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Medicine

मात्रात्मक 3 डी doi: 10.3791/54868 Published: December 26, 2016

Summary

हम अल्जाइमर रोग के कृंतक मॉडल में mononuclear phagocytes से मस्तिष्क amyloid-β (Aβ) phagocytosis की सिलिको मॉडलिंग (q3DISM) में मात्रात्मक 3 डी के लिए एक पद्धति विकसित की है। इस विधि लगभग विवो में किसी भी phagocytic घटना के quantitation के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है।

Abstract

Neuroinflammation अब neurodegenerative रोग में एक प्रमुख कारक etiological के रूप में पहचाना जाता है। Mononuclear phagocytes सहज प्रतिरक्षा phagocytosis और मलबे और कतरे की निकासी के लिए जिम्मेदार कोशिकाओं रहे हैं। इन कोशिकाओं को सीएनएस-निवासी microglia के रूप में जाना मैक्रोफेज, और mononuclear phagocytes परिधि से घुसपैठ में शामिल हैं। लाइट माइक्रोस्कोपी आम तौर पर कृंतक या मानव मस्तिष्क नमूनों में phagocytosis कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, गुणात्मक विधियों में विवो phagocytosis की निश्चित सबूत नहीं प्रदान की है। यहाँ, हम सिलिको मॉडलिंग (q3DISM), एक मजबूत विधि कृंतक अल्जाइमर रोग (ई) मॉडल में mononuclear phagocytes द्वारा amyloid-β (Aβ) phagocytosis का असली 3 डी quantitation के लिए अनुमति देने में मात्रात्मक 3 डी का वर्णन है। विधि fluorescently visualizing Aβ कृंतक मस्तिष्क वर्गों में phagolysosomes भीतर समझाया शामिल है। बड़े जेड आयामी confocal डेटासेट तो 3 डी A & quantitation के लिए खंगाला हैं# 946; स्थानिक phagolysosome भीतर colocalized। हम माउस और चूहे के दिमाग को q3DISM के सफल आवेदन का प्रदर्शन, लेकिन इस पद्धति वास्तव में किसी भी ऊतक में किसी भी phagocytic घटना के लिए बढ़ाया जा सकता है।

Introduction

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अल्जाइमर रोग (ई), सबसे आम उम्र से संबंधित पागलपन 1, के रूप में "बूढ़ा" β-amyloid सजीले टुकड़े, पुरानी निम्न स्तर neuroinflammation, tauopathy, न्यूरोनल हानि, और संज्ञानात्मक अशांति 2 मस्तिष्क amyloid-β (Aβ) संचय के द्वारा होती है । ई रोगी के दिमाग में, neuroinflammation प्रतिक्रियाशील astrocytes और mononuclear phagocytes द्वारा निर्धारित किया जाता है (microglia के रूप में भेजा है, हालांकि उनके केंद्रीय बनाम परिधीय मूल अस्पष्ट बनी हुई है) के आसपास के Aβ जमा 3। सीएनएस की सहज प्रतिरक्षा प्रहरी के रूप में, microglia केन्द्र मस्तिष्क Aβ स्पष्ट करने के लिए तैनात कर रहे हैं। हालांकि, Aβ सजीले टुकड़े करने के लिए microglial भर्ती बहुत, थोड़ा यदि कोई हो, Aβ phagocytosis 4,5 के साथ है। एक परिकल्पना है कि शुरू में microglia Aβ की छोटी विधानसभाओं phagocytozing द्वारा न्यूरोप्रोटेक्टिव हो रहा है। हालांकि, अंत में इन कोशिकाओं को भारी Aβ बोझ और / या उम्र से संबंधित कार्यात्मक डी के रूप में न्यूरोटोक्सिक हो जाते हैंecline, एक बेकार proinflammatory phenotype में microglia भड़काती, न्यूरोटॉक्सिटी और संज्ञानात्मक गिरावट 6 में योगदान दे।

हाल के जीनोम चौड़ा संघ स्टडीज (GWAS) कोर सहज प्रतिरक्षा रास्ते 7 कि phagocytosis 8-11 मिलाना से संबंधित ई जोखिम alleles के एक समूह की पहचान की है। नतीजतन, मस्तिष्क amyloid बयान के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया दोनों विज्ञापन एटियलजि समझने के संदर्भ में और नए चिकित्सकीय दृष्टिकोण 12-14 के विकास के लिए ब्याज की एक प्रमुख क्षेत्र बन गया है। फिर भी, वहाँ विवो में Aβ phagocytosis का मूल्यांकन करने के कार्यप्रणाली के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। इस unmet की जरूरत को संबोधित करने के लिए, हम सिलिको मॉडलिंग (q3DISM) में मात्रात्मक 3 डी अल्जाइमर रोग की तरह के कृंतक मॉडल में mononuclear phagocytes से मस्तिष्क Aβ phagocytosis का असली 3 डी quantitation सक्षम करने के लिए विकसित किया है।

