Summary
Wir beschreiben hier ein optimiertes Protokoll von fluoreszierenden elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (FEMSA) gereinigtes SOX-2-Proteine zusammen mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA-Sonden als Fallstudie eine wichtige biologische Frage zu bekämpfen.
Abstract
Elektrophoretische Mobilität Shift-Assays (EMSA) sind eine instrumentale Werkzeug, um die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und deren Ziel-DNA-Sequenzen zu charakterisieren. Die Radioaktivität ist die vorherrschende Methode der DNA-Markierung in EMSA gewesen. Allerdings haben jüngste Fortschritte in der Fluoreszenzfarbstoffe und Scanverfahren die Verwendung von Fluoreszenzmarkierung von DNA als Alternative zu den Radioaktivität für den Vorteilen der leichten Handhabung Aufforderung, Zeitersparnis und reduziert die Kosten und die Verbesserung der Sicherheit. Wir haben vor kurzem fluoreszierende EMSA (FEMSA) erfolgreich adressieren eine wichtige biologische Frage verwendet. Unsere Analyse liefert FEMSA mechanistischen Einblick in die Wirkung einer Missense-Mutation, G73E, in der hochkonservierten HMG Transkriptionsfaktor SOX-2 auf olfaktorische Neuronen Typ Streuung. Wir fanden , dass mutierte SOX-2 G73E Protein spezifische DNA - Bindungsaktivität verändert, wodurch olfaktorischen Neuronen Identität Transformation verursacht. Hier stellen wir ein optimiertes und kostengünstiges Schritt-für-Schritt-Protokollfür FEMSA mit Infrarot - Fluoreszenz - Farbstoff-markierten Oligonukleotiden , die LIM-4 / SOX-2 benachbarte Zielstellen und gereinigt SOX-2 - Proteine (WT und Mutanten - SOX-2 G73E Proteine) als biologisches Beispiel enthält.
Introduction
EMSAs verwendet , durch Verwendung nativer Polyacrylamid - Gelelektrophorese (PAGE) Wechselwirkungen zwischen DNA und Proteinen zu analysieren , um eine Mischung aus einem Protein von Interesse und eine markierte DNA - Sonde enthält , potentielle Zielstellen des Proteins 1 zu lösen. Eine DNA-Sonde mit Protein gebunden langsamer wandert mit einer freien DNA-Sonde verglichen wird, und daher verzögert in seine Wanderung durch eine Polyacrylamid-Matrix. Die radioaktive Markierung von DNA durch 32 P hat die vorherrschende Methode zur Detektion in EMSA gewesen. Obwohl die Anwendung von radioaktiven Markierung in der biochemischen Forschung vorteilhaft war, sind Methoden der alternativen DNA-Markierung mit vergleichbarer Empfindlichkeit wird aufgrund der Risiken Gesundheit und Sicherheit beschäftigt im Umgang mit Radioaktivität in Verbindung gebracht. Diese alternativen Verfahren umfassen die Konjugation von DNA mit Biotin 2 oder Digoxigenin (DIG) 3 (beide werden dann durch Chemilumineszenzsystemen erkannt), SYBR Grün - Färbung der PAGE - Gels 4,oder direkte Detektion von DNA-Fluoreszenzfarbstoff - Konjugate durch das Gel 5,6 scannen.
Die aufgelösten Gele von EMSA unter Verwendung von radioaktiv markierten DNA - Sonden erfordern Nachlauf Verarbeitung durch Autoradiographie Filme oder ein Phosporimager System radioaktiven Signale 1,7 erfassen. Gele EMSAs Biotin- 2 oder DIG-konjugierten 3 DNA - Sonden müssen ebenfalls verarbeitet und auf eine geeignete Membran übertragen und dann durch Chemilumineszenz 6 detektiert. SYBR grüne Färbung des Gels erfordert Nachlauf Gel - Färbung und einen fluoreszierenden Scanner 4. Da Nachlauf Gel Verarbeitungsschritte zur EMSAs unter Verwendung dieser DNA-Markierungstechniken benötigt werden, kann die aufgelöste Gel nur einmal getestet werden. Im Gegensatz dazu markierten DNA-Sonden mit Fluorophoren direkt in dem Gel in den Glasplatten durch einen Scanner detektiert werden kann. Daher können die DNA-Protein-Wechselwirkungen mehrmals zu verschiedenen Zeitpunkten während des Laufs überwacht und analysiert werden, diedeutlich reduziert Zeit und Kosten. Die DNA-Fluoreszenzfarbstoff - Konjugate , die für EMSAs verwendet wurden , umfassen Cy3 6,8, 6,8 Cy5, Fluorescein 9 und Infrarot - Fluoreszenzfarbstoffe 4-6.
