Summary
Vi beskriver her en optimalisert protokoll av fluorescerende Elektrofore Shift Mobility Analyser (FEMSA) med rensede SOX-2 proteiner sammen med infrarøde fluorescerende fargestoff-merkede DNA-prober som en case-studie for å takle en viktig biologisk spørsmålet.
Abstract
Elektro Shift Mobility Analyser (EMSA) er en instrumental verktøy for å karakterisere samspillet mellom proteiner og deres mål DNA-sekvenser. Radioaktivitet har vært den dominerende metoden for DNA-merking i EMSAs. Imidlertid har de siste fremskritt i fluorescerende fargestoffer og skannemetoder førte til at bruk av fluoriserende merking av DNA som et alternativ til radioaktivitet for fordelene ved enkel håndtering, spare tid, redusere kostnader og bedre sikkerhet. Vi har nylig brukt fluorescerende EMSA (FEMSA) for å ta opp en viktig biologisk spørsmålet. Vår FEMSA analysen gir mekanistisk innsikt i effekten av en missense mutasjon, G73E, i den svært konservert HMG transkripsjonsfaktor SOX-2 på olfactory neuron typen diversifisering. Vi fant at mutante SOX-2 G73E protein forandrer spesifikk DNA-bindingsaktivitet, og dermed forårsaker olfaktorisk nervecelle identitet transformasjon. Her presenterer vi en optimalisert og kostnadseffektiv steg-for-steg-protokollenfor FEMSA ved hjelp av infrarød fluorescerende fargestoff-merket oligonukleotider inneholder LIM-4 / SOX-2 tilstøtende målse og renset SOX-2 proteiner (WT og mutante SOX-2 G73E proteiner) som en biologisk eksempel.
Introduction
EMSAs blir brukt til å analysere interaksjoner mellom DNA og proteiner ved hjelp av naturlig polyakrylamidgel-elektroforese (PAGE) å løse en blanding av et protein av interesse og et merket DNA-probe som inneholdt potensielle måls av proteinet 1. En DNA-probe bundet med protein vil vandre langsommere sammenlignet med en fri DNA-probe, og er derfor retardert i sin vandring gjennom en polyakrylamid matriks. Radiomerking av DNA ved hjelp av 32P har vært den dominerende metoden for deteksjon i EMSAs. Selv om bruk av radiomerking i biokjemisk forskning har vært gunstig, er metoder for alternativ DNA merking med sammenlignbare følsomheten blir ansatt på grunn av helse- og sikkerhetsrisikoer forbundet med håndtering av radioaktivitet. Disse alternative metodene omfatter konjugering av DNA med biotin to eller digoxigenin (DIG) 3 (som begge er deretter oppdaget av kjemiluminescerende systemer), SYBR grønn farging av siden gels 4,eller direkte påvisning av DNA-fluorescerende fargestoff konjugater ved å skanne gel 5,6.
Oppklarte gels av EMSAs bruker radioaktivt merkede DNA-prober krever postrun behandling gjennom autoradiografi filmer eller et phosphorimager system for å oppdage radioaktive signaler 1,7. Geler av EMSAs ved hjelp av biotin- to eller DIG-konjugerte tre DNA-prober må også behandles og overføres til en egnet membran og deretter detektert av kjemiluminescens 6. SYBR grønn farging av gelen krever postrun gel farging og et fluorescerende skanner 4. Siden postrun gel behandlingstrinn er nødvendig for EMSAs ved hjelp av disse DNA-merkingsteknikker, kan den løses gelen bli analysert bare en gang. I motsetning til dette kan DNA-prober merket med fluoroforer bli direkte detektert i gelen på innsiden av glassplatene ved en skanner. Derfor kan DNA-protein interaksjoner bli overvåket og analysert flere ganger på forskjellige tidspunkter under kjøringen, somreduserer tiden og kostnadene betydelig. DNA-fluorescerende fargestoff konjugater som har blitt brukt for EMSAs inkluderer Cy3 6,8, Cy5 6,8, fluorescein 9, og infrarøde fluorescerende fargestoffer 4-6.