किस हद तक वे पुनरावृत्ति करना रोग, पशु मॉडल द्वारा ही सीमितई pathoetiology को समझने के लिए और प्रयोगात्मक चिकित्सा विज्ञान के मूल्यांकन के लिए अमूल्य साबित हो। तथ्य यह है कि Presenilin (पी एस) और amyloid अग्रदूत साबित प्रोटीन (एपीपी) जीन में म्यूटेशन स्वतंत्र रूप से autosomal प्रमुख ई पैदा करने के कारण, इन उत्परिवर्ती ट्रांसजीन बड़े पैमाने पर ट्रांसजेनिक कृंतक मॉडल उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। ट्रांसजेनिक एपीपी / PS1 चूहों को एक साथ "स्वीडिश" उत्परिवर्ती मानव एपीपी (एपीपी SWE) और Δ एक्सॉन 9 उत्परिवर्ती मानव presenilin 1 (PS1ΔE9) त्वरित मस्तिष्क amyloidosis और neuroinflammation 15,16 के साथ मौजूद coexpressing। इसके अलावा, हम (एक फिशर 344 पृष्ठभूमि पर लाइन TgF344-ई,) एपीपी दुर्भाग्य और PS1ΔE9 निर्माणों के साथ coinjected द्वि-ट्रांसजेनिक चूहों उत्पन्न किया है। मस्तिष्क amyloidosis के ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के विपरीत, TgF344-ई चूहों के मस्तिष्क amyloid कि tauopathy, न्यूरॉन्स की apoptotic हानि, और व्यवहार हानि 17 पछाड़ विकसित करना।

इस रिपोर्ट में, हम आई एम एम के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णनएपीपी / PS1 चूहों और TgF344-ई चूहों, और बड़े जेड आयामी confocal छवियों के अधिग्रहण से मस्तिष्क वर्गों में microglia, phagolysosomes और Aβ जमा unostaining। हम सिलिको पीढ़ी और microglial phagolysosomes में Aβ तेज की quantitation की इजाजत दी confocal डेटासेट से सच 3D पुनर्निर्माण के विश्लेषण में विस्तार। अधिक मोटे तौर पर, पद्धति है कि यहाँ विस्तार हम विवो में phagocytosis के लगभग किसी भी रूप यों इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

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अनुसंधान नैतिकता का कथन: इस के साथ साथ विस्तृत जानवरों को शामिल सभी प्रयोगों दक्षिणी कैलिफोर्निया संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित और स्वास्थ्य के दिशा-निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों और आकलन और प्रयोगशाला के प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन से सिफारिशों के साथ सख्त अनुसार में प्रदर्शन किया गया पशु की देखभाल इंटरनेशनल।

1. कृंतक मस्तिष्क अलगाव और immunostaining के लिए तैयारी

पहला दिन:

  1. आयु वर्ग के TgF344-ई चूहों की जगह (14 महीने की उम्र में) या एपीपी / PS1 चूहों (12 महीने की उम्र में) सतत गहरी isoflurane संज्ञाहरण (4%) के तहत। पैर की अंगुली चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की गहराई और वापसी पलटा के अभाव का आकलन करें।
  2. रिब पिंजरे के दोनों पक्षों के माध्यम से कट और दिल को बेनकाब करने के लिए उठा। दिल के बाएं वेंट्रिकल में एक 23 जी सुई डालें और सही आलिंद में एक छोटा सा चीरा बनाते हैं। ठंडा फॉस्फेट बफर खारा के साथ transcardial छिड़काव द्वारा exsanguination करने के लिए आगे बढ़ें(पीबीएस) एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप (चूहों के लिए 30 एमएल, 150 - चूहों के लिए 200 एमएल) का उपयोग।
  3. त्वचा में एक दुम midline चीरा और त्वचा और मांसपेशियों को एक तरफ ले जाते हैं। midline के साथ खोपड़ी के शीर्ष के माध्यम से और आंखों के बीच कट। हड्डी प्लेटें निकालें और खोपड़ी से पूरे मस्तिष्क को अलग।
  4. मस्तिष्क एक राज्याभिषेक कृंतक मस्तिष्क मैट्रिक्स में रखें और यह तिमाहियों में टुकड़ा। 4 डिग्री सेल्सियस पर paraformaldehyde लगानेवाला (पीबीएस में 4% पीएफए) में पीछे तिमाहियों हे / एन (16 ज) सेते हैं। पीबीएस में धो 3x, और फिर 70% इथेनॉल के लिए स्थानांतरण। सावधानी: पीएफए ​​विषैला होता है और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ एक रासायनिक हुड के तहत नियंत्रित किया जाना चाहिए।

दूसरा दिन:

  1. मस्तिