Summary
Vi beskriver här ett optimerat protokoll av fluorescerande Elektro Mobility Shift Analyser (FEMSA) med renade SOX-2-proteiner tillsammans med infraröd fluorescerande färgämnesmärkta DNA-prober som en fallstudie för att ta itu med en viktig biologisk fråga.
Abstract
Elektroforetisk mobilitet förskjutningsanalyser (EMSA) är en instrumental verktyg för att karakterisera interaktioner mellan proteiner och deras mål-DNA-sekvenser. Radioaktivitet har varit den dominerande metoden för DNA-märkning EMSAs. Dock har de senaste framstegen inom fluorescerande färgämnen och scanningsmetoder föranlett användning av fluorescerande märkning av DNA som ett alternativ för radioaktivitet för fördelarna med enkel hantering, vilket sparar tid, minska kostnaderna och förbättra säkerheten. Vi har nyligen använt fluorescerande EMSA (FEMSA) för att framgångsrikt ta itu med en viktig biologisk fråga. Vår FEMSA analys ger mekanistisk insikt i effekten av en missense-mutation, G73E, i den starkt konserverade HMG transkriptionsfaktor SOX-2 på olfactory neuron typ diversifiering. Vi fann att muterade SOX-2 G73E protein förändrar specifik DNA-bindande aktivitet, varigenom lukt neuron identitet omvandling. Här presenterar vi en optimerad och kostnadseffektiv steg-för-steg-protokollför FEMSA med infraröd fluorescerande färgämnesmärkta oligonukleotider som innehåller LIM-4 / SOX-2 intilliggande målställen och renade SOX-2-proteinerna (WT och muterade SOX-2 G73E proteiner) som en biologisk exempel.
Introduction
EMSAs används för att analysera interaktioner mellan DNA och proteiner genom användning av nativt polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) för att lösa en blandning av ett protein av intresse och en märkt DNA-sond innehållande potentiella målställen av proteinet 1. En DNA-prob som är bunden med protein kommer att migrera långsammare jämfört med en fri DNA-sond, och är därför fördröjs i sin migration genom en polyakrylamid-matris. Radiomärkning av DNA med 32 P har varit den dominerande metoden för detektering i EMSAs. Även om tillämpningen av radiomärkning i biokemisk forskning har varit fördelaktigt, är metoder för alternativa DNA märkning med jämförbar känslighet anställs på grund av hälso- och säkerhetsrisker i samband med hantering av radioaktivitet. Dessa alternativa metoder inkluderar konjugering av DNA med biotin två eller digoxigenin (DIG) 3 (av vilka båda är detekteras sedan av kemiluminiscenta system), SYBR grön färgning av PAGE-geler 4,eller direkt detektion av DNA-fluorescerande färgämne konjugat genom att skanna gelen 5,6.
De upplösta geler av EMSAs använder radioaktivt märkta DNA-sonder kräver postrun bearbetning genom autoradiografifilmer eller en fosfor system för att upptäcka radioaktiva signaler 1,7. Geler av EMSAs använder biotin två eller DIG-konjugerade tre DNA-prober måste också behandlas och överföras till ett lämpligt membran och sedan detekteras genom kemiluminescens 6. SYBR grön färgning av gelén kräver postrun gelfärgning och en fluorescerande skanner 4. Eftersom postrun gel bearbetningssteg krävs för EMSAs som använder dessa DNA märkningstekniker, kan den upplösta gelén analyseras endast en gång. I motsats härtill kan DNA-prober märkta med fluoroforer detekteras direkt i gelén inuti glasskivorna av en scanner. Därför kan DNA-proteininteraktioner övervakas och analyserades flera gånger vid olika tidpunkter under körningen, vilketavsevärt minskar tid och kostnad. DNA-fluorescerande färgämne konjugat som har använts för EMSAs inkluderar Cy3 6,8, Cy5 6,8, fluorescein 9, och infraröda fluorescerande färgämnen 4-6.