Transkriptionelle Regulation erfordert Protein-DNA-Wechselwirkungen von Transkriptionsfaktoren und ihre Zielgene. Die Koordination dieser Interaktionen erzeugt diverse Zelltypen aus einem gemeinsamen Vorläufer bei Tierentwicklung. Eine unvoreingenommene vorwärts genetisches Screening identifizierten eine Missense - Mutation, G73E, in der hochkonservierten HMG DNA-Bindungsdomäne des SOX-2 Caenorhabditis elegans Transkriptionsfaktor. Die Mutation führt zu einer Zellidentität Transformation von AWB olfaktorischen Neuronen in AWC Riechzellen auf molekularer, morphologischen und funktionellen Ebenen 5,10. SOX-2 regelt differentiell die terminale Differenzierung von AWB und AWC Neuronen mit kontextabhängigen Partner Transkriptionsfaktoren interagieren und die jeweiligenDNA - Zielstellen 5,10. SOX-2 Partner mit LIM-4 (LHX) in Terminal AWB neuronale Differenzierung, während SOX-2 Partner mit CEH-36 (OTX / OTD) in Terminal AWC neuronale Differenzierung. Luziferase - Reporter - Assays zeigen , dass SOX-2 und mutierten SOX-2 G73E Proteine haben kooperative Wechselwirkungen mit Transkriptions Cofaktoren LIM-4 und CEH-36 einen Promotor in AWB und AWC Neuronen zu aktivieren. Allerdings SOX-2 und mutierten SOX-2 G73E angezeigt Differentialaktivierungseigenschaften des Promotors. Um die molekulare Basis der differentiellen DNA - Bindungsaktivitäten von SOX-2 und SOX-2 G73E untersuchen, fEMSAs wurden mit diesen Proteinen und deren potentielle Zielstellen durchgeführt.
Zunächst wurde ein Ansatz Bioinformatics die biologisch relevante DNA-Bindungssequenzen innerhalb des 1 kb-Promotorregion in der Luciferase-Assay verwendet, zu identifizieren. Da mehrere potenzielle SOX-2 Bindungsstellen im gesamten Promotor anwesend waren, konzentrierten wir unsauf den vorhergesagten SOX-2-Bindungsstellen neben mutmaßlichen CEH-36 oder LIM-4-Bindungsstellen und evolutionär zwischen verschiedenen Nematodenarten konserviert. Diese Sequenzen wurden deletiert oder mutiert und anschließend in vivo auf ihre Aktivität getestet , um GFP reporter Transgenen in AWB oder AWC Neuronen exprimieren. Durch diesen Ansatz identifizierten wir Potential LIM-4 / SOX-2 und CEH-36 / SOX-2 benachbarte Zielstellen , die speziell die für die Expression von GFP in AWB und AWC Neuronen sind jeweils 5. Wir untersuchten die möglichen Unterschiede in der DNA - Bindung von SOX-2 und SOX-2 G73E mit FEMSA mit den identifizierten LIM-4 / SOX-2 und CEH-36 / SOX-2 benachbarte Zielstellen. Unsere EMSA - Analyse zeigte , dass SOX-2 G73E nicht die DNA - Sonde hat binden die LIM-4 / SOX-2 benachbarte Zielstellen (erforderlich für die Genexpression in AWB) so effizient wie WT SOX-2 tat enthält. Allerdings SOX-2 und SOX-2 G73E hatte keinen Unterschied in der Bindung der DNA - Sonde die CEH-36 / SOX-2 a enthält ,djacent Zielstelle (erforderlich für die Genexpression in AWC) 5,10. Unsere FEMSA Analysen für die AWB-to-AWC Zellidentität Phänotyp Transformation in beeinflussen spezifische DNA - Bindungsaktivität mechanistischen Einblick in die Natur des SOX-2 G73E - Mutation bereitstellen. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll von FEMSA unter Verwendung von gereinigtem 6xHis-SOX-2 oder 6 × His-SOX-2 G73E zusammen mit Infrarot - Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA - Sonden mit den LIM-4 / SOX-2 benachbarte Zielstellen als Fallstudie in Angriff zu nehmen eine wichtige biologische Frage.
