Мы разработали методику количественного 3D в силикомарганца моделирования (q3DISM) церебрального амилоида-бета (Ар) фагоцитоза мононуклеарных фагоцитов в грызунах моделях болезни Альцгеймера. Этот метод может быть обобщен для количественному практически любого фагоцитарной события в естественных условиях.
Нейровоспаления в настоящее время признается в качестве основного этиологического фактора в развитии нейродегенеративных заболеваний. Мононуклеарных фагоцитов врожденные иммунные клетки, ответственные за фагоцитоза и обезвреживания мусора и наносов. Эти клетки включают CNS-резидентов макрофаги, известные как микроглии и мононуклеарных фагоцитов Проникнув с периферии. Световая микроскопия чаще всего используется для визуализации фагоцитоз в грызуна или образцов мозга человека. Тем не менее, качественные методы не предоставили окончательные доказательства фагоцитоза в естественных условиях. Здесь мы опишем количественный 3D моделирования в силикомарганца (q3DISM), надежный метод , позволяющий для истинного 3D количественному амилоида-бета (Ар) фагоцитоза мононуклеарных фагоцитов в моделях на грызунах Болезнь Альцгеймера (AD). Способ включает флуоресцентно визуализируя A & beta; инкапсулируются в фаголизосомах в разделах мозга грызуна. Большие Z-мерное конфокальной наборов данных затем 3D реконструированы для количественного A &# 946; пространственно локализуется в пределах фаголизосомы. Мы демонстрируют успешное применение q3DISM к мыши и крысы мозга, но эта методика может быть расширена до практически любого события в фагоцитарной любой ткани.
Болезнь Альцгеймера (AD), самый распространенный возраст слабоумие 1, характеризуется церебрального амилоида-β (Ар) накопления как "старческие" бета-амилоидных бляшек, хронический нейровоспаления низкого уровня, таупатия, гибель нейронов, а также когнитивные нарушения 2 , В AD мозге пациентов, нейровоспаления предназначается под воздействием реактивной астроциты и мононуклеарных фагоцитов (называемый микроглии, хотя их центральных против периферического происхождения , остается неясным) , окружающих A & beta ; 3 -х месторождений. Как врожденной иммунной часовыми ЦНС, микроглии централизованно расположены, чтобы очистить мозг A & beta. Тем не менее, микроглии набор в A & beta ; бляшек сопровождается очень мало, если таковые имеются, Ар фагоцитоза 4,5. Одна из гипотез является то, что микроглии изначально нейропротективная путем phagocytozing небольших сборок A & beta. Тем не менее, в конце концов, эти клетки становятся нейротоксическое, как подавляющее бремя Ар и / или связанных с возрастом функциональной Decline, провоцирует микроглии в дисфункциональной провоспалительного фенотипа, способствуя нейротоксичность и снижение когнитивных 6.
Последние по всему геному ассоциации исследований (GWAS) определили кластер AD аллели риска , принадлежащих к основным врожденных иммунных путей 7 , которые модулируют фагоцитоз 8-11. Следовательно, иммунный ответ на церебрального амилоида стала одной из основных областей интереса, как с точки зрения понимания AD этиологию и для разработки новых терапевтических подходов 12-14. Тем не менее, существует насущная потребность в методологии оценки фагоцитоза Ар в естественных условиях. Для решения этой неудовлетворенной потребности, мы разработали количественное 3D в силикомарганца моделирования (q3DISM) , чтобы включить истинное 3D количественное церебральным Ар фагоцитоза мононуклеарных фагоцитов в моделях грызунов болезнь Альцгеймера, как болезнь.
Ограничено только в той степени, в которой они перепросматривать болезни, животных моделяхоказались бесценными для понимания AD pathoetiology и для оценки экспериментальной терапии. В связи с тем, что мутации в генах пресенилин (PS) и амилоид белка предшественника (АРР), независимо друг от друга вызывают аутосомно-доминантный AD, эти мутантные трансгены широко используются для создания трансгенных моделей на грызунах. Трансгенные мышей APP / PS1 одновременно "шведский совместной экспрессии" мутант человеческого APP (APP SWE) и А экзон 9 мутант человеческого пресенилина 1 (PS1ΔE9) , присутствующие с ускоренным церебральным амилоидозом и нейровоспаления 15,16. Кроме того, мы сгенерировали би-трансгенных крыс coinjected с APP SWE и PS1ΔE9 конструкций (линия TgF344-AD, на фоне Фишер 344). В отличие от трансгенных моделей мышей церебрального амилоидоза, крысы TgF344-AD развить церебральный амилоид , который предшествует таупатия, апоптический потерю нейронов и поведенческие нарушения 17.