Transkripsjonsregulering krever protein-DNA interaksjoner av transkripsjonsfaktorer og deres mål gener. Samordning av disse interaksjonene genererer ulike celletyper fra en felles stamfar løpet dyr utvikling. En objektiv frem genetisk skjermen identifisert en missense mutasjon, G73E, i den svært konservert HMG DNA-bindende domene av Caenorhabditis elegans transkripsjonsfaktor SOX-2. Mutasjonen resulterer i en celle identitet transformasjon av AWB olfactory nevroner i AWC olfactory nevroner på molekylære, morfologiske og funksjonelle nivåer 5,10. SOX-to forskjellig regulerer terminal differensiering av AWB og AWC nevroner ved å samhandle med kontekstavhengig partner transkripsjonsfaktorer og respektiveDNA målse 5,10. SOX-2 partnere med LIM-4 (LHX) i terminalen AWB neuronal differensiering, mens SOX-2 partnere med CEH-36 (OTX / OTD) i terminal AWC neuronal differensiering. Luciferaserapportørplasmid analyser viser at SOX-2 og mutante SOX-2 G73E proteiner har samarbeids interaksjoner med transkripsjons kofaktorer LIM-4 og CEH-36 for å aktivere en promoter uttrykt i AWB og AWC nevroner. Men SOX-2 og mutant SOX-2 G73E vises differensial aktiverings egenskapene til arrangøren. For å undersøke molekylære grunnlaget for differensial DNA-bindende aktiviteter SOX-2 og SOX-2 G73E, ble fEMSAs utført med disse proteinene og deres potensielle målse.
Først en bioinformatikk tilnærmingen ble tatt for å identifisere den biologisk relevant DNA-bindingssekvenser innenfor en kb-promoter-regionen anvendt i luciferase-assay. Siden flere potensielle SOX-2 bindingsseter var tilstede under hele promoter, vi fokusertpå predikerte SOX-to bindingssteder i tilknytning til antatte CEH-36 eller LIM-fire bindingsseter og evolusjonært konserverte mellom ulike nematode arter. Disse sekvensene ble slettet eller mutert, og deretter testet in vivo for sin aktivitet til å uttrykke GFP reporter transgener i AWB eller AWC nevroner. Gjennom denne tilnærmingen, har vi identifisert potensielle LIM-4 / SOX-2 og CEH-36 / SOX-2 tilstøtende målse som er spesielt nødvendig for uttrykket av GFP i AWB og AWC nevroner henholdsvis fem. Vi har undersøkt de potensielle forskjeller i DNA binding av SOX-2 og SOX-2 G73E hjelp FEMSA med de identifiserte LIM-4 / SOX-2 og CEH-36 / SOX-2 tilstøtende målse. Vår EMSA analyse viste at SOX-2 G73E ikke binde DNA probe som inneholder LIM-4 / SOX-2 tilstøtende målse (som kreves for genekspresjon i AWB) så effektivt som WT SOX-2 gjorde. Men, SOX-2 og SOX-2 G73E hadde ingen forskjell i binding av DNA probe som inneholder CEH-36 / SOX-2 endjacent målområde (kreves for genekspresjon i AWC) 5,10. Våre analyser FEMSA gi mekanistisk innsikt i naturen av SOX-2 G73E mutasjon i å påvirke spesifikk DNA-bindende aktivitet for AWB-til-AWC celleidentiteten transformasjon fenotype. Her beskriver vi en optimalisert protokoll fra FEMSA å bruke rensede 6xHis-SOX-2 eller 6xHis-SOX-2 G73E sammen med infrarød fluorescerende fargestoff-merkede DNA-prober som inneholder LIM-4 / SOX-2 tilstøtende målområder som en casestudie for å takle en viktig biologisk spørsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: EMSAs ved hjelp av fluorescensmerkede DNA-prober eller andre former for merket DNA deler de samme protokollene for proteinet eller celleekstrakt preparat, protein-DNA-bindingsreaksjon, og PAGE-gel forberedelse og drift (figur 1A). De viktigste forskjellene er DNA-merking prosedyrer, post-run gel behandlingstrinn, og deteksjonsmetoder.
1. Gel Forberedelse
- Fremstille 5% opprinnelige polyakrylamid gel inneholdende 0,5x TBE (45 mM Tris-borat, 1 mM EDTA) og 2,5% glycerol, ved anvendelse av en mini-protein-gel-systemet (8,3 cm bredde x 7,3 cm lengde x 0,75 mm tykkelse).
- For å fremstille 30 ml geloppløsning for 4-geler, blandes 5 ml av 30% akrylamid / bis (37,5: 1), 3 ml 5 x TBE (0,45 M Tris-borat, 10 mM EDTA), 1,5 ml 50% Glyserol 300 mL av 10% ammoniumpersulfat, 15 ul TEMED, og 20,2 ml av DDH 2 O grundig.
MERK: Akrylamid er skadelig og giftig, håndtak med egnet personlig verneutstyr. - Kast gel løsning umiddelbart. Etter polymerisering, vikle gels i klar plast brytes pre-fuktet med 0.5x TBE og lagre dem ved 4 ° C.
2. Utarbeidelse av fluorescerende fargestoff-merkede prober
MERK: Hold infrarøde fluorescerende fargestoff-merket oligonukleotider vekk fra lys så mye som mulig under forberedelse, lagring og eksperimenter.
- Design og orden oligonukleotider.
- Design lang oligonukleotid for ~ 51-merer.
MERK: Den lange oligonukleotid sekvens av LIM-4 / SOX-to probe er TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC. Lange oligonukleotider krever ikke PAGE eller HPLC rensing. - Utforme komplementære korte oligonukleotider til ~ 14-merer med fluorescerende fargestoff endring i 5'-terminus (5'Dye) og en smeltetemperatur over 37 ° C.
MERK: kort oligonukleotid sekvens av LIM-4 / SOX-2 probe er 5'Dye-GGGAGAAGATTTTG. Den minste syntese skala fra 5'Dye-merkede korte oligonukleotider er 100 nM. Derfor oligonukleotidene krever HPLC-rensing.
- Design lang oligonukleotid for ~ 51-merer.
- Resuspender oligonukleotider i 1x Tris-EDTA-buffer (TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) til endelig konsentrasjon på 100 uM.
- Gløding Short (5'Dye) og lange oligonukleotider.
- Bland 0,6 mL av 5'Dye-Short oligo (100 uM), 1,2 ul av lang oligo (100 uM), og 28,2 ul av natriumklorid-Tris-EDTA-buffer (STE: 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) i et 1,5 ml rør.
- Plasser røret i kokende vann i 5 min. Slå av varmekilden og la vannet med glødet oligonukleotider kjøle O / N i mørket.
- Fyll ut 5 'overheng av glødet 5'Dye-kort / lang oligonukleotider med Klenow DNA polymerase til dobbelts strandet DNA-prober.
- Forbered reaksjonen ved å blande30 mL av glødet korte / lange oligonukleotider med 5'Dye tag, 8,5 mL av 10x Klenow buffer, 1,7 mL av 10 mM dNTP, 1,7 ul Klenow (3 '-> 5' exo-) (5 u / ul), og 43,1 mL av DDH 2 O i en 0,2 ml PCR rør.
- Inkuber 60 min ved 37 ° C i en PCR-maskin.
- Legg 3,4 pl 0,5 M EDTA for å stoppe reaksjonen og varme inaktiverer ved 75 ° C i 20 min i en PCR-maskin.
- Fortynn utfylte sonder (0,7 um) i STE for endelig konsentrasjon på 0,1 uM.
- Oppbevar oligos ved -20 ° C i mørket inntil klar til bruk. Oligos kan oppbevares i opptil et år i denne tilstanden.
MERK: For å generere DNA-prober med muterte bindingsseter, er mutante versjoner av lange oligonukleotider glødet med 5'Dye merkede korte oligonukleotider, etterfulgt av fill-in på 5 'overheng med Klenow. Det har vist seg at proben med en tråd som er merket med en fluorescerendefargestoff har bare 30% intensitet av proben med begge tråder merket med fargestoff. Hvis signalintensitet må styrkes, blir lange oligonukleotider av begge tilnærmingene merket med fluorescerende fargestoffer ved 5 'termini og glødet for å lage infrarød fluorescerende fargestoff-merkede prober.
3. Utarbeidelse av merking / Cold prober (Konkurrenter)
Merk: Lange oligonukleotider av komplementære sekvenser (Lang og longr) ble glødet for å gjøre umerkede prober for konkurranse analyse med infrarød fluorescerende fargestoff-merkede prober.
- Bland 20 ul av 100 uM Long, 20 ul av 100 uM longr oligonukleotider, og 60 ul av STE i et 1,5 ml rør.
- Plasser røret i kokende vann i 5 minutter, slå av varmekilde og la vannet med glødet oligonukleotider avkjøles over natten.
4. Forpliktende Reaction og elektroforese
- Fremstille 1 ml av 5 x bindingsbuffer ved blanding av 50 mL60; av 1 M Tris-HCl, pH 7,5; 10 ul av 5 M NaCl; 200 ul av 1 M KCl, 5 ul av 1 M MgCl2, 10 pl 0,5 M EDTA, pH 8,0; 5 ul av 1 M DTT; 25 ul av 10 mg / ml BSA og 695 ul av DDH 2 O.