Transkriptionell reglering kräver protein-DNA interaktioner mellan transkriptionsfaktorer och deras målgener. Samordning av dessa interaktioner genererar olika celltyper från en gemensam stamfader under djurens utveckling. En opartisk framåt genetisk screen identifierat en missense-mutation, G73E, i den starkt konserverade HMG-DNA-bindande domänen av Caenorhabditis elegans transkriptionsfaktorn SOX-2. Mutationen resulterar i en cellidentiteten omvandling av AWB lukt nervceller i AWC lukt nervceller på molekylära, morfologiska och funktionella nivåer 5,10. SOX-2 reglerar differentiellt terminalen differentiering av AWB och AWC nervceller genom att interagera med kontextberoende partner transkriptionsfaktorer och respektiveDNA målställen 5,10. SOX-2 samarbetar med LIM-4 (LHX) i terminal AWB neuronal differentiering, medan SOX-2 partners med CEH-36 (OTX / OTD) i terminal AWC neuronal differentiering. Luciferasrapportör analyser visar att SOX-2 och muterade SOX-2 G73E proteiner har samarbets interaktioner med transkriptions kofaktorer LIM-4 och CEH-36 för att aktivera en promotor som uttrycks i AWB och AWC nervceller. Men SOX-2 och mutant SOX-2 G73E visas differentialaktiveringsegenskaperna hos promotorn. För att undersöka den molekylära grunden för differential DNA bindningsaktiviteter av SOX-2 och SOX-2 G73E, var fEMSAs utfördes med dessa proteiner och deras potentiella målställen.
Först en bioinformatik tillvägagångssätt för att identifiera biologiskt relevanta DNA-bindande sekvenser inom ett kb promotorregion som används i luciferas-analysen. Eftersom flera potentiella SOX-2 bindningsställen var närvarande under hela promotorn, vi fokuseradepå predikterade SOX-2-bindningsställen i anslutning till förmodade CEH-36 eller LIM-4-bindningsställen och evolutionärt konserverade mellan olika nematodarter. Dessa sekvenser togs bort eller muterad, och därefter testades in vivo för sin verksamhet att uttrycka GFP reporter transgener i AWB eller AWC nervceller. Genom detta tillvägagångssätt, identifierade vi potentiella LIM-4 / SOX-2 och CEH-36 / SOX-2 intilliggande målställen som är specifikt erforderliga för expressionen av GFP i AWB och AWC neuroner, respektive 5. Vi undersökte de eventuella skillnader i DNA-bindning av SOX-2 och SOX-2 G73E använder FEMSA med de identifierade LIM-4 / SOX-2 och CEH-36 / SOX-2 intilliggande målställen. Vår EMSA-analys visade att SOX-2 G73E inte binda DNA-sonden som innehåller LIM-4 / SOX-2 intilliggande målställen (som krävs för genuttryck i AWB) så effektivt som WT SOX-2 gjorde. Men SOX-2 och SOX-2 G73E hade ingen skillnad i bindning av DNA-sonden som innehåller CEH-36 / SOX-2adjacent målplats (krävs för genuttryck i AWC) 5,10. Vår FEMSA Analyser ger mekanistiska inblick i naturen av SOX-2 G73E mutation i påverka specifik DNA-bindande aktivitet för AWB-till-AWC cellidentitet transformation fenotyp. Här beskriver vi en optimerad protokoll för FEMSA användning av renade 6xHis-SOX-2 eller 6xHis-SOX-2 G73E tillsammans med infraröd fluorescerande färgämnesmärkta DNA-sonder som innehåller LIM-4 / SOX-2 intilliggande målställen som en fallstudie för att ta itu en viktig biologisk fråga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: EMSAs använder fluorescerande DNA-prober eller andra former av märkt DNA har samma protokoll för protein eller cellextrakt förberedelse, protein-DNA bindningsreaktion, och PAGE gel förberedelse och kör (Figur 1A). De viktigaste skillnaderna är DNA-märkningsförfaranden, post-run gel processteg, och detektionsmetoder.
1. Gel Framställning
- Förbereda 5% nativ polyakrylamidgel innehållande 0,5 x TBE (45 mM Tris-borat, 1 mM EDTA) och 2,5% glycerol, med användning av en mini-protein gelsystem (8,3 cm bredd x 7,3 cm längd x 0,75 mm tjocklek).
- För att framställa 30 ml av gellösningen för 4 geler, blanda 5 ml 30% akrylamid / bis (37,5: 1), 3 ml 5x TBE (0,45 M Tris-borat, 10 mM EDTA), 1,5 ml 50% glycerol, 300 mikroliter av 10% ammoniumpersulfat 15 pl TEMED och 20,2 ml DDH 2 O noggrant.
