ДНК с использованием Femsa и антител. SOX-2 был помечен как 6xHis и FLAG эпитопов. Добавление анти-6xHis или анти-FLAG антителами вызвало supershift комплекса НОСКОВ-2-ДНК. 5'Dye-LIM-4 / SOX-2 зонд был использован. Гелевые изображения были сращены между дорожками 2 и 3, чтобы исключить нерелевантные полосы движения. Гель сканировали при 40, 60 и 90 мин после электрофореза. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
fEMSAs являются эффективным инструментом для изучения взаимодействия белок-ДНК, и являются альтернативой радиоактивное мечение ДНК. Флуоресцентные красители, такие как инфракрасные красители являются коммерчески доступными, а также обеспечить более безопасный и более экологически чистый метод по сравнению с радиоактивное мечение ДНК. EMSAs с использованием инфракрасного флуоресцентного красителя-меченных не требуют postrun стадий обработки гель, и, следовательно, сэкономить время и затраты по сравнению с другими методами, мечении ДНК. Время , необходимое для обнаружения полос с использованием радиоактивных EMSAs может находиться в диапазоне от 30 мин до нескольких дней, в зависимости от радиоактивности и концентрации ДНК - зондов тестируемых 1. В противоположность этому, сканирование FEMSA гелей занимает в среднем 25 мин, что позволяет значительно сократить время протокола. fEMSAs также обеспечивают значительное преимущество над радиоактивное мечение, поскольку гель не должен быть удален из стеклянных пластин для анализа. Это позволяет гелю повторное сканирование, если начальное время работы не достаточнодля разрешения комплексов белок-ДНК. Возможность продлить электрофорез не доступен с использованием радиоактивных изотопов или биотин / стрептавидин. Самое главное, обращения с радиоактивными материалами создает угрозу безопасности для персонала лаборатории, в то время как флуоресцентная маркировка ДНК-зондов, не являются опасными, и могут быть легко утилизированы. Использование стрептавидином также требует более длительного периода до обнаружения (приблизительно 3 ч) 12. Протокол и результаты, представленные здесь, показывают, что Femsa является эффективным и удобным инструментом для биомедицинских исследований. Мы успешно использовали FEMSA , чтобы обеспечить механистического представление о влиянии SOX-2 G73E мутации на специфической активности связывания ДНК , что приводит к трансформации 5,10 идентичности обонятельный нейрон.
В случае, когда нет или слабый сигнал обнаружен при анализе гель, концентрация ДНК зонда может быть увеличена. Зонды ДНК, используемые в наших исследованиях были помечены с помощью инфракрасного флуоресцентного красителя наодноцепочечной. В то время как этот метод успешно работает для зондов, которые мы тестировали, было сообщено, что флуоресцентным состоят из одной нити имеет интенсивность зондов, которые были помечены на обеих нитях 30%. Если интенсивность оказывается слишком низким, то рекомендуется маркировать обе нити ДНК-зондом, с помощью инфракрасного флуоресцентного красителя. Если сдвинутые полосы не наблюдаются, комплекс белок-ДНК может быть неустойчивым. Глицерин имеет решающее значение в этом протоколе, чтобы стабилизировать взаимодействия белок-ДНК. Глицерин входит в РезьбаКабель гелей, реакции связывания, и подвижном буфере. Еще один момент рассмотрения является выбор красителя при отслеживании прогрессии образцов через гель во время бега. Оранжевый G идеально подходит для этой цели, как и другие виды погрузочных красителей, таких как бромфеноловый синий может мешать сканирования геля. Prerunning гель также имеет важное значение для обеспечения персульфат аммония удаляют из геля до начала загрузки образцов. Кроме того, использование поли-ди-ПСТ может помешать bindinг белка, представляющего интерес с ДНК-зондом в fEMSAs. Чистота белка, представляющего интерес и целостности ДНК-мишени, также важны для их взаимодействия. Важно также, чтобы обеспечить правильные настройки сканирования при использовании программного обеспечения визуализации. Соответствующий фокус смещения и параметры интенсивности выбраны в соответствии с толщиной гелевой пластин и интенсивности ДНК-зондов.
Предыдущие протоколы были описаны для выполнения флуоресцентных EMSAs 13,14. Тем не менее, эти протоколы требовали использования ди-О.К., и / или насосы используются для циркуляции воды для поддержания определенной температуры. Протокол, описанный здесь, обеспечивает значительно более детальный метод, и не требует использования каких-либо насосов.
Будущие приложения для данного протокола включают анализы конкуренции мониторинга в режиме реального времени. Флуоресцентно меченые зонды дают нам этого дополнительного понимания, поскольку гели могут быть отсканированы несколько раз в разное время электрофорез POINц. Кроме того, ДНК-зонды, представляющих интерес и конкурентов зонды могут быть помечены различными инфракрасных флуоресцентных красителей, что позволяет двухцветного изображения. Как и со всеми методами, существуют ограничения на использование флуоресцентных EMSAs. Более высокие концентрации белка, которые необходимы, по сравнению с традиционными EMSAs из-за относительно низкой чувствительностью. Другим ограничением является требование конкретной системы формирования изображения с высокой разрешающей способностью, чтобы обнаружить инфракрасный флуоресцентный краситель. Хотя первоначальная стоимость высока, чтобы купить сканер, длительное применение маркировки инфракрасного флуоресцентным красителем является экономически эффективным. Несмотря на эти ограничения, флуоресцентные EMSAs обеспечивают важный метод для решения значимых биологических вопросов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 1610158 | Acrylamide is harmful and toxic. |
| 6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8) | ThermoFisher | MA1-21315 | |
| Anti-Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165-.2MG | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade | New England Biolabs | B9000S | |
| 5'IRDye700-labeled DNA Oligos | Integrated DNA Technologies | Custom DNA oligo | These are referred to as "5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos" in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100 μM scale synthesis and HPLC purification. |
| Klenow Fragment (3'-->5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| LightShif Poly (dI-dC) | ThermoFisher | 20148E | |
| Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | This is referred to as a 'mini protein gel system' in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size. |
| Odyssey CLx Infrared Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey CLx Infrared Imagng System | This is referred to as an 'advanced infrared imaging system' in the manuscript. |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System | This is referred as a 'near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots' in the manuscript. |
| Image Studio software (version 4.0) | LI-COR Biotechnology | Image Studio software | This is referred to as a 'particular imaging software' in the manuscript. |
| Orange G | Sigma-Aldrich | O3756-25G | |
| 6x Orange loading dye | 0.25% Orange G; 30% Glycerol | ||
| 0.5x TBE | 45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA | ||
| 1x TE | 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA | ||
| 1x STE | 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA | ||
| 5x Binding Buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 μg/mL BSA |
References
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions. Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).
- Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations. Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).
- Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels. Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).
- Alqadah, A., et al. Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2. EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).
- Jullien, N., Herman, J. P. LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure. Biotechniques. 51, 267-269 (2011).
- Poulin-Laprade, D., Burrus, V. Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes. Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).
- Ruscher, K., et al. A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay. J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
- Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. Sox2 goes beyond stem cell biology. Cell cycle. , (2016).
- Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins. Biotechniques. 20, 439-444 (1996).
- Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe. Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).
- Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes. Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).
- Steiner, S., Pfannschmidt, T. Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).