В этом докладе мы опишем протокол для IMMunostaining микроглии, фаголизосомах и A & beta; депозиты в срезах мозга мышей APP / PS1 и крыс TgF344-AD, а также приобретение больших Z-мерных конфокальных изображений. Мы подробно в силикомарганца генерации и анализа истинных 3D реконструкций из конфокальной наборов данных , позволяющих количественно оценивать поглощения Ар в микроглии фаголизосомах. В более широком смысле, методология , что мы здесь подробно могут быть использованы для количественной оценки практически любых форм фагоцитоза в естественных условиях.
Протокол , который мы описываем в настоящем докладе , для истинного 3D количественного фагоцитоза Ар в естественных условиях с помощью мононуклеарных фагоцитов зависит от конкретной маркировки клеточных и субклеточных отсеков, а также A & beta ; месторождений. В частности, мы исполь…
The authors have nothing to disclose.
M-V.G-S. is supported by a BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease Research Fellowship Award (A2015309F) and an Alzheimer’s Association, California Southland Chapter Young Investigator Award. T.M.W. is supported by an ARCS Foundation and John Douglas French Alzheimer’s Foundation Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. This work was supported by the National Institute on Neurologic Disorders and Stroke (1R01NS076794-01, to T.T.), an Alzheimer’s Association Zenith Fellows Award (ZEN-10-174633, to T.T.), and an American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research (M11472, to T.T.). We are grateful for startup funds from the Zilkha Neurogenetic Institute, which helped to make this work possible.
Isoflurane | Abbott | NDC 0044-5260-05 | |
Dissecting scissors | VWR | 82027-582 | |
Dissecting scissors Blunt tip | VWR | 82027-588 | |
Tweezers | VWR | 94024-408 | |
23G needle | VWR | BD305145 | |
peristaltic pump FH10 | Thermo Scientific | 72-310-010 | |
PBS 10X | Bioland Scientific | PBS01-02 | Working concentration 1X |
Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm | Kent Scientific | RBMS-200C | |
Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm | Kent Scientific | RBMS-305C | |
32% Paraformaldehyde aqueous solution | EMS | 15714-S | Caution: Toxic. Working concentration 4% in PBS |
Ethanol | VWR | 89125-188 | Various concentrations, see protocol |
Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura | VWR | 25608-774 | |
Embedding and Infiltration Paraffin | VWR | 15147-839 | |
Microtome Leica RM2125 | Leica Biosystems | ||
Disposable Microtome Blades | VWR | 25608-964 | |
Water bath Leica HI 1210 | Leica Biosystems | ||
Micro slide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4X4L | Caution: Toxic |
Target Retrieval Solution 10X | DAKO | S1699 | Working concentration 1X |
KimWipes | VWR | 21905-026 | |
Hydrophobic PAP pen | VWR | 95025-252 | |
Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
Coverslips | VWR | 48393081 | |
Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
Glass Slide Rack | VWR | 100492-942 | |
Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) | Wako | 019-19741 | Working concentration 1:200 |
Iba1 antibody (polyclonal, goat) | LifeSpan Bioscience | LS-B2645 | Working concentration 1:200 |
rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) | Abcam | ab955 | Working concentration 1:200 |
mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) | Abcam | ab53444 | Working concentration 1:200 |
mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) | Affymetrix | 14-1071 | Working concentration 1:100 |
Beta-Amyloid, 17-24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39220 | Working concentration 1:200 |
Beta-Amyloid, 1-16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39320 | Working concentration 1:200 |
OC antibody (polyclonal, rabbit) | Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) | Working concentration 1:200 | |
Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11001 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 488 rat secondary antibody | Invitrogen | A-11006 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A-11080 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-21235 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-21443 | Working concentration 1:1000 |
Immersion oil | Nikon | ||
A1 Confocal microscope | Nikon | ||
NIS Elements Advanced Research software | Nikon | ||
Imaris:Bitplane software version 7.6 | Bitplane | "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets. | |