OBS: Akrylamid är skadligt och giftigt, handtag med lämplig personlig skyddsutrustning. - Kasta gellösningen omedelbart. Efter polymerisering, linda gelerna i klar plastfolie pre-fuktad med 0,5x TBE och förvara dem vid 4 ° C.
2. Framställning av infraröda fluorescerande färgämnesmärkta prober
OBS: Håll infraröda fluorescerande färgämnesmärkta oligonukleotider borta från ljus så mycket som möjligt under framställning, förvaring och experiment.
- Design och order oligonukleotider.
- Design lång oligonukleotid för ~ 51-merer.
OBS: Den långa oligonukleotid-sekvensen av LIM-4 / SOX-2 proben är TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC. Långa oligonukleotider kräver inte PAGE eller HPLC-rening. - Utforma komplementära korta oligonukleotider för ~ 14-merer med infraröd fluorescerande färgämne modifiering vid 5'-terminalen (5'Dye) och en smälttemperatur över 37 ° C.
OBS: Den korta oligonukleotid-sekvensen av LIM-4 / SOX-2 sonden 5'Dye-GGGAGAAGATTTTG. Den minsta syntes skala 5'Dye-märkta korta oligonukleotider är 100 nM. Därför oligonukleotiderna kräver HPLC-rening.
- Design lång oligonukleotid för ~ 51-merer.
- Resuspendera oligonukleotider i 1x Tris-EDTA-buffert (TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) till slutkoncentration av 100 pM.
- Glödgning Short (5'Dye) och långa oligonukleotider.
- Blanda 0,6 mikroliter av 5'Dye-Short oligo (100 | iM), 1,2 | il av Long oligo (100 ^ M), och 28,2 mikroliter av natriumklorid-Tris-EDTA-buffert (STE: 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) i en 1,5 ml rör.
- Placera röret i kokande vatten under 5 min. Stäng av värmekällan och låt vattnet med de hybridiserade oligos kyla O / N i mörker.
- Fylla i 5'-överhängen av glödgade 5'Dye-kort / lång oligos med Klenow DNA-polymeras för att göra dubbelsträngade DNA-prober.
- Bered reaktions genom att blanda30 mikroliter av hybridiserade korta / långa oligonukleotider med 5'Dye tag, 8,5 mikroliter av 10x Klenow buffert, 1,7 mikroliter av 10 mM dNTP, 1,7 mikroliter av Klenow (3 '-> 5' exo) (5 u / | il), och 43,1 mikroliter av DDH 2 O i ett 0,2 ml PCR-rör.
- Inkubera 60 min vid 37 ° C i en PCR-maskin.
- Lägga 3,4 mikroliter 0,5 M EDTA för att stoppa reaktionen och värme inaktivt vid 75 ° C under 20 min i en PCR-maskin.
- Späd ifyllda sonder (0,7 | iM) i STE för slutlig koncentration av 0,1 M.
- Förvara oligos vid -20 ° C i mörker tills den ska användas. Oligos kan förvaras i upp till ett år i detta tillstånd.
OBS: För att generera DNA-prober med muterade bindningsställen är muterade versioner av långa oligonukleotider glödgas med 5'Dye-märkta korta oligonukleotider, följt av ifyllning av 5 'överhäng med Klenow. Det har visats att sonden med en sträng märkta med en infraröd fluorescerandefärgämnet har endast 30% intensitet av proben med båda strängarna märkta med färgämnet. Om signalstyrkan behöver stärkas, är långa oligonukleotider av båda strängarna märkas med infraröda fluorescerande färger på 5-terminaler och glödgas för att göra IR fluorescerande färgämnesmärkta prober.
3. Framställning av omärkt / kall Probes (konkurrenter)
Obs: Långa oligonukleotider med komplementära sekvenser (Lång och longr) annelerades att omärkta prober för konkurrensanalys med infraröd fluorescerande färgämnesmärkta prober.
- Blanda 20 | il av 100 | iM Long, 20 mikroliter av 100 pM longr oligonukleotider, och 60 mikroliter av STE i ett 1,5 ml rör.
- Placera röret i kokande vatten i 5 minuter, stäng av värmekällan och låt vattnet med de hybridiserade oligos svalna över natten.
