Summary
We beschrijven hier een geoptimaliseerd protocol van TL-elektroforetische mobiliteit shift assays (Femsa) met behulp van gezuiverd SOX-2 eiwitten in combinatie met infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte DNA-probes als een case study van een belangrijke biologische kwestie aan te pakken.
Abstract
Elektroforetische mobiliteit (EMSA) zijn instrumenteel middel om de interacties tussen eiwitten en hun doel DNA-sequenties te karakteriseren. Radioactiviteit de meest gangbare DNA labeling in EMSA's geweest. Echter, recente vorderingen in fluorescente kleurstoffen en scanmethodes het gebruik van fluorescerende tagging van DNA als alternatief voor radioactiviteit de voordelen van eenvoudige bediening gevraagd, bespaart tijd, lagere kosten en betere veiligheid. We hebben recent gebruikte fluorescerende EMSA (FEMSA) om met succes een belangrijke biologische vraag. Onze FEMSA analyse geeft mechanistisch inzicht in het effect van een missense mutatie, G73E, in de sterk geconserveerd HMG transcriptiefactor SOX-2 op olfactorische soort neuron diversificatie. We vonden dat mutant SOX-2 G73E eiwit verandert specifieke DNA-bindende activiteit, waardoor olfactorische neuron identiteit transformatie veroorzaken. Hier presenteren we een optimale en kosteneffectieve stap-voor-stap protocolvoor FEMSA met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte oligonucleotiden die de LIM-4 / SOX-2 aangrenzende doelplaatsen en gezuiverd SOX-2 eiwitten (WT en mutant SOX-2 G73E eiwitten) als biologisch voorbeeld.
Introduction
EMSA's worden gebruikt om de interacties tussen DNA en eiwitten geanalyseerd door natieve polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) een mengsel van een eiwit van interesse en een gemerkte DNA-probe die potentiële doelplaatsen van het eiwit 1 te lossen. Een DNA probe gebonden met proteïne migreert langzamer vergeleken met een vrij DNA probe, en derhalve vertraagd in zijn migratie door een polyacrylamide-matrix. Radioactief merken van DNA door 32 P is de belangrijkste methode voor de detectie in EMSA's geweest. Hoewel de toepassing van radioactief merken in biochemisch onderzoek gunstig is geweest, zijn de methoden van alternatieve DNA labeling met vergelijkbare gevoeligheid wordt ingezet als gevolg van de gezondheids- en veiligheidsrisico's in verband met de behandeling van radioactiviteit. Deze alternatieve werkwijzen omvatten conjugatie van biotine DNA met 2 of digoxigenine (DIG) 3 (beide worden vervolgens gedetecteerd door chemiluminescentie systemen), SYBR groen kleuring van de gels PAGE 4,of directe detectie van DNA-fluorescente kleurstof conjugaten door het scannen van de gel 5,6.
De opgeloste gels EMSA's gebruikt radioactief gemerkte DNA-probes vereisen postrun verwerking, autoradiografie films of fosforimager systeem radioactieve signalen 1,7 detecteren. Gels EMSA gebruik biotine- 2 of DIG-geconjugeerd 3 DNA probes moeten worden verwerkt en overgebracht op een geschikt membraan en gedetecteerd door chemiluminescentie 6. SYBR groene kleuring van de gel vereist postrun gel kleuring en fluorescentie scanner 4. Aangezien postrun gel bewerkingsstappen zijn vereist voor EMSA's met behulp van deze DNA-labeling-technieken, kunnen de omgezette gel slechts eenmaal getest. Daarentegen kunnen DNA-probes gelabeld met fluoroforen direct worden gedetecteerd in de gel in de glasplaten met een scanner. Daarom kan de DNA-eiwit interacties worden gevolgd en meerdere malen op verschillende tijdstippen getest tijdens de vlucht, dievermindert de tijd en kosten. De DNA-fluorescerende kleurstof conjugaten die zijn gebruikt voor EMSA's omvatten Cy3 6,8, 6,8 Cy5, fluoresceïne 9 en infrarood fluorescerende kleurstoffen 4-6.