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Protocol
HINWEIS: EMSAs fluoreszenzmarkierten DNA - Sonden oder andere Formen von markierten DNA die gleichen Protokolle für Protein oder Zellextraktzubereitung, Protein-DNA - Bindungsreaktion und PAGE Gelzubereitung und Ausführen (1A) verwendet wird . Die wichtigsten Unterschiede sind DNA-Markierungsverfahren, post-run Gel Verarbeitungsschritte und Nachweismethoden.
1. Gel Zubereitung
- Bereiten 5% nativen Polyacrylamidgel, enthaltend 0,5 × TBE (45 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA) und 2,5% Glycerin, ein Mini-Protein-Gel-System (8,3 cm Breite x 7,3 cm Länge x 0,75 mm Dicke).
- Zur Herstellung von 30 ml Gel-Lösung für 4 Gele, mischen 5 ml 30% Acrylamid / Bis (37,5: 1), 3 ml 5-fach TBE (0,45 M Tris-Borat, 10 mM EDTA), 1,5 ml 50% Glycerol, 300 & mgr; l von 10% Ammoniumpersulfat, 15 & mgr; l TEMED und 20,2 ml ddH 2 O gründlich.
HINWEIS: Acrylamid schädlich und giftig ist, Griff mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung. - Cast der Gel-Lösung sofort. Nach der Polymerisation wickeln die Gele in klaren Plastikfolie mit 0,5x TBE vorbenetzt und lagern Sie sie bei 4 ° C.
2. Herstellung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Sonden
HINWEIS: Halten Sie die Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoff-markierten Oligonukleotiden weg von Licht so viel wie möglich während der Herstellung, Lagerung und Experimente.
- Gestalten und bestellen Oligonukleotide.
- Entwerfen Sie lange Oligonukleotid für ~ 51-mere.
HINWEIS: Die lange Oligonukleotid - Sequenz des LIM-4 / SOX-2 - Sonde ist TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC. Lange Oligonukleotide erfordern keine PAGE oder HPLC-Reinigung. - Entwerfen komplementäre kurze Oligonukleotide für ~ 14-mers mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-Modifikation am 5'-Terminus (5'Dye) und eine Schmelztemperatur über 37 ° C.
HINWEIS: Die kurze Oligonukleotid-Sequenz des LIM-4 / SOX2 Sonde ist 5'Dye-GGGAGAAGATTTTG. Die Mindestsynthesemaßstab von 5'Dye-markierte kurze Oligonukleotide ist 100 nM. Daher erfordern die Oligonucleotide HPLC-Reinigung.
- Entwerfen Sie lange Oligonukleotid für ~ 51-mere.
- Resuspendieren Oligonukleotiden in 1x Tris-EDTA-Puffer (TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) auf eine Endkonzentration von 100 uM.
- Anneal Short (5'Dye) und lange Oligonukleotide.
- Mischungs 0,6 ul 5'Dye-Short Oligo (100 uM), 1,2 ul Oligo Lange (100 uM), und 28,2 & mgr; l Natriumchlorid-Tris-EDTA-Puffer (STE: 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) in einem 1,5 ml-Röhrchen.
- Das Röhrchen wird Wasser für 5 min in kochendem. Schalten Sie die Wärmequelle aus und lassen Sie das Wasser mit dem geglüht Oligos O / N kühlen im Dunkeln.
- Füllen Sie das 5'-Überhang von vergütetem 5'Dye-kurz / lang Oligos mit Klenow-DNA-Polymerase doppelsträngigen DNA-Sonden zu machen.
- Bereiten Sie die Reaktion durch Vermischen30 ul geglüht kurz / lang Oligos mit 5'Dye Tag, 8,5 ul 10x Klenow-Puffer, 1,7 ul 10 mM dNTPs, 1,7 ul Klenow (3 '-> 5' exo) (5 u / ul) und von 43,1 & mgr; l ddH 2 O in einem 0,2 ml PCR - Röhrchen.
- Inkubieren 60 min bei 37 ° C in einer PCR-Maschine.