4. bindningsreaktion och elektrofores
- Förbereda 1 ml av 5x bindningsbuffert genom att blanda 50 | il60; 1 M Tris-HCl, pH 7,5; 10 mikroliter av 5 M NaCl; 200 mikroliter av 1 M KCl, 5 | il av 1 M MgCl2, 10 | il av 0,5 M EDTA, pH 8,0; 5 | il av 1 M DTT; 25 mikroliter av 10 mg / ml BSA, och 695 mikroliter av DDH 2 O.
OBS: 5x Binding Buffer kan alikvoter och lagrades vid -20 ° C. En annan sak att tänka på är att olika transkriptionsfaktorer kommer att ha olika modifieringar av bindningsbuffert. - Precis innan inrätta bindningsreaktioner, pre-kör 5% nativ polyakrylamidgel i 0,5x TBE + 2,5% glycerol för att avlägsna alla spår av ammoniumpersulfat vid 80 V för 30 till 60 minuter, eller tills den aktuella inte längre varierar med tiden.
- Inrättat bindningsreaktionen i slutvolym av 20 mikroliter.
- Blanda 4 mikroliter av 5x bindningsbuffert, 80-200 ng renat protein A (i 50% glycerol, dvs., SOX-2), 1 mikroliter av 0,1 | iM Dye-konjugerad sond (slutlig koncentration: 5 nM), och DDH 2 O.
- Valfritt: När det krävs kalla sond konkurrenter, lägga till olika koncentrationer (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, etc.) kalla sonder.
- Valfritt: När interaktionen mellan proteinerna A och B (dvs, SOX-2 och LIM-4) testas, tillsätt 80 till 200 ng renat protein B (i 50% glycerol, dvs LIM-4).
- Valfritt: När kärnextrakt preparatet används och specifik bindning av protein A som skall valideras, lägga antikropp som är specifik för protein A (dvs anti-6xHis, anti-FLAG, etc.).
- Inkubera vid R / T i mörker under 15 min.
- Ladda alla bindningsreaktionen på gelén och kör gelén vid 10 V / cm till önskat avstånd.
5. Imaging
OBS: Gelén scannades direkt i glasskivorna med ett avancerat infrarött avbildningssystem. Därför kan gelén lösas ytterligare och skannas upprepade gånger (figurerna 1C och
- Rengör botten av skannern med DDH 2 O och torka väl innan scanning. Torka glasplattorna hos gelén och placera plattor innehållande gelen på skannerbädden.
- Öppna den infraröda bildbehandlingsprogram och gå till "Acquire fliken. När tunnare plåt (1 mm) placeras på skanner sängen, använd inställningarna för Kanal: 700, Intensitet: Auto, Upplösning: 169 pm, Kvalitet: medium och Focus offset: 1,5 mm. När tjockare plåt (3 mm) placeras på skanner sängen, använd inställningarna för Kanal: 700, Intensitet: Auto, Upplösning: 84 pm, Kvalitet: medium och Focus offset: 3,5 mm. Fokus offset beror påtjockleken av glasskivan.
- Välj det område som gelen upptar på skannern. Klicka på "Start" för att börja skanningen.
- Upprepa elektrofores och skanna dessutom vid behov.
- För att framställa 30 ml av gellösningen för 4 geler, blanda 5 ml 30% akrylamid / bis (37,5: 1), 3 ml 5x TBE (0,45 M Tris-borat, 10 mM EDTA), 1,5 ml 50% glycerol, 300 mikroliter av 10% ammoniumpersulfat 15 pl TEMED och 20,2 ml DDH 2 O noggrant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Orange G laddningsfärg (6x: 0,12 g Orange G i 100 ml 30% glycerol) tillsättas till bindningsreaktionen före lastning för att visualisera de framsteg av elektroforesen. Andra last färgämnen inklusive bromofenolblått kommer att upptäckas under skanning och därför störa bildanalys (Figur 1B).
I vissa fall av EMSAs, speciellt om kärnextrakt preparatet används, är poly deoxyinosinic-deoxycytidylic (dl-dC) som ingår i bindningsreaktionen för att minska icke-specifik bindning av proteiner till DNA 11. Dock 50 ^ g / ml av dl-dC avskaffade bindningen av renade 6xHis-SOX-2 med 5'Dye DNA-sonder (Figur 1B).