Gentranscriptieregulatie vereist eiwit-DNA interacties van transcriptiefactoren en hun target genen. De coördinatie van deze interacties genereert diverse celtypen vanuit een gemeenschappelijke voorouder tijdens de ontwikkeling van dieren. Een onpartijdige forward genetische screen identificeerde een missense mutatie, G73E, in de sterk geconserveerd HMG DNA-bindende domein van de Caenorhabditis elegans transcriptiefactor SOX-2. De mutatie resulteert in een cel identiteit transformatie van AWB olfactorische neuronen in AWC olfactorische neuronen op moleculair, morfologische en functionele niveaus 5,10. SOX-2 regelt differentieel de terminal differentiatie van AWB en AWC neuronen door interactie met context-afhankelijke partner transcriptiefactoren en de respectieveDNA doelplaatsen 5,10. SOX-2 partners met LIM-4 (LHX) in terminal AWB neuronale differentiatie, terwijl de SOX-2 partners met CEH-36 (OTX / OTD) in terminal AWC neuronale differentiatie. Luciferase reporter assays tonen aan dat SOX-2 en mutant SOX-2 G73E eiwitten coöperatieve interacties met cofactoren transcriptionele LIM-4 en CEH-36 een promoter uitgedrukt in AWB en AWC neuronen activeren. Echter, SOX-2 en mutant SOX-2 G73E weergegeven differentiële activering eigenschappen van de promotor. Om de moleculaire basis van differentiële DNA bindingsactiviteiten van SOX-2 en SOX-2 G73E te onderzoeken werden uitgevoerd fEMSAs met deze eiwitten en de potentiële doelplaatsen.
Eerst werd een bioinformatica aanpak om de biologisch relevante DNA bindende sequenties in het promotorgebied 1 kb gebruikt in de luciferase assay identificeren. Sinds meerdere potentiële SOX-2 bindende locaties in de promotor aanwezig waren, hebben we ons gerichton voorspelde SOX-2 bindingsplaatsen naast vermeende CEH-36 of LIM-4-bindende plaatsen en evolutionair geconserveerd tussen verschillende soorten aaltjes. Deze sequenties werden gedeleteerd of gemuteerd, en vervolgens in vivo getest op hun activiteit GFP reporter transgenen in AWB of AWC neuronen tot expressie. Door deze benadering identificeerden we potentiële LIM-4 / SOX-2 en CEH-36 / SOX-2 aangrenzende doelplaatsen die specifiek zijn voor de expressie van GFP in AWB en AWC neuronen respectievelijk 5 vereist. We onderzochten de mogelijke verschillen in de DNA-binding van SOX-2 en SOX-2 G73E behulp van Femsa met de geïdentificeerde LIM-4 / SOX-2 en CEH-36 / SOX-2 aangrenzende doelwit sites. Onze analyse toonde aan dat EMSA SOX-2 G73E de DNA-probe die de LIM-4 / SOX-2 aangrenzende doelplaatsen (vereist voor genexpressie in AWB) niet zo efficiënt WT SOX-2 deed niet binden. Echter, SOX-2 en SOX-2 G73E had geen verschil in het binden van de DNA-probe die het CEH-36 / SOX-2 adjacent target site (die nodig zijn voor genexpressie in AWC) 5,10. Onze analyses geven FEMSA mechanistisch inzicht in de aard van de SOX-2 G73E-mutatie in zowel het gebruik van DNA-bindingsactiviteit van de AWB naar AWC celidentiteit transformatiefenotype. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol van FEMSA met gezuiverd 6xHis-SOX-2 of 6xHis-SOX-2 G73E samen met infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte DNA-probes met de LIM-4 / SOX-2 aangrenzende doelplaatsen als een case study aan te pakken een belangrijke biologische vraag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: EMSA's via fluorescent gelabelde DNA probes of andere vormen van gelabelde DNA delen dezelfde protocollen voor eiwit of celextract bereiding, eiwit-DNA bindingsreactie en PAGE gel voorbereiding en actief (Figuur 1A). De belangrijkste verschillen zijn DNA labeling procedures, post-run gel processtappen, en detectiemethoden.
1. Gel Voorbereiding
- Bereid 5% natieve polyacrylamidegel die 0,5 x TBE (45 mM Tris-boraat, 1 mM EDTA) en 2,5% glycerol, met een mini-eiwit gelsysteem (8,3 cm breed x 7,3 cm lengte x 0,75 mm dikte).
- Tot 30 ml geloplossing bereiden 4 gels, meng 5 ml 30% acrylamide / Bis (37,5: 1), 3 ml 5x TBE (0,45 M Tris-boraat, 10 mM EDTA), 1,5 ml 50% glycerol, 300 pl van 10% ammoniumpersulfaat, 15 ui TEMED en 20,2 ml DDH 2 O grondig.
