Alzheimer hastalığı, kemirgen modellerinde mononükleer fagositler tarafından serebral amiloid-β (Aβ) fagositoz silikon modelleme (q3DISM) nicel 3D için bir yöntem geliştirdi. Bu yöntem, in vivo olarak hemen her fagositik olayın kantitatif için genelleştirilebilir.
Nöroenflamasyon şimdi nörodejeneratif hastalık önemli bir etyolojik faktör olarak kabul edilmektedir. Mononükleer fagositler fagositoz ve enkaz ve döküntü temizlenmesi için sorumlu doğuştan gelen bağışıklık hücreleridir. Bu hücreler, çevreden süzücü mikroglia olarak bilinen merkezi sinir sistemi yerleşik makrofajlar ve mononükleer fagositler bulunmaktadır. Işık mikroskobu genellikle kemirgen ya da insan beyni örneklerinde fagositoz görselleştirmek için kullanılır olmuştur. Ancak, kalitatif yöntemler in vivo fagositoz kesin delil değil. Burada, silikon modelleme (q3DISM), kemirgen Alzheimer hastalığı (AD), bir model mononükleer fagositler tarafından amiloid-β (Aβ) fagositoz gerçek 3D niceliğinin belirlenmesine olanak sağlam bir yöntem kantitatif 3D açıklar. yöntem, floresan Aβ kemirgen beyin bölümlerinde fagolizozomları içinde kapsüllenmiş visualising içerir. Büyük z-boyutlu konfokal veri setleri daha sonra 3D A & miktarının belirlenmesi için yeniden inşa edilir# 946; mekansal phagolysosome içinde kolokalize. Bu fare ve sıçan beynine q3DISM başarılı bir uygulama göstermektedir, ancak bu yöntem herhangi bir dokuda hemen hemen herhangi bir fagositik etkinlik için uzatılabilir.
Alzheimer hastalığı (AD), en sık yaşa bağlı dementia, 1 "senil" β-amiloid plaklarının kronik düşük seviyeli nöroenflamasyonun, tauopathy, nöronal kayıp, ve bilişsel bozukluk 2 gibi serebral amiloid-β (Aβ) birikimi ile karakterize edilir . AD hasta beyinlerinde, Nöroenflamasyon astrositler ve mononükleer fagositler reaktif tarafından tahsis edilir çevreleyen Aβ mevduat 3 (onların periferik kökenli belirsizdir vs merkezi olmasına rağmen, mikroglia olarak anılacaktır). MSS doğuştan gelen bağışıklık gözcüler olarak, mikroglia merkezi beyin Aβ temizlemek için konumlandırılmış. Bununla birlikte, Aβ plaklara mikrogliyal alımları, eğer varsa, çok az Aβ fagositoz 4,5 eşlik eder. Bir hipotez mikroglia Aβ küçük meclisleri phagocytozing başlangıçta nöro-koruyucu olmasıdır. Ancak, sonunda bu hücrelerin ezici Aβ yükü ve / veya yaşa bağlı fonksiyonel d gibi nörotoksik haleecline, nörotoksisite ve bilişsel gerileme 6 katkıda işlevsiz bir proinflamatuar fenotip içine mikroglia kışkırtır.
Son genom Derneği Çalışmaları (GWAS) fagositoz 8-11 modüle çekirdek doğuştan gelen bağışıklık yolların 7 ait AD risk allelleri bir küme belirledik. Sonuç olarak, serebral amiloid birikimi bağışıklık tepkisi AD etiyolojisinin daha iyi anlaşılması açısından ve yeni tedavi yaklaşımları 12-14 geliştirmek için hem ilgi önemli bir alan haline gelmiştir. Bununla birlikte, in vivo koşullarında Aβ fagositoz değerlendirmek için yöntem için önemli bir ihtiyaç vardır. Bu karşılanmamış gereksinimi karşılamak için, Alzheimer-benzeri hastalığının kemirgen modellerinde mononükleer fagositler tarafından serebral Aβ fagositoz gerçek 3D kantitatif sağlamak için silikon modelleme (q3DISM) 'de niceliksel 3D geliştirdik.
Onlar, hayvan modelleri hastalığı recapitulate ölçüde sadece sınırlıAD pathoetiology anlaşılması için ve deneysel terapötik maddelerin değerlendirilmesi için çok değerli kanıtlanmıştır. Presenilin (PS) ve Amiloid Prekürsör Protein (APP) genlerindeki mutasyonlar, bağımsız bir otozomal baskın AH nedeni olduğu gerçeği nedeniyle, bu mutan transgenler yoğun transjenik rodent modelleri oluşturmak için kullanılmıştır. Transgenik APP / PS1 fareler aynı anda "İsveç" mutant insan APP (APPswe) ve hızlandırılmış serebral amiloidoz ve nöro 15,16 ile mevcut Δ ekson 9 mutant insan presenilin 1 (PS1ΔE9) coexpressing. Ayrıca, biz (bir Fischer 344 arka plan üzerinde çizgi TgF344-AD) APP swe ve PS1ΔE9 yapıları ile birlikte enjekte bi-transgenik fareler yarattı. Serebral amiloidoz transgenik fare modellerinde farklı olarak, TgF344-AD sıçan tauopathy, nöronların apoptotik kaybı ve davranış bozukluğu 17 önce gelen serebral amiloid geliştirme.
