Nous avons développé une méthodologie pour la 3D quantitative dans la modélisation de silico (q3DISM) de amyloïde cérébrale-β (Aß) phagocytose par les phagocytes mononucléaires dans des modèles de rongeurs de la maladie d'Alzheimer. Cette méthode peut être généralisée pour la quantification de pratiquement tous les cas de phagocytose in vivo.
Neuroinflammation est maintenant reconnu comme un facteur étiologique majeur dans les maladies neurodégénératives. Les phagocytes mononucléaires sont des cellules immunitaires innées responsables de la phagocytose et l'élimination des débris et de détritus. Ces cellules comprennent les macrophages CNS-résidents appelés microglie et phagocytes mononucléaires infiltrant de la périphérie. La microscopie optique a généralement été utilisé pour visualiser la phagocytose des rongeurs ou des échantillons de cerveau humain. Cependant, les méthodes qualitatives ont pas fourni la preuve définitive de la phagocytose in vivo. Ici, nous décrivons 3D quantitative dans la modélisation de silico (de q3DISM), une méthode robuste permettant la vraie quantification 3D de l' amyloïde-β (Aß) phagocytose par les phagocytes mononucléaires dans rongeurs maladie d'Alzheimer (AD) modèles. Le procédé consiste à visualiser fluorescence Aß encapsulé dans phagolysosomes dans les sections rongeur du cerveau. Les grands ensembles de données confocale z-dimensionnelle sont ensuite reconstruits 3D pour la quantification de A &# 946; colocalisés dans l'espace à l'intérieur du phagolysosome. Nous démontrons l'application réussie de q3DISM à la souris et le rat des cerveaux, mais cette méthode peut être étendue à pratiquement tous les cas phagocytaire dans les tissus.
Maladie d'Alzheimer (AD), la démence liée à l'âge le plus courant 1, est caractérisée par amyloïde cérébrale-β (Aß) accumulation sous forme de plaques "séniles" ß-amyloïde, chronique neuroinflammation de bas niveau, tauopathie, perte neuronale, et la perturbation cognitive 2 . Dans AD cerveaux de patients, neuroinflammation est affecté par les astrocytes et les phagocytes mononucléaires réactif (appelé microglie, bien que leurs centrales vs. origine périphérique reste incertaine) entourant les dépôts Aß 3. Comme les sentinelles immunitaires innées du SNC, les microglies sont positionnés centralement pour effacer le cerveau Aß. Cependant, le recrutement microglie aux plaques de Aß est accompagnée de très peu, le cas échéant, la phagocytose de Aß 4,5. Une hypothèse est que les microglies sont initialement neuroprotecteur par phagocytozing petits ensembles de Aß. Cependant, par la suite ces cellules deviennent neurotoxiques comme fardeau écrasant Aß et / ou d fonctionnelle liée à l'âgeECLINE, provoque la microglie dans un phénotype proinflammatoire dysfonctionnel, ce qui contribue à la neurotoxicité et déclin cognitif 6.
Association récentes Études de génome entier (GWAS) ont identifié un groupe d'allèles à risque AD appartenant aux principaux voies immunitaires innées 7 qui modulent la phagocytose 8-11. Par conséquent, la réponse immunitaire à un dépôt amyloïde cérébrale est devenue un domaine d'intérêt majeur, tant en termes de compréhension AD étiologie et pour développer de nouvelles approches thérapeutiques 12-14. Pourtant, il y a un besoin vital de méthodologie pour évaluer la phagocytose Aß in vivo. Pour répondre à ce besoin non satisfait, nous avons développé 3D quantitative dans la modélisation de silico (q3DISM) pour permettre vrai quantification 3D de phagocytose Aß cérébrale par les phagocytes mononucléaires dans des modèles de rongeurs de la maladie d' Alzheimer-like.
Limitée seulement par la mesure dans laquelle elles récapituler les maladies, les modèles animaux ontprouvé une valeur inestimable pour la compréhension de AD pathoetiology et pour évaluer les traitements expérimentaux. Compte tenu du fait que des mutations dans les présénilines (PS) et Amyloid Precursor Protein (APP), des gènes provoquent indépendamment AD autosomique dominante, ces transgènes mutants ont été largement utilisées pour produire des modèles de rongeurs transgéniques. Les souris transgéniques APP / PS1 coexpression simultanément "suédois" APP humaine mutante (APP SWE) et Δ exon 9 mutant de la préséniline 1 humaine (PS1ΔE9) présente avec l' amylose cérébrale accélérée et neuroinflammation 15,16. En outre, nous avons généré des rats bi-transgéniques APP avec co – injectés swe et constructions PS1ΔE9 (ligne TgF344-AD, sur un fond Fischer 344). Contrairement aux modèles de souris transgéniques de l' amylose cérébrale, rats TgF344-AD développent amyloïde cérébrale qui précède tauopathie, perte apoptotique des neurones, et les troubles du comportement 17.