OPMERKING: Acrylamide is schadelijk en giftig, handvat met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. - Cast de gel oplossing onmiddellijk. Na de polymerisatie, wikkel de gels in doorzichtige plastic wrap pre-bevochtigd met 0.5x TBE en bewaar ze bij 4 ° C.
2. Voorbereiding van de infrarood fluorescerende kleurstof-gelabelde probes
LET OP: Houd de infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte oligonucleotiden buurt van licht zoveel mogelijk tijdens de bereiding, opslag en experimenten.
- Ontwerpen en bestellen oligonucleotiden.
- Ontwerpen lang oligonucleotide voor ~ 51-meren.
LET OP: De lange oligonucleotide sequentie van de LIM-4 / SOX-2 probe is TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC. Lange oligonucleotiden niet PAGE of HPLC zuivering nodig. - Ontwerp van complementaire korte oligonucleotiden voor ~ 14-meren met infrarood fluorescerende kleurstof modificatie aan het 5'-uiteinde (5'Dye) en een smelttemperatuur boven 37 ° C.
OPMERKING: De korte oligonucleotidesequentie van de LIM-4 / SOX-2 sonde 5'Dye-GGGAGAAGATTTTG. De minimale synthese schaal van 5'Dye-gelabelde korte oligonucleotiden is 100 nM. Daarom is de oligonucleotiden vereisen HPLC zuivering.
- Ontwerpen lang oligonucleotide voor ~ 51-meren.
- Resuspendeer oligonucleotiden 1x Tris-EDTA buffer (TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) tot een eindconcentratie van 100 uM.
- Gloeien Short (5'Dye) en Long oligonucleotiden.
- Meng 0,6 pl 5'Dye-Short oligo (100 uM), 1,2 ui oligo Long (100 uM) en 28,2 pi natriumchloride-Tris-EDTA buffer (STE 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) in een 1,5 ml buis.
- Plaats de buis in kokend water gedurende 5 minuten. Zet de warmtebron en laat het water met de gehechte oligo's te koelen O / N in het donker.
- Vul het 5 'overhangende versmolten 5'Dye-korte / lange oligos met Klenow DNA polymerase om dubbelstrengs DNA probes maken.
- Bereid de reactie door het mengen30 pi versmolten korte / lange oligos met 5'Dye tag, 8,5 ui 10X Klenow-buffer, 1,7 ui 10 mM dNTP's, 1,7 pl Klenow (3 '-> 5' exo-) (5 U / pl) en 43,1 ul van DDH 2 O in een 0,2 ml PCR-buis.
- Incubeer 60 min bij 37 ° C in een PCR-machine.
- Voeg 3,4 ul 0,5 M EDTA om de reactie en warmte inactiveren bij 75 ° C gedurende 20 minuten in een PCR-machine te stoppen.
- Verdun ingevulde probes (0,7 uM) in STE voor uiteindelijke concentratie van 0,1 uM.
- Store oligo's bij -20 ° C in het donker totdat klaar voor gebruik. Oligo mag maximaal maximaal een jaar bij deze aandoening.
OPMERKING: Om DNA-probes met mutant bindingsplaatsen genereren mutant versies van lange oligonucleotiden worden gegloeid met 5'Dye-gelabelde korte oligonucleotiden, gevolgd door fill-in van 5 'overhangen met Klenow. Aangetoond is dat de sonde met één streng gelabeld met een infrarood fluorescerendekleurstof slechts 30% intensiteit van de probe met beide strengen gemerkt met de kleurstof. Als intensiteit van het signaal moet worden versterkt, zijn lang oligo's van beide strengen gelabeld met infrarood fluorescerende kleurstoffen op 5 'uiteinden en gehybridiseerd aan infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte probes te maken.
3. Voorbereiding van Unlabeled / Cold Probes (concurrenten)
Opmerking: Lange oligonucleotiden met complementaire sequenties (Long en LongR) werden gekoppeld aan ongelabelde probes te maken voor concurrentie-analyse met infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte probes.
- Meng 20 pl 100 pM Long, 20 pl 100 pM LongR oligonucleotiden en 60 ul STE in een 1,5 ml buis.
- Plaats de buis in kokend water gedurende 5 minuten, zet de warmtebron en laat het water met de gehechte oligo's 's nachts af te koelen.
4. Binding Reaction en elektroforese
- Bereid 1 ml 5x bindingsbuffer door 50 gl60, van 1 M Tris-HCl, pH 7,5; 10 pl van 5 M NaCl; 200 pi van 1 M KCl, 5 pl 1 M MgCl2, 10 pl 0,5 M EDTA, pH 8,0; 5 pl 1 M DTT; 25 ui 10 mg / ml BSA, en 695 pl DDH 2 O.