Bu yazıda imm için bir protokol açıklarAPP / PS1 fareler ve TgF344-AD sıçan ve büyük z boyutlu eş odaklı görüntü edinme beyin bölümlerinde mikroglia fagolizozomları ve Aβ mevduat unostaining. Siliko üretimi ve mikroglial fagolizozomları içine Aβ alımının kantitatif izin konfokal veri setlerinden gerçek 3D rekonstrüksiyon analizinde Biz ayrıntı. Daha genel olarak, burada ayrıntılı metodoloji in vivo fagositoz hemen hemen herhangi bir şekilde ölçmek için kullanılabilir.
Biz mononükleer fagositler tarafından in vivo Aβ fagositoz gerçek 3D kantitatif için bu raporda tarif protokol spesifik hücresel ve hücre içi bölmelerin etiketleme yanı sıra Aβ mevduat dayanmaktadır. Özellikle, Iba1 (İyonize kalsiyum Adaptör molekülü 1. Bağlayıcı), hücre aktivasyonunun 18, 19 üzerine doğrudan membran kırışması oluşur ve fagositoz dahil olan bir proteinin, serebral mononükleer fagositler leke için kullanın. Iba1 + hücre…
The authors have nothing to disclose.
M-V.G-S. is supported by a BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease Research Fellowship Award (A2015309F) and an Alzheimer’s Association, California Southland Chapter Young Investigator Award. T.M.W. is supported by an ARCS Foundation and John Douglas French Alzheimer’s Foundation Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. This work was supported by the National Institute on Neurologic Disorders and Stroke (1R01NS076794-01, to T.T.), an Alzheimer’s Association Zenith Fellows Award (ZEN-10-174633, to T.T.), and an American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research (M11472, to T.T.). We are grateful for startup funds from the Zilkha Neurogenetic Institute, which helped to make this work possible.
Isoflurane | Abbott | NDC 0044-5260-05 | |
Dissecting scissors | VWR | 82027-582 | |
Dissecting scissors Blunt tip | VWR | 82027-588 | |
Tweezers | VWR | 94024-408 | |
23G needle | VWR | BD305145 | |
peristaltic pump FH10 | Thermo Scientific | 72-310-010 | |
PBS 10X | Bioland Scientific | PBS01-02 | Working concentration 1X |
Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm | Kent Scientific | RBMS-200C | |
Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm | Kent Scientific | RBMS-305C | |
32% Paraformaldehyde aqueous solution | EMS | 15714-S | Caution: Toxic. Working concentration 4% in PBS |
Ethanol | VWR | 89125-188 | Various concentrations, see protocol |
Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura | VWR | 25608-774 | |
Embedding and Infiltration Paraffin | VWR | 15147-839 | |
Microtome Leica RM2125 | Leica Biosystems | ||
Disposable Microtome Blades | VWR | 25608-964 | |
Water bath Leica HI 1210 | Leica Biosystems | ||
Micro slide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4X4L | Caution: Toxic |
Target Retrieval Solution 10X | DAKO | S1699 | Working concentration 1X |
KimWipes | VWR | 21905-026 | |
Hydrophobic PAP pen | VWR | 95025-252 | |
Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
Coverslips | VWR | 48393081 | |
Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
Glass Slide Rack | VWR | 100492-942 | |
Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) | Wako | 019-19741 | Working concentration 1:200 |
Iba1 antibody (polyclonal, goat) | LifeSpan Bioscience | LS-B2645 | Working concentration 1:200 |
rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) | Abcam | ab955 | Working concentration 1:200 |
mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) | Abcam | ab53444 | Working concentration 1:200 |
mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) | Affymetrix | 14-1071 | Working concentration 1:100 |
Beta-Amyloid, 17-24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39220 | Working concentration 1:200 |
Beta-Amyloid, 1-16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39320 | Working concentration 1:200 |
OC antibody (polyclonal, rabbit) | Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) | Working concentration 1:200 | |
Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11001 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 488 rat secondary antibody | Invitrogen | A-11006 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A-11080 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-21235 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-21443 | Working concentration 1:1000 |
Immersion oil | Nikon | ||
A1 Confocal microscope | Nikon | ||
NIS Elements Advanced Research software | Nikon | ||
Imaris:Bitplane software version 7.6 | Bitplane | "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets. | |