हम अल्जाइमर रोग के कृंतक मॉडल में mononuclear phagocytes से मस्तिष्क amyloid-β (Aβ) phagocytosis की सिलिको मॉडलिंग (q3DISM) में मात्रात्मक 3 डी के लिए एक पद्धति विकसित की है। इस विधि लगभग विवो में किसी भी phagocytic घटना के quantitation के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है।
Neuroinflammation अब neurodegenerative रोग में एक प्रमुख कारक etiological के रूप में पहचाना जाता है। Mononuclear phagocytes सहज प्रतिरक्षा phagocytosis और मलबे और कतरे की निकासी के लिए जिम्मेदार कोशिकाओं रहे हैं। इन कोशिकाओं को सीएनएस-निवासी microglia के रूप में जाना मैक्रोफेज, और mononuclear phagocytes परिधि से घुसपैठ में शामिल हैं। लाइट माइक्रोस्कोपी आम तौर पर कृंतक या मानव मस्तिष्क नमूनों में phagocytosis कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, गुणात्मक विधियों में विवो phagocytosis की निश्चित सबूत नहीं प्रदान की है। यहाँ, हम सिलिको मॉडलिंग (q3DISM), एक मजबूत विधि कृंतक अल्जाइमर रोग (ई) मॉडल में mononuclear phagocytes द्वारा amyloid-β (Aβ) phagocytosis का असली 3 डी quantitation के लिए अनुमति देने में मात्रात्मक 3 डी का वर्णन है। विधि fluorescently visualizing Aβ कृंतक मस्तिष्क वर्गों में phagolysosomes भीतर समझाया शामिल है। बड़े जेड आयामी confocal डेटासेट तो 3 डी A & quantitation के लिए खंगाला हैं# 946; स्थानिक phagolysosome भीतर colocalized। हम माउस और चूहे के दिमाग को q3DISM के सफल आवेदन का प्रदर्शन, लेकिन इस पद्धति वास्तव में किसी भी ऊतक में किसी भी phagocytic घटना के लिए बढ़ाया जा सकता है।
अल्जाइमर रोग (ई), सबसे आम उम्र से संबंधित पागलपन 1, के रूप में "बूढ़ा" β-amyloid सजीले टुकड़े, पुरानी निम्न स्तर neuroinflammation, tauopathy, न्यूरोनल हानि, और संज्ञानात्मक अशांति 2 मस्तिष्क amyloid-β (Aβ) संचय के द्वारा होती है । ई रोगी के दिमाग में, neuroinflammation प्रतिक्रियाशील astrocytes और mononuclear phagocytes द्वारा निर्धारित किया जाता है (microglia के रूप में भेजा है, हालांकि उनके केंद्रीय बनाम परिधीय मूल अस्पष्ट बनी हुई है) के आसपास के Aβ जमा 3। सीएनएस की सहज प्रतिरक्षा प्रहरी के रूप में, microglia केन्द्र मस्तिष्क Aβ स्पष्ट करने के लिए तैनात कर रहे हैं। हालांकि, Aβ सजीले टुकड़े करने के लिए microglial भर्ती बहुत, थोड़ा यदि कोई हो, Aβ phagocytosis 4,5 के साथ है। एक परिकल्पना है कि शुरू में microglia Aβ की छोटी विधानसभाओं phagocytozing द्वारा न्यूरोप्रोटेक्टिव हो रहा है। हालांकि, अंत में इन कोशिकाओं को भारी Aβ बोझ और / या उम्र से संबंधित कार्यात्मक डी के रूप में न्यूरोटोक्सिक हो जाते हैंecline, एक बेकार proinflammatory phenotype में microglia भड़काती, न्यूरोटॉक्सिटी और संज्ञानात्मक गिरावट 6 में योगदान दे।
हाल के जीनोम चौड़ा संघ स्टडीज (GWAS) कोर सहज प्रतिरक्षा रास्ते 7 कि phagocytosis 8-11 मिलाना से संबंधित ई जोखिम alleles के एक समूह की पहचान की है। नतीजतन, मस्तिष्क amyloid बयान के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया दोनों विज्ञापन एटियलजि समझने के संदर्भ में और नए चिकित्सकीय दृष्टिकोण 12-14 के विकास के लिए ब्याज की एक प्रमुख क्षेत्र बन गया है। फिर भी, वहाँ विवो में Aβ phagocytosis का मूल्यांकन करने के कार्यप्रणाली के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। इस unmet की जरूरत को संबोधित करने के लिए, हम सिलिको मॉडलिंग (q3DISM) में मात्रात्मक 3 डी अल्जाइमर रोग की तरह के कृंतक मॉडल में mononuclear phagocytes से मस्तिष्क Aβ phagocytosis का असली 3 डी quantitation सक्षम करने के लिए विकसित किया है।
किस हद तक वे पुनरावृत्ति करना रोग, पशु मॉडल द्वारा ही सीमितई pathoetiology को समझने के लिए और प्रयोगात्मक चिकित्सा विज्ञान के मूल्यांकन के लिए अमूल्य साबित हो। तथ्य यह है कि Presenilin (पी एस) और amyloid अग्रदूत साबित प्रोटीन (एपीपी) जीन में म्यूटेशन स्वतंत्र रूप से autosomal प्रमुख ई पैदा करने के कारण, इन उत्परिवर्ती ट्रांसजीन बड़े पैमाने पर ट्रांसजेनिक कृंतक मॉडल उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। ट्रांसजेनिक एपीपी / PS1 चूहों को एक साथ "स्वीडिश" उत्परिवर्ती मानव एपीपी (एपीपी SWE) और Δ एक्सॉन 9 उत्परिवर्ती मानव presenilin 1 (PS1ΔE9) त्वरित मस्तिष्क amyloidosis और neuroinflammation 15,16 के साथ मौजूद coexpressing। इसके अलावा, हम (एक फिशर 344 पृष्ठभूमि पर लाइन TgF344-ई,) एपीपी दुर्भाग्य और PS1ΔE9 निर्माणों के साथ coinjected द्वि-ट्रांसजेनिक चूहों उत्पन्न किया है। मस्तिष्क amyloidosis के ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के विपरीत, TgF344-ई चूहों के मस्तिष्क amyloid कि tauopathy, न्यूरॉन्स की apoptotic हानि, और व्यवहार हानि 17 पछाड़ विकसित करना।