- Hinzufügen, 3,4 & mgr; l 0,5 M EDTA die Reaktion und Wärme inactivate für 20 min in einer PCR-Maschine bei 75 ° C zu beenden.
- Verdünnte eingefüllte in Sonden (0,7 uM) in STE für Endkonzentration von 0,1 uM.
- Shop Oligos bei -20 ° C im Dunkeln bis zur Verwendung. Oligos kann für bis zu einem Jahr in diesem Zustand gelagert werden.
HINWEIS: Um die DNA-Sonden mit mutierten Bindungsstellen, mutierten Versionen von langen Oligonukleotiden geglüht mit 5'Dye-markierte kurze Oligonukleotide, gefolgt von Fill-in von 5'-Überhänge mit Klenow erzeugen. Es hat sich gezeigt, daß die Sonde mit einem Strang mit einem Infrarot fluoreszierenden markierten gezeigtFarbstoff nur 30% Intensität der Sonde mit den beiden mit dem Farbstoff markierten Stränge. Wenn die Signalintensität verstärkt werden muss, sind lange Oligos beider Stränge mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoffen an 5'-Enden markiert und geglüht Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoff-markierten Sonden machen.
3. Herstellung von unbeschriftet / kalt Probes (Wettbewerber)
Hinweis: Lange Oligonukleotide komplementäre Sequenzen (Long und LongR) mit unmarkierten Sonden zur Wettbewerbsanalyse zu machen geglüht wurden Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoff-markierten Sonden.
- Mix 20 ul 100 uM lang, 20 ul 100 uM LongR Oligonukleotiden und 60 & mgr; l STE in einem 1,5-ml-Röhrchen.
- Das Röhrchen wird Wasser für 5 min in kochendem, schalten Sie die Wärmequelle aus und lassen Sie das Wasser mit dem geglüht Oligos über Nacht abkühlen.
4. Bindungsreaktion und Elektrophorese
- Vorbereitung 1 ml 5x Bindungspuffer um 50 & mgr; l Misch60; 1 M Tris-HCl, pH 7,5; 10 ul 5 M NaCl; 200 ul 1 M KCl, 5 ul 1 M MgCl 2, 10 ul 0,5 M EDTA, pH 8,0; 5 ul 1 M DTT; 25 ul 10 mg / ml BSA und 695 & mgr; l ddH 2 O.
HINWEIS: Der 5x Bindungspuffer kann bei -20 ° C aliquotiert und gelagert werden. Ein weiterer Punkt zu beachten ist, dass verschiedene Transkriptionsfaktoren verschiedene Modifikationen an den Bindungspuffer haben. - Kurz vor dem Bindungsreaktionen einrichten, Vorlauf 5% nativen Polyacrylamidgel in 0,5x TBE + 2,5% Glycerin alle Spuren von Ammoniumpersulfat bei 80 V für 30 zu entfernen - 60 min, oder bis der Strom nicht ändert länger mit der Zeit.
- Legen Sie die Bindungsreaktion in Endvolumen von 20 & mgr; l auf.
- Mischungs 4 ul 5x Bindungspuffer, 80 bis 200 ng gereinigtem Protein A (in 50% Glycerin, dh SOX-2), 1 ul 0,1 uM Farbstoff-konjugierten Sonde (Endkonzentrationentration: 5 nM) und ddH 2 O.
- Optional: Wenn kalte Sonde Konkurrenten erforderlich sind, fügen verschiedene Konzentrationen (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, etc.) von kalten Sonden.
- Optional: Wenn die Wechselwirkung zwischen den Proteinen A und B (dh SOX-2 und LIM-4) geprüft wird, hinzufügen von 80 bis 200 ng gereinigtem Protein B (in 50% Glycerin, dh LIM-4).
- Optional: Wenn Kernextraktzubereitung verwendet wird , und spezifische Bindung von Protein A ist , validiert werden, Antikörper , der spezifisch an Protein A addieren (dh anti-6xHis, anti-FLAG, etc.).
- Inkubieren bei R / T in Dunkelheit für 15 min.
- Legen Sie alle der Bindungsreaktion auf das Gel, und führen Sie das Gel bei 10 V / cm auf den gewünschten Abstand.