OPMERKING: De 5x Binding Buffer kunnen worden hoeveelheden verdeeld en opgeslagen bij -20 ° C. Een ander punt van overweging is dat de verschillende transcriptiefactoren verschillende modificaties om de binding buffer zal hebben. - Vlak voor het opzetten bindingsreacties, voorlooptijd de 5% natieve polyacrylamidegel in 0,5x TBE + 2,5% glycerol om alle sporen ammoniumpersulfaat verwijderen bij 80 V gedurende 30-60 minuten, of totdat de huidige niet meer tijd varieert.
- Stel de bindingsreactie in eindvolume van 20 pi.
- Meng 4 pl 5x bindingsbuffer 80-200 ng gezuiverd proteïne A (in 50% glycerol, dwz SOX-2), 1 pl 0,1 uM kleurstof geconjugeerd probe (eindconcentration: 5 nm) en DDH 2 O.
- Facultatief: Als koud probe concurrenten nodig, voeg verschillende concentraties (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, etc.) koud probes.
- Optioneel: Wanneer de interactie tussen eiwitten A en B (dat wil zeggen, SOX-2 en LIM-4) getest, voeg 80-200 ng gezuiverde eiwit B (in 50% glycerol, dwz LIM-4).
- Facultatief: Als nucleair extract preparaat gebruikt waarbij specifieke binding van proteïne A worden bevestigd, voeg antilichaam specifiek voor proteïne A (dat wil zeggen anti-6xHis, anti-FLAG, etc.).
- Incuberen bij R / T donker gedurende 15 min.
- Laad alle van de binding reactie op de gel en laat de gel bij 10 V / cm tot gewenste afstand.
5. Imaging
OPMERKING: De gel werd direct gescand in de glasplaten een geavanceerd infrarood beeldvormingssysteem. Daarom kan de gel verder opgelost en herhaaldelijk gescand (figuren 1C en
- Reinig het bed van de scanner met DDH 2 O en goed laten drogen voordat u gaat scannen. Droogwrijven glasplaten van de gel en plaats de platen die de gel op de scanner bed.
- Open de infrarood imaging software en ga naar het tabblad 'Acquire'. Wanneer de dunnere plaat (1 mm) wordt geplaatst op de scanner bed, gebruik maken van de instellingen van Kanaal: 700, Intensiteit: Auto, Resolutie: 169 urn, Kwaliteit: medium, en Focus offset: 1,5 mm. Wanneer de dikkere plaat (3 mm) wordt geplaatst op de scanner bed, gebruik maken van de instellingen van Kanaal: 700, Intensiteit: Auto, Resolutie: 84 pm, Kwaliteit: medium, en Focus offset: 3,5 mm. Focus gecompenseerd afhankelijk van dedikte van de glasplaat.
- Selecteer het gebied dat de gel inneemt op de scanner. Klik op 'Start' om de scan te starten.
- Herhaal elektroforese en bovendien nodig scannen.
- Tot 30 ml geloplossing bereiden 4 gels, meng 5 ml 30% acrylamide / Bis (37,5: 1), 3 ml 5x TBE (0,45 M Tris-boraat, 10 mM EDTA), 1,5 ml 50% glycerol, 300 pl van 10% ammoniumpersulfaat, 15 ui TEMED en 20,2 ml DDH 2 O grondig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oranje G ladingskleurstof (6x: 0,12 g oranje G in 100 ml 30% glycerol) kan de bindingsreactie toegevoegd vóór het laden om de voortgang van de elektroforese zichtbaar. Overige laad- kleurstoffen zoals broomfenolblauw zal worden gedetecteerd tijdens het scannen en dus interfereren met beeldanalyse (Figuur 1B).
In sommige gevallen van EMSA's, vooral als nucleair extract preparaat gebruikt, poly-deoxyinosinic deoxycytidylic (dI-dC) is opgenomen in de bindingsreactie om niet-specifieke binding van eiwitten aan DNA afnemen 11. Echter, 50 ug / ml di-dC schafte de binding van gezuiverde 6xHis-SOX-2 met 5'Dye DNA probes (Figuur 1B).