Dans ce rapport, nous décrivons un protocole pour immunostaining microglie, phagolysosomes et dépôts de Aß dans des coupes de cerveau de souris APP / PS1 et rats TgF344-AD, et l'acquisition de grandes images confocale z-dimensionnelle. Nous détaillons dans la production et l' analyse des véritables reconstructions 3D à partir des ensembles de données confocale permettant la quantification de Aß absorption dans phagolysosomes microgliales silico. Plus largement, la méthodologie que nous détaillons ici peut être utilisé pour quantifier pratiquement toute forme de phagocytose in vivo.
Le protocole que nous décrivons dans ce rapport pour une véritable quantification 3D de Aß phagocytose in vivo par des phagocytes mononucléaires repose sur un étiquetage spécifique des compartiments cellulaires et intracellulaires ainsi que les dépôts Aß. Plus précisément, on utilise Iba1 (ionisée calcium Binding molécule adaptatrice 1), une protéine qui est impliquée dans fronçage de la membrane et une phagocytose lors de l' activation des cellules 18, 19, p…
The authors have nothing to disclose.
M-V.G-S. is supported by a BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease Research Fellowship Award (A2015309F) and an Alzheimer’s Association, California Southland Chapter Young Investigator Award. T.M.W. is supported by an ARCS Foundation and John Douglas French Alzheimer’s Foundation Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. This work was supported by the National Institute on Neurologic Disorders and Stroke (1R01NS076794-01, to T.T.), an Alzheimer’s Association Zenith Fellows Award (ZEN-10-174633, to T.T.), and an American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research (M11472, to T.T.). We are grateful for startup funds from the Zilkha Neurogenetic Institute, which helped to make this work possible.
Isoflurane | Abbott | NDC 0044-5260-05 | |
Dissecting scissors | VWR | 82027-582 | |
Dissecting scissors Blunt tip | VWR | 82027-588 | |
Tweezers | VWR | 94024-408 | |
23G needle | VWR | BD305145 | |
peristaltic pump FH10 | Thermo Scientific | 72-310-010 | |
PBS 10X | Bioland Scientific | PBS01-02 | Working concentration 1X |
Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm | Kent Scientific | RBMS-200C | |
Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm | Kent Scientific | RBMS-305C | |
32% Paraformaldehyde aqueous solution | EMS | 15714-S | Caution: Toxic. Working concentration 4% in PBS |
Ethanol | VWR | 89125-188 | Various concentrations, see protocol |
Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura | VWR | 25608-774 | |
Embedding and Infiltration Paraffin | VWR | 15147-839 | |
Microtome Leica RM2125 | Leica Biosystems | ||
Disposable Microtome Blades | VWR | 25608-964 | |
Water bath Leica HI 1210 | Leica Biosystems | ||
Micro slide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4X4L | Caution: Toxic |
Target Retrieval Solution 10X | DAKO | S1699 | Working concentration 1X |
KimWipes | VWR | 21905-026 | |
Hydrophobic PAP pen | VWR | 95025-252 | |
Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
Coverslips | VWR | 48393081 | |
Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
Glass Slide Rack | VWR | 100492-942 | |
Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) | Wako | 019-19741 | Working concentration 1:200 |
Iba1 antibody (polyclonal, goat) | LifeSpan Bioscience | LS-B2645 | Working concentration 1:200 |
rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) | Abcam | ab955 | Working concentration 1:200 |
mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) | Abcam | ab53444 | Working concentration 1:200 |
mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) | Affymetrix | 14-1071 | Working concentration 1:100 |
Beta-Amyloid, 17-24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39220 | Working concentration 1:200 |
Beta-Amyloid, 1-16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39320 | Working concentration 1:200 |
OC antibody (polyclonal, rabbit) | Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) | Working concentration 1:200 | |
Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11001 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 488 rat secondary antibody | Invitrogen | A-11006 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A-11080 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-21235 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-21443 | Working concentration 1:1000 |
Immersion oil | Nikon | ||
A1 Confocal microscope | Nikon | ||
NIS Elements Advanced Research software | Nikon | ||
Imaris:Bitplane software version 7.6 | Bitplane | "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets. | |