5. Imaging
HINWEIS: Das Gel wurde direkt in den Glasplatten mit einer erweiterten Infrarot-Abbildungssystem abgetastet. Daher kann das Gel weiter aufgelöst werden und wiederholt (1C gescannt und
- Reinigen Sie das Bett des Scanners mit ddH 2 O und gut trocknen vor dem Scannen. Wischen Sie die Glasplatten des Gels trocknen und legen Sie die Platten, die das Gel auf dem Scannerbett.
- Öffnen Sie die Infrarot-Imaging-Software und gehen Sie auf die "Acquire" Tab. Wenn die dünnere Platte (1 mm) auf dem Scanner-Bett gelegt wird, verwenden Sie die Einstellungen von Kanal: 700, Intensität: Auto, Auflösung: 169 & mgr; m, Qualität: mittel, und Focus-Offset: 1,5 mm. Wenn die dickere Platte (3 mm) auf dem Scanner-Bett gelegt wird, verwenden Sie die Einstellungen von Kanal: 700, Intensität: Auto, Auflösung: 84 & mgr; m, Qualität: mittel, und Focus-Offset: 3,5 mm. Fokus-Offset ist abhängig von derDicke der Glasplatte.
- Wählen Sie den Bereich, der das Gel auf dem Scanner einnimmt. Klicken Sie auf 'Start', um den Scanvorgang zu starten.
- Wiederholen Sie die Elektrophorese und scannen zusätzlich nach Bedarf.
- Zur Herstellung von 30 ml Gel-Lösung für 4 Gele, mischen 5 ml 30% Acrylamid / Bis (37,5: 1), 3 ml 5-fach TBE (0,45 M Tris-Borat, 10 mM EDTA), 1,5 ml 50% Glycerol, 300 & mgr; l von 10% Ammoniumpersulfat, 15 & mgr; l TEMED und 20,2 ml ddH 2 O gründlich.
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Representative Results
Orange G loading dye (6x: 0.12 g Orange G in 100 ml 30% Glycerol) können vor dem Laden in die Bindungsreaktion zugesetzt werden, um das Fortschreiten der Elektrophorese sichtbar zu machen. Weitere Lade- Farbstoffe Bromphenolblau einschließlich wird während des Scannens und daher interferieren Bildanalyse (1B) detektiert werden.
In einigen Fällen von EMSAs, insbesondere wenn die Kernextraktzubereitung verwendet wird, Poly deoxyinosinic-deoxycytidylic (dI-dC) in die Bindungsreaktion eingeschlossen unspezifische Bindung von Proteinen an DNA 11 zu verringern. Jedoch 50 ug / ml dI-dC beseitigt die Bindung von gereinigtem 6xHis-SOX-2 mit 5'Dye DNA - Sonden (1B).
Zeigen Bindungsspezifität des Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA-Sonden verwendeten wir WT oder mutierten kalten Sonden als Kompetitoren (
Die Bindungsspezifität von Proteinen kann durch Durchführung Supershift - Assays der Protein-DNA - Interaktion Antikörper , die spezifisch für die Proteine oder Tags bestimmt werden, insbesondere bei Kernextrakt Vorbereitung für den Test 1 verwendet wird. SOX-2 wurde mit 6 × His und FLAG-Epitope markiert. Zugabe von 1 & mgr; g anti-6xHis oder 2,5 & mgr; g anti-FLAG M2 Antibo führte stirbt in einem supergeshiftet SOX-2-DNA - Bande (Abbildung 2).