Bindende specificiteit van de infrarood fluorescerende kleurstof gelabelde DNA probes tonen gebruikten we WT of mutant koude probes als concurrenten (
De bindingsspecificiteit van eiwitten kan worden bepaald door het uitvoeren supershift assays van de eiwit-DNA-interactie met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor de eiwitten of markeringen, vooral wanneer extract preparaat kern wordt gebruikt voor de bepaling 1. SOX-2 werd gelabeld met 6xHis en FLAG epitopen. Toevoeging van 1 ug anti-6xHis of 2,5 ug anti-FLAG M2 Antibo sterft resulteerde in een supershifted SOX-2-DNA band (figuur 2).
Figuur 1. FEMSA met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof-gelabelde oligonucleotiden. (A) Flow grafiek van Femsa. (B) Het effect van broomfenolblauw kleurstof, oranje G, en dI-dC (1 ug) op Femsa. 5 nM 5'Dye-LIM-4 / SOX-2 probe werd gebruikt. (C) Femsa toont binding specificiteit van 6xHis-SOX-2 G73E aan de SOX-2 target site van de LIM-4 / SOX-2-element. 5 nM 5'Dye-LIM-4 / SOX-2 probe werd gebruikt. LIM-4 / SOX-2 (M), mutant doelplaatsen. De gels werden gescand bij 20 en 40 min na elektroforese. De gescande beeld verkregen op 40 min na elektroforese werd gebruikt om de fluorescentie-intensiteit band, die werd genormaliseerd door de intensiteit van de baan zonder koude probe kwantificeren. AU, willekeurige eenheid.ource.jove.com/files/ftp_upload/54863/54863fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. supershift Analyses van de SOX-2-DNA Complex met behulp van Femsa en antilichamen. SOX-2 werd gelabeld met zowel 6xHis en FLAG epitopen. Toevoeging van anti-6xHis of anti-FLAG antilichamen veroorzaakte een supershift van de SOX-2-DNA-complex. 5'Dye-LIM-4 / SOX-2-probe werd gebruikt. Gel beelden werden gesplitst tussen de lanen 2 en 3 om irrelevante rijstroken uit te sluiten. De gel werd gescand op 40, 60 en 90 min na elektroforese. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
fEMSAs zijn een efficiënt instrument om eiwit-DNA interacties te onderzoeken, en zijn een alternatief voor radioactieve labeling van DNA. Fluorescerende kleurstoffen zoals infrarood kleurstoffen zijn commercieel verkrijgbaar, en een veiligere en milieuvriendelijkere manier dan radioactieve DNA labeling. EMSA's met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte oligonucleotiden vereisen geen postrun gel processtappen, en dus tijd en kosten te besparen in vergelijking met andere DNA-labeltechnieken. De tijd te detecteren met behulp van radioactieve banden EMSA's kan variëren van 30 minuten tot enkele dagen, afhankelijk van radioactiviteit en de concentratie van de DNA proben 1 getest. In tegenstelling tot het scannen van FEMSA gels duurt gemiddeld 25 minuten, waardoor aanzienlijk te verminderen protocol tijd. fEMSAs bieden ook een belangrijk voordeel ten opzichte radioactieve labeling, omdat de gel hoeft niet van de glasplaten voor analyse te verwijderen. Hierdoor kan de gel worden gescand als de eerste run de tijd is niet voldoendeeiwit-DNA complexen lossen. De optie om elektroforese uit te breiden is niet beschikbaar met behulp van radioactieve isotopen of biotine / streptavidine. Het belangrijkste is het werken met radioactief materiaal vormt een veiligheidsrisico voor laboratoriumpersoneel, terwijl fluorescente labeling van DNA-probes is niet gevaarlijk, en kan gemakkelijk worden verwijderd. Het gebruik van streptavidine vereist ook een langere periode tot detectie (ongeveer 3 h) 12. Het protocol en de hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat FEMSA is een effectief en handig hulpmiddel voor biomedisch onderzoek. We hebben met succes gebruik FEMSA om mechanistisch inzicht te geven in het effect van de SOX-2 G73E-mutatie op specifieke DNA-bindende activiteit die leidt tot olfactorische neuron identiteit transformatie 5,10.