För att visa bindningsspecificitet av infraröda fluorescerande färgämnesmärkta DNA-prober använde vi WT eller muterade kalla sonder som konkurrenter (
Bindningsspecificiteten för proteiner kan bestämmas genom att utföra supershift analyser av protein-DNA-interaktion med användning av antikroppar specifika för proteinerna eller taggar, speciellt när nukleärt extrakt preparatet används för analysen en. SOX-2 märktes med 6xHis och flagga epitoper. Tillsats av 1 ^ g anti-6xHis eller 2,5 | j, g anti-FLAG M2 Antibo dör resulterade i en supershifted SOX-2-DNA-bandet (figur 2).
Figur 1. FEMSA använder infraröda fluorescerande färgämnesmärkta oligonukleotider. (A) Flödesschema för FEMSA. (B) Effekten av bromofenolblått färgämne, orange G, och dl-dC (1 mikrogram) på FEMSA. 5 nM 5'Dye-LIM-4 / SOX-2 prob användes. (C) FEMSA visar bindningsspecificitet av 6xHis-SOX-2 G73E till SOX-2 målstället av LIM-4 / SOX-2 element. 5 nM 5'Dye-LIM-4 / SOX-2 prob användes. LIM-4 / SOX-2 (M), mutanta målställen. Gelerna skannas på 20 och 40 minuter efter elektrofores. Den skannade bilden som erhållits vid 40 min efter elektrofores användes för att kvantifiera den fluorescerande bandintensiteten, som normaliserades genom intensiteten av banan utan någon kall sond. AU, godtycklig enhet.ource.jove.com/files/ftp_upload/54863/54863fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Supershift Analyser av SOX-2-DNA-komplex med hjälp av FEMSA och antikroppar. SOX-2 märktes med både 6xHis och FLAG epitoper. Tillsats av anti-6xHis eller anti-FLAG-antikroppar orsakade en supershift av SOX-2-DNA-komplexet. 5'Dye-LIM-4 / SOX-2 prob användes. Gel bilderna skarvas mellan banorna 2 och 3 för att utesluta irrelevanta körfält. Gelén scannades vid 40, 60, och 90 minuter efter elektrofores. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
fEMSAs är ett effektivt verktyg för att undersöka protein-DNA-interaktioner, och är ett alternativ till radioaktiv märkning av DNA. Fluorescerande färgämnen såsom infraröda färgämnen är kommersiellt tillgängliga, och ger en säkrare och mer miljövänlig metod jämfört med radioaktiv DNA märkning. EMSAs använder infrarött fluorescerande färgämnesmärkta oligonukleotider kräver inte postrun gel processteg, och därför sparar tid och kostnad jämfört med andra tekniker DNA märkning. Tiden för att detektera banden med hjälp av radioaktiva EMSAs kan sträcka sig från 30 min till flera dagar, beroende på radioaktivitet och koncentration av DNA-sondema som testades en. I motsats, scanning av FEMSA geler tar i genomsnitt 25 minuter, vilket avsevärt minskar protokoll tid. fEMSAs ger också en betydande fördel jämfört med radioaktiv märkning, såsom gelén inte behöver tas bort från glasplattor för analys. Detta tillåter att gelén skannas in på nytt om den initiala körningen är inte tillräckligatt lösa protein-DNA-komplex. Alternativet att förlänga elektrofores är inte tillgänglig med hjälp av radioaktiva isotoper eller biotin / streptavidin. Viktigast av allt, hantering av radioaktivt material innebär en säkerhetsrisk för labbpersonal, medan fluorescensmärkning av DNA-prober är inte farlig, och enkelt kan tas om hand. Användningen av streptavidin kräver också en längre period fram till detektering (ca 3 h) 12. Protokollet och resultat som presenteras här visar att FEMSA är ett effektivt och praktiskt verktyg för biomedicinsk forskning. Vi har med framgång använt FEMSA att ge mekanistisk insikt i effekten av SOX-2 G73E mutation på specifik DNA-bindande aktivitet som leder till lukt neuron identitet omvandling 5,10.