MERK: 5x Binding Buffer kan porsjonert og lagret ved -20 ° C. Et annet punkt å vurdere er at ulike transkripsjonsfaktorer vil ha forskjellige modifikasjoner bindingsbufferen. - Rett før du setter opp bindende reaksjoner, pre-kjøre 5% innfødte polyakrylamidgel i 0.5x TBE + 2,5% glyserol for å fjerne alle spor av ammoniumpersulfat ved 80 V i 30 - 60 min, eller til gjeldende ikke lenger varierer med tiden.
- Sett opp bindingsreaksjonen i endelig volum på 20 ul.
- Bland 4 pl 5 x bindingsbuffer, 80 - 200 ng renset protein A (i 50% glycerol, dvs. SOX-2), 1 ul 0,1 uM Dye-konjugert probe (endelig konsentration: 5 nM), og DDH 2 O.
- Valgfritt: Når kald sonde konkurrenter er nødvendig, legge til ulike konsentrasjoner (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, etc.) av kalde sonder.
- Valgfritt: Når interaksjonen mellom proteinene A og B (dvs. SOX-2 og LIM-4) testes, tilsett 80 - 200 ng renset protein B (i 50% glyserol, dvs. LIM-4).
- Valgfritt: Når kjerneekstrakt preparatet anvendes, og spesifikk binding av protein A som skal valideres, tilsett antistoff som er spesifikt til protein A (dvs. anti-6xHis, anti-FLAG, etc.).
- Inkuber på R / T i mørket i 15 min.
- Laste alle av bindingsreaksjon på gelen og drives av gelen ved 10 V / cm til ønsket avstand.
5. Imaging
MERK: Gelen ble skannet direkte i glassplatene med en avansert infrarød imaging system. Derfor kan gelen løses videre og skannes flere ganger (Tall 1C og
- Rengjør seng av skanneren med DDH 2 O og tørke godt før skanning. Tørk glassplatene i gel og plasserer platene inneholder gel på skanneren.
- Åpne infrarød bildebehandlingsprogrammer og gå til "Acquire fanen. Når tynnere plate (1 mm) er plassert på skanneren, kan du bruke innstillingene for Channel: 700, Intensitet: Auto, Oppløsning: 169 mikrometer, Kvalitet: medium, og Focus offset: 1,5 mm. Når tykkere plate (3 mm) er plassert på skanneren, kan du bruke innstillingene for Channel: 700, Intensitet: Auto, Oppløsning: 84 mikrometer, Kvalitet: medium, og Focus offset: 3,5 mm. Fokus forskyvning avhengerTykkelsen på glassplaten.
- Velg området at gelen opptar på skanneren. Klikk "Start" for å starte skanningen.
- Gjenta elektroforese og skanne dessuten etter behov.
- For å fremstille 30 ml geloppløsning for 4-geler, blandes 5 ml av 30% akrylamid / bis (37,5: 1), 3 ml 5 x TBE (0,45 M Tris-borat, 10 mM EDTA), 1,5 ml 50% Glyserol 300 mL av 10% ammoniumpersulfat, 15 ul TEMED, og 20,2 ml av DDH 2 O grundig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Orange G lasting fargestoff (6x: 0,12 g orange G i 100 ml 30% glyserol) kan tilsettes til bindingsreaksjonen før lasting for å visualisere utviklingen av elektroforese. Andre lasting fargestoffer inkludert bromfenolblått vil bli oppdaget under skanning og derfor forstyrrer bildeanalyse (figur 1B).
I noen tilfeller av EMSAs, særlig hvis atom ekstrakt preparat anvendes, er poly-deoxyinosinic deoxycytidylic (dI-dC) inkludert i bindingsreaksjonen for å redusere ikke-spesifikk binding av proteiner til DNA 11. Imidlertid, 50 ug / ml di-dC opphevet bindingen av renset 6xHis-SOX-2 med 5'Dye DNA-prober (figur 1B).