Abbildung 1. FEMSA mit Infrarot - Fluoreszenzfarbstoff-markierte Oligonukleotide. (A) Flussdiagramm von FEMSA. (B) Die Wirkung von Bromphenolblau - Farbstoff, Orange G und dI-dC (1 ug) auf FEMSA. 5 nM von 5'Dye-LIM-4 / SOX-2-Sonde verwendet wurde. (C) FEMSA zeigt Bindungsspezifität von 6xHis-SOX-2 G73E an die SOX-2 - Zielstelle des LIM-4 / SOX-2 - Element. 5 nM von 5'Dye-LIM-4 / SOX-2-Sonde verwendet wurde. LIM-4 / SOX-2 (M), mutierten Zielstellen. Die Gele wurden bei 20 und 40 min nach der Elektrophorese gescannt. Das gescannte Bild bei 40 min erhalten nach der Elektrophorese verwendet wurde, die Fluoreszenzbandenintensität zu quantifizieren, die durch die Intensität der Fahrspur ohne kalte Sonde normiert wurde. AU, willkürliche Einheit.ource.jove.com/files/ftp_upload/54863/54863fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Supershift Analysen der SOX-2-DNA - Komplexe unter Verwendung von FEMSA und Antikörper. SOX-2 wurde mit Epitopen sowohl 6xHis und FLAG markiert. Die Zugabe von anti-6xHis oder anti-FLAG-Antikörper verursachte einen Supershift des SOX-2-DNA-Komplex. 5'Dye-LIM-4 / SOX-2-Sonde verwendet wurde. Gel-Bilder wurden zwischen Fahrspuren gespleißt 2 und 3 auf irrelevante Spuren auszuschließen. Das Gel wurde bei 40, 60 und 90 Minuten nach der Elektrophorese gescannt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
fEMSAs sind ein leistungsfähiges Werkzeug Protein-DNA-Wechselwirkungen, und sind eine Alternative zur radioaktiven Markierung von DNA zu untersuchen. Fluoreszenzfarbstoffe, wie beispielsweise Infrarot-Farbstoffe sind im Handel erhältlich und bieten einen sicheren und umweltfreundlichen Verfahren im Vergleich zur radioaktiven DNA-Markierung. EMSA unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoff-markierten Oligonukleotiden erfordern keine Nachlauf Gel Verarbeitungsschritte und somit Zeit und Kosten im Vergleich zu anderen DNA-Markierungstechniken speichern. Die Zeit , zu detektieren Bands radioaktiven EMSAs verwendet , kann von 30 min bis zu mehreren Tagen reichen, abhängig von der Radioaktivität und der Konzentration der DNA - Sonden 1 getestet. Im Gegensatz dazu Scannen von FEMSA Gele dauert im Durchschnitt 25 Minuten, wodurch Protokoll Zeit deutlich reduziert wird. fEMSAs bieten auch einen erheblichen Vorteil gegenüber radioaktiver Markierung, da das Gel nicht von den Glasplatten zur Analyse entfernt werden muss. Dies ermöglicht das Gel erneut abgetastet werden, wenn die anfängliche Laufzeit nicht ausreichend ist,Protein-DNA-Komplexe zu lösen. Die Option Elektrophorese zu verlängern ist radioaktive Isotope oder Biotin / Streptavidin nicht zur Verfügung. Am wichtigsten ist, radioaktive Material Handling stellt ein Sicherheitsrisiko für das Laborpersonal, während Fluoreszenz-Markierung von DNA-Sonden ist nicht gefährlich und kann leicht entsorgt werden. Die Verwendung von Streptavidin erfordert auch eine längere Zeit bis zur Detektion (ca. 3 h) 12. Das Protokoll und hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass FEMSA ein effektives und bequemes Werkzeug für die biomedizinische Forschung. Wir haben erfolgreich FEMSA bieten mechanistischen Einblick in die Wirkung von SOX-2 G73E - Mutation auf die spezifische DNA - Bindungsaktivität verwendet , die 5,10 Transformation zu olfaktorischen Neuronen Identität führt.
In dem Fall, dass keine oder nur schwache Signal erkannt wird, wenn das Gel analysiert, kann die Konzentration der DNA-Sonde erhöht werden. Die DNA-Sonden in unseren Versuchen verwendet wurden, mit einem Infrarot fluoreszierenden Farbstoff auf einem markierteneinzelner Strang. Obwohl dieses Verfahren erfolgreich für Sonden gearbeitet hat die wir getestet haben, wurde berichtet, dass die Fluoreszenzmarkierung eines einzelnen Stranges 30% Intensität von Sonden aufweist, die auf beiden Strängen markiert worden sind. Wenn Intensität zu niedrig erweist, ist es empfehlenswert, beide Stränge der DNA-Sonde mit einem Infrarotfluoreszenzfarbstoff zu markieren. Wenn verschobenen Banden nicht beobachtet werden, kann die Protein-DNA-Komplex instabil sein. Glycerin ist in diesem Protokoll entscheidend Protein-DNA-Wechselwirkungen zu stabilisieren. Glycerol wird in gegossenen Gels, der Bindungsreaktion und der Laufpuffer enthalten. Ein weiterer Punkt der Überlegung ist Wahl des Farbstoffs, wenn während der Lauf Verlauf der Proben durch das Gel zu verfolgen. Orange G ist ideal für diesen Zweck, wie andere Arten von Lade Farbstoffe wie Bromphenolblau mit dem Scannen des Gels stören können. das Gel vorlauf ist auch wichtig, Ammoniumpersulfat wird vor dem Laden der Proben aus dem Gel entfernt zu gewährleisten. Verwendung von Poly dI-dC Darüber hinaus können mit Bindin störeng des Proteins von Interesse mit der DNA-Sonde in fEMSAs. Reinheit des Proteins von Interesse und Ziel-DNA-Integrität sind auch wichtig, um deren Zusammenspiel. Es ist auch wichtig, korrekte Scan-Einstellungen, um sicherzustellen, wenn die Imaging-Software. Die geeignete Fokusverschiebung und Intensitätsparameter werden entsprechend der Dicke der Gelplatten und Intensität von DNA-Sonden ausgewählt ist.