Indien geen of zwak signaal wordt gedetecteerd wanneer de analyse van de gel, kan de concentratie van DNA-probe worden verhoogd. De DNA-probes gebruikt in onze proeven zijn gemerkt met een infrarood fluorescerende kleurstof op eenenkele streng. Hoewel deze methode succesvol gewerkt probes we hebben getest, is gerapporteerd dat fluorescente labeling van een enkele streng 30% intensiteit van probes die zijn aangegeven op beide strengen. Als blijkt intensiteit te laag is, is het raadzaam om beide strengen van de DNA-probe te labelen met een infrarood fluorescerende kleurstof. Als verschoven banden niet worden nageleefd, kan het eiwit-DNA-complex onstabiel. Glycerol is cruciaal in dit protocol om eiwit-DNA interacties te stabiliseren. Glycerol is bij gegoten gels, de bindingsreactie en de loopbuffer. Een ander punt van overweging is de keuze van de kleurstof bij het volgen van de progressie van de monsters door de gel tijdens de run. Orange G is ideaal voor dit doel als andere soorten lading kleurstoffen zoals broomfenolblauw kunnen interfereren met scanning van de gel. Prerunning de gel is eveneens belangrijk ammoniumpersulfaat wordt uit de gel vóór het laden monsters verwijderd. Bovendien kan gebruik van poly dI-dC verstoren binding van het eiwit van belang met de DNA-probe in fEMSAs. Zuiverheid van het eiwit van belang en target DNA integriteit zijn ook belangrijk voor de interactie. Het is ook belangrijk om een correct scan standen geven bij gebruik van de beeldverwerkingssoftware. De juiste scherpstelling offset en intensiteitswaarden worden geselecteerd afhankelijk van de dikte van de gel platen en de intensiteit van DNA-probes.
Eerdere protocollen zijn beschreven fluorescerende EMSA 13,14 voeren. Echter, deze protocollen moesten worden gebruikt dI-dC, en / of pompen gebruikt om water te circuleren om een bepaalde temperatuur te handhaven. De hier beschreven protocol verschaft een meer gedetailleerde methode, en geen gebruik van pompen nodig.
Toekomstige toepassingen voor dit protocol zijn onder toezicht concurrentie assays in real time. Fluorescent gelabelde probes geven ons dit extra inzicht, zoals gels meerdere keren kunnen worden gescand op verschillende elektroforese moment points. Daarnaast kunnen DNA probes plaats en concurrent probes worden gemerkt met verschillende infrarood fluorescerende kleurstoffen, waardoor twee-kleuren weergave. Zoals bij alle technieken zijn er beperkingen aan het gebruik van fluorescerende EMSA's. Hogere concentraties eiwit nodig in vergelijking met traditionele EMSA door de relatief lage gevoeligheid. Een andere beperking is vereiste van een specifiek beeldvormingssysteem met hoge resolutie op de infrarood fluorescerende kleurstof detecteren. Hoewel de initiële kosten hoog om de scanner te kopen, langdurig gebruik van infrarood fluorescerende kleurstof etikettering kosteneffectief. Ondanks deze beperkingen fluorescent EMSA's vormen een belangrijke methode om significante biologische vragen te beantwoorden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 1610158 | Acrylamide is harmful and toxic. |
| 6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8) | ThermoFisher | MA1-21315 | |
| Anti-Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165-.2MG | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade | New England Biolabs | B9000S | |
| 5'IRDye700-labeled DNA Oligos | Integrated DNA Technologies | Custom DNA oligo | These are referred to as "5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos" in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100 μM scale synthesis and HPLC purification. |
| Klenow Fragment (3'-->5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| LightShif Poly (dI-dC) | ThermoFisher | 20148E | |
| Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | This is referred to as a 'mini protein gel system' in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size. |
| Odyssey CLx Infrared Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey CLx Infrared Imagng System | This is referred to as an 'advanced infrared imaging system' in the manuscript. |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System | This is referred as a 'near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots' in the manuscript. |
| Image Studio software (version 4.0) | LI-COR Biotechnology | Image Studio software | This is referred to as a 'particular imaging software' in the manuscript. |
| Orange G | Sigma-Aldrich | O3756-25G | |
| 6x Orange loading dye | 0.25% Orange G; 30% Glycerol | ||
| 0.5x TBE | 45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA | ||
| 1x TE | 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA | ||
| 1x STE | 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA | ||
| 5x Binding Buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 μg/mL BSA |
References
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions. Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).
- Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations. Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).
- Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels. Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).
- Alqadah, A., et al. Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2. EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).
- Jullien, N., Herman, J. P. LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure. Biotechniques. 51, 267-269 (2011).
- Poulin-Laprade, D., Burrus, V. Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes. Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).
- Ruscher, K., et al. A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay. J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
- Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. Sox2 goes beyond stem cell biology. Cell cycle. , (2016).
- Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins. Biotechniques. 20, 439-444 (1996).
- Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe. Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).
- Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes. Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).
- Steiner, S., Pfannschmidt, T. Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).