I händelse av att ingen eller svag signal detekteras vid analys gelén, kan ökas koncentrationen av DNA-proben. De DNA-sonder som används i våra studier har märkts med en infraröd fluorescerande färgämne på enenkelsträng. Även om denna metod har arbetat framgångsrikt för prober vi har testat, har det rapporterats att fluorescensmärkning av en enda sträng har 30% intensitet av prober som har märkts på båda strängarna. Om intensiteten visar sig vara alltför låg, är det rekommenderat att märka båda strängarna av DNA-sonden med en infraröd fluorescerande färgämne. Om förskjutna band inte följs, kan protein DNA-komplexet vara instabil. Glycerol är avgörande i detta protokoll för att stabilisera protein-DNA interaktioner. Glycerol ingår i gjutna geler, bindningsreaktionen, och löpbufferten. En annan punkt att beakta är valet av färgämne vid spårning progression av prover genom gelén under körningen. Orange G är idealisk för detta ändamål som andra typer av last färgämnen såsom bromofenolblått kan störa scanning av gelén. Prerunning gelén är också viktigt att säkerställa ammoniumpersulfat avlägsnas från gelén innan proverna. Dessutom kan användningen av poly dl-dC störa binding av proteinet av intresse med DNA-proben i fEMSAs. Renhet av proteinet av intresse och mål-DNA-integritet är också viktigt att deras interaktion. Det är också viktigt att säkerställa korrekt skanningsinställningar när du använder bildbehandlingsprogram. Ett lämpligt fokus offset och intensitetsparametrarna väljs i enlighet med tjockleken på gelplattorna och intensiteten av DNA-prober.
Tidigare protokoll har beskrivits för att utföra fluorescerande EMSAs 13,14. Emellertid har dessa protokoll krävs användning av dl-dC, och / eller pumpar används för att cirkulera vatten för att upprätthålla en viss temperatur. Protokollet som beskrivs här ger en mycket mer detaljerad metod, och som inte kräver användning av några pumpar.
Framtida tillämpningar för protokoll inkluderar övervakning konkurrensanalyser i realtid. Fluorescerande prober ger oss detta ytterligare insikt, som geler kan skannas flera gånger vid olika elektrofores tid points. Dessutom kan DNA-sonder av intresse och konkurrent prober märkas med olika IR-fluorescerande färger, vilket möjliggör två-färgbilder. Som med alla tekniker, det finns begränsningar för användning av fluorescerande EMSAs. Högre koncentrationer av protein behövs jämfört med traditionella EMSAs på grund av relativt lägre känslighet. En annan begränsning är behovet av en särskild avbildningssystem med hög upplösning för att detektera den infraröda fluorescerande färgämnet. Även om den initiala kostnaden är hög att köpa skannern, är långvarig användning av infraröd fluorescerande färgämne märkning kostnadseffektivt. Trots dessa begränsningar, fluorescerande EMSAs tillhandahålla en viktig metod för att motverka betydande biologiska frågor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 1610158 | Acrylamide is harmful and toxic. |
| 6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8) | ThermoFisher | MA1-21315 | |
| Anti-Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165-.2MG | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade | New England Biolabs | B9000S | |
| 5'IRDye700-labeled DNA Oligos | Integrated DNA Technologies | Custom DNA oligo | These are referred to as "5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos" in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100 μM scale synthesis and HPLC purification. |
| Klenow Fragment (3'-->5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| LightShif Poly (dI-dC) | ThermoFisher | 20148E | |
| Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | This is referred to as a 'mini protein gel system' in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size. |
| Odyssey CLx Infrared Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey CLx Infrared Imagng System | This is referred to as an 'advanced infrared imaging system' in the manuscript. |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System | This is referred as a 'near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots' in the manuscript. |
| Image Studio software (version 4.0) | LI-COR Biotechnology | Image Studio software | This is referred to as a 'particular imaging software' in the manuscript. |
| Orange G | Sigma-Aldrich | O3756-25G | |
| 6x Orange loading dye | 0.25% Orange G; 30% Glycerol | ||
| 0.5x TBE | 45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA | ||
| 1x TE | 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA | ||
| 1x STE | 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA | ||
| 5x Binding Buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 μg/mL BSA |
References
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions. Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).
- Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations. Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).
- Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels. Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).
- Alqadah, A., et al. Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2. EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).
- Jullien, N., Herman, J. P. LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure. Biotechniques. 51, 267-269 (2011).
- Poulin-Laprade, D., Burrus, V. Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes. Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).
- Ruscher, K., et al. A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay. J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
- Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. Sox2 goes beyond stem cell biology. Cell cycle. , (2016).
- Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins. Biotechniques. 20, 439-444 (1996).
- Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe. Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).
- Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes. Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).
- Steiner, S., Pfannschmidt, T. Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).