Vorherige Protokolle wurden beschrieben fluoreszierende EMSA 13,14 auszuführen. Allerdings haben diese Protokolle Verwendung von dI-dC erforderlich ist, und / oder Pumpen verwendet, um Wasser zu zirkulieren, eine bestimmte Temperatur zu halten. Das hier beschriebene Protokoll liefert eine viel detailliertere Methode und keine Verwendung von Pumpen benötigen.
Zukünftige Anwendungen für dieses Protokoll sind die Überwachung Konkurrenztests in Echtzeit. Fluoreszenzmarkierte Sonden uns diese zusätzlichen Einblick, wie Gele mehrmals bei verschiedenen Elektrophoresezeit poin gescannt werden können,ts. Darüber hinaus DNA-Sonden von Interesse und Wettbewerber Sonden können mit verschiedenen Infrarot-Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden, so dass für Zweifarben-Bildgebung. Wie bei allen Verfahren, gibt es Einschränkungen bei Fluoreszenz EMSAs verwendet. Höhere Konzentrationen an Protein benötigt werden, im Vergleich zu herkömmlichen EMSAs aufgrund der relativ geringeren Empfindlichkeit. Eine weitere Einschränkung ist Voraussetzung eines bestimmten Abbildungssystem mit hoher Auflösung, die Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoff zu erkennen. Obwohl die Anschaffungskosten hoch ist der Scanner, die langfristige Verwendung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoffmarkierung zu kaufen ist kostengünstig. Trotz dieser Einschränkungen bieten fluoreszierende EMSA eine wichtige Methode signifikante biologische Fragen zu beantworten.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 1610158 | Acrylamide is harmful and toxic. |
| 6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8) | ThermoFisher | MA1-21315 | |
| Anti-Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165-.2MG | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade | New England Biolabs | B9000S | |
| 5'IRDye700-labeled DNA Oligos | Integrated DNA Technologies | Custom DNA oligo | These are referred to as "5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos" in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100 μM scale synthesis and HPLC purification. |
| Klenow Fragment (3'-->5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| LightShif Poly (dI-dC) | ThermoFisher | 20148E | |
| Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | This is referred to as a 'mini protein gel system' in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size. |
| Odyssey CLx Infrared Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey CLx Infrared Imagng System | This is referred to as an 'advanced infrared imaging system' in the manuscript. |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System | This is referred as a 'near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots' in the manuscript. |
| Image Studio software (version 4.0) | LI-COR Biotechnology | Image Studio software | This is referred to as a 'particular imaging software' in the manuscript. |
| Orange G | Sigma-Aldrich | O3756-25G | |
| 6x Orange loading dye | 0.25% Orange G; 30% Glycerol | ||
| 0.5x TBE | 45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA | ||
| 1x TE | 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA | ||
| 1x STE | 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA | ||
| 5x Binding Buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 μg/mL BSA |
References
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions. Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).
- Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations. Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).
- Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels. Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).
- Alqadah, A., et al. Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2. EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).
- Jullien, N., Herman, J. P. LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure. Biotechniques. 51, 267-269 (2011).
- Poulin-Laprade, D., Burrus, V. Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes. Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).
- Ruscher, K., et al. A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay. J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
- Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. Sox2 goes beyond stem cell biology. Cell cycle. , (2016).
- Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins. Biotechniques. 20, 439-444 (1996).
- Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe. Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).
- Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes. Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).
- Steiner, S., Pfannschmidt, T. Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).