इस रिपोर्ट में, हम आई एम एम के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णनएपीपी / PS1 चूहों और TgF344-ई चूहों, और बड़े जेड आयामी confocal छवियों के अधिग्रहण से मस्तिष्क वर्गों में microglia, phagolysosomes और Aβ जमा unostaining। हम सिलिको पीढ़ी और microglial phagolysosomes में Aβ तेज की quantitation की इजाजत दी confocal डेटासेट से सच 3D पुनर्निर्माण के विश्लेषण में विस्तार। अधिक मोटे तौर पर, पद्धति है कि यहाँ विस्तार हम विवो में phagocytosis के लगभग किसी भी रूप यों इस्तेमाल किया जा सकता है।
प्रोटोकॉल है कि हम mononuclear phagocytes द्वारा विवो में Aβ phagocytosis का असली 3 डी quantitation के लिए इस रिपोर्ट में वर्णन सेलुलर और subcellular डिब्बों के विशिष्ट लेबलिंग के साथ ही Aβ जमा राशि पर निर्भर करता है। विशेष रूप से, हम Iba1 (आयनि?…
The authors have nothing to disclose.
M-V.G-S. is supported by a BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease Research Fellowship Award (A2015309F) and an Alzheimer’s Association, California Southland Chapter Young Investigator Award. T.M.W. is supported by an ARCS Foundation and John Douglas French Alzheimer’s Foundation Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. This work was supported by the National Institute on Neurologic Disorders and Stroke (1R01NS076794-01, to T.T.), an Alzheimer’s Association Zenith Fellows Award (ZEN-10-174633, to T.T.), and an American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research (M11472, to T.T.). We are grateful for startup funds from the Zilkha Neurogenetic Institute, which helped to make this work possible.
Isoflurane | Abbott | NDC 0044-5260-05 | |
Dissecting scissors | VWR | 82027-582 | |
Dissecting scissors Blunt tip | VWR | 82027-588 | |
Tweezers | VWR | 94024-408 | |
23G needle | VWR | BD305145 | |
peristaltic pump FH10 | Thermo Scientific | 72-310-010 | |
PBS 10X | Bioland Scientific | PBS01-02 | Working concentration 1X |
Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm | Kent Scientific | RBMS-200C | |
Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm | Kent Scientific | RBMS-305C | |
32% Paraformaldehyde aqueous solution | EMS | 15714-S | Caution: Toxic. Working concentration 4% in PBS |
Ethanol | VWR | 89125-188 | Various concentrations, see protocol |
Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura | VWR | 25608-774 | |
Embedding and Infiltration Paraffin | VWR | 15147-839 | |
Microtome Leica RM2125 | Leica Biosystems | ||
Disposable Microtome Blades | VWR | 25608-964 | |
Water bath Leica HI 1210 | Leica Biosystems | ||
Micro slide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4X4L | Caution: Toxic |
Target Retrieval Solution 10X | DAKO | S1699 | Working concentration 1X |
KimWipes | VWR | 21905-026 | |
Hydrophobic PAP pen | VWR | 95025-252 | |
Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
Coverslips | VWR | 48393081 | |
Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
Glass Slide Rack | VWR | 100492-942 | |
Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) | Wako | 019-19741 | Working concentration 1:200 |
Iba1 antibody (polyclonal, goat) | LifeSpan Bioscience | LS-B2645 | Working concentration 1:200 |
rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) | Abcam | ab955 | Working concentration 1:200 |
mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) | Abcam | ab53444 | Working concentration 1:200 |
mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) | Affymetrix | 14-1071 | Working concentration 1:100 |
Beta-Amyloid, 17-24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39220 | Working concentration 1:200 |
Beta-Amyloid, 1-16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39320 | Working concentration 1:200 |
OC antibody (polyclonal, rabbit) | Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) | Working concentration 1:200 | |
Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11001 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 488 rat secondary antibody | Invitrogen | A-11006 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A-11080 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-21235 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-21443 | Working concentration 1:1000 |
Immersion oil | Nikon | ||
A1 Confocal microscope | Nikon | ||
NIS Elements Advanced Research software | Nikon | ||
Imaris:Bitplane software version 7.6 | Bitplane | "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets. | |