For å vise binding spesifisitet av de infrarøde fluorescerende fargestoff-merkede DNA-prober, brukte vi WT eller mutant kalde sonder som konkurrenter (
Bindingsspesifisiteten av proteiner kan bli bestemt ved å utføre supershift analyser av protein-DNA interaksjon ved hjelp av antistoffer som er spesifikke for proteinene eller tagger, spesielt når kjerneekstrakt preparatet anvendes for analysen 1. SOX-2 ble merket med 6xHis og flagg epitoper. Tilsetting av en mikrogram anti-6xHis eller 2,5 mikrogram anti-FLAG M2 Antibo dør resulterte i en supershifted SOX-2-DNA-bånd (figur 2).
Figur 1. FEMSA bruker fluorescerende fargestoff-merkede oligonukleotider. (A) Flytskjema for FEMSA. (B) Effekten av bromfenol blått fargestoff, orange G, og dI-dC (1 pg) på FEMSA. 5 nM av 5'Dye-LIM-4 / SOX-2-sonden ble brukt. (C) FEMSA viser binding spesifisitet 6xHis-SOX-2 G73E til SOX-2 målområde for LIM-4 / SOX-2 element. 5 nM av 5'Dye-LIM-4 / SOX-2-sonden ble brukt. LIM-4 / SOX-2 (M), mutante målse. De geler ble skannet på 20 og 40 minutter etter elektroforese. Det skannede bildet oppnådd ved 40 min etter elektroforese ble anvendt for å kvantifisere den fluorescerende intensitet båndet, som ble normalisert ved intensiteten av feltet uten kald probe. AU, vilkårlig enhet.ource.jove.com/files/ftp_upload/54863/54863fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Supershift Analyser av SOX-2-DNA-komplekset ved hjelp FEMSA og antistoffer. SOX-2 ble merket med både 6xHis og FLAG epitoper. Tilsetting av anti-6xHis eller anti-FLAG antistoffer forårsaket en supershift av SOX-to-DNA kompleks. 5'Dye-LIM-4 / SOX-2-probe ble anvendt. Gel bildene ble spleiset mellom banene 2 og 3 for å utelukke irrelevante baner. Gelen ble skannet ved 40, 60, og 90 min etter elektroforese. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
fEMSAs er et effektivt verktøy for å undersøke protein-DNA-interaksjoner, og er et alternativ til radioaktiv merking av DNA. Fluorescerende fargestoffer som for eksempel infrarøde fargestoffer er kommersielt tilgjengelige, og tilveiebringe en sikrere og mer miljøvennlig metode sammenlignet med radioaktiv DNA-merking. EMSAs via infrarød fluorescerende fargestoff-merket oligonukleotider krever ikke postrun gel behandlingstrinn, og dermed spare tid og kostnader sammenlignet med andre DNA merkingsteknikker. Tiden for å påvise bånd som bruker radioaktive EMSAs kan variere fra 30 minutter til flere dager, avhengig av radioaktivitet og konsentrasjonen av DNA-prober som ble testet 1. I kontrast, skanning av FEMSA gels tar i gjennomsnitt 25 minutter, og dermed vesentlig redusere protokollen tid. fEMSAs gir også en betydelig fordel i forhold til radioaktiv merking, som gelen ikke behøver å bli fjernet fra glassplatene for analyse. Dette gjør at gelen som skal skannes på nytt dersom den første strøm som er ikke tilstrekkeligfor å løse protein-DNA komplekser. Opsjon til å forlenge elektroforese er ikke tilgjengelig ved bruk av radioaktive isotoper eller biotin / streptavidin. Viktigst, håndtering av radioaktive materialer utgjør en sikkerhetsrisiko for laboratoriepersonell, mens fluorescerende merking av DNA-prober er ikke farlig, og kan kastes lett. Bruken av streptavidin krever også en lengre periode før deteksjon (ca. 3 timer) 12. Protokollen og resultatene som presenteres her viser at FEMSA er en effektiv og praktisk verktøy for biomedisinsk forskning. Vi har med hell brukt FEMSA å gi mekanistisk innsikt i effekten av SOX-2 G73E mutasjon på spesifikke DNA-bindende aktivitet som fører til lukt nevron identitet transformasjon 5,10.
I det tilfelle at ingen eller svakt signal detekteres ved analyse gelen, kan konsentrasjonen av DNA-proben økes. DNA-prober som brukes i våre forsøk har blitt merket med et fluorescerende fargestoff på enenkelt strand. Selv om denne metoden har arbeidet med hell i sonder som vi har testet, har det blitt rapportert at fluorescerende merking av en enkelt tråd har 30% intensitet av prober som er merket på begge tråder. Hvis intensiteten viser seg å være for lav, er det anbefalt å merke begge trådene av DNA-sonde med et fluorescerende fargestoff. Dersom forskjøvne bånd ikke overholdes, kan protein-DNA-kompleks være ustabil. Glyserol er avgjørende i denne protokollen for å stabilisere protein-DNA interaksjoner. Glyserol er inkludert i støpte geler, det bindende reaksjonen, og den rennende buffer. En annen vurdering er valg av farge når sporing progresjon av prøver gjennom gelen under kjøringen. Orange G er ideell for dette formålet som andre typer lastefargestoffer som bromfenolblått kan forstyrre skanningen av gelen. Prerunning gelen er også viktig for å sikre ammoniumpersulfat fjernes fra gelen før lasting prøver. I tillegg kan bruk av poly dI-dC forstyrre binding av proteinet av interesse med det DNA-probe i fEMSAs. Renheten av proteinet av interesse og mål-DNA integritet er også viktig for deres interaksjon. Det er også viktig å sørge for riktige skanneinnstillingene når du bruker bildebehandlingsprogrammer. Den riktige fokus forskyvning og intensitet parametere er valgt i henhold til tykkelsen av gel plater og intensiteten av DNA-prober.
Tidligere protokoller har blitt beskrevet å utføre fluorescerende EMSAs 13,14. Imidlertid har disse protokollene som kreves bruk av di-dC, og / eller pumpene som brukes til å sirkulere vann for å opprettholde en bestemt temperatur. Protokollen er beskrevet her gir en mye mer detaljert metode, og krever ikke bruk av pumper.
Fremtidige søknader for denne protokollen omfatter overvåking konkurranseanalyser i sanntid. Fluorescensmerkede prober gi oss denne ekstra innsikt, som gels kan skannes flere ganger på forskjellige elektroforese tid points. I tillegg kan DNA-prober av interesse og konkurrerende prober merkes med forskjellige infrarøde fluorescerende fargestoffer, slik at for to-fargeavbildning. Som med alle teknikker, er det begrensninger i ved hjelp av fluorescerende EMSAs. Høyere konsentrasjoner av protein er nødvendig sammenlignet med tradisjonelle EMSAs på grunn av forholdsvis lavere følsomhet. En annen begrensning er kravet om et posisjonsspesifikt bildedannende system med høy oppløsning for å påvise den infrarøde fluorescerende fargestoff. Selv om den opprinnelige kostnaden er høy for å kjøpe skanneren, er langvarig bruk av fluorescerende fargestoff merking kostnadseffektiv. Til tross for disse begrensningene, fluorescerende EMSAs gi en viktig metode for å løse betydelige biologiske spørsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 1610158 | Acrylamide is harmful and toxic. |
| 6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8) | ThermoFisher | MA1-21315 | |
| Anti-Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165-.2MG | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade | New England Biolabs | B9000S | |
| 5'IRDye700-labeled DNA Oligos | Integrated DNA Technologies | Custom DNA oligo | These are referred to as "5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos" in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100 μM scale synthesis and HPLC purification. |
| Klenow Fragment (3'-->5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| LightShif Poly (dI-dC) | ThermoFisher | 20148E | |
| Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | This is referred to as a 'mini protein gel system' in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size. |
| Odyssey CLx Infrared Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey CLx Infrared Imagng System | This is referred to as an 'advanced infrared imaging system' in the manuscript. |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System | This is referred as a 'near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots' in the manuscript. |
| Image Studio software (version 4.0) | LI-COR Biotechnology | Image Studio software | This is referred to as a 'particular imaging software' in the manuscript. |
| Orange G | Sigma-Aldrich | O3756-25G | |
| 6x Orange loading dye | 0.25% Orange G; 30% Glycerol | ||
| 0.5x TBE | 45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA | ||
| 1x TE | 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA | ||
| 1x STE | 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA | ||
| 5x Binding Buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 μg/mL BSA |
References
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions. Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).
- Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations. Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).
- Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels. Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).
- Alqadah, A., et al. Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2. EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).
- Jullien, N., Herman, J. P. LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure. Biotechniques. 51, 267-269 (2011).
- Poulin-Laprade, D., Burrus, V. Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes. Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).
- Ruscher, K., et al. A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay. J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
- Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. Sox2 goes beyond stem cell biology. Cell cycle. , (2016).
- Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins. Biotechniques. 20, 439-444 (1996).
- Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe. Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).
- Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes. Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).
- Steiner, S., Pfannschmidt, T. Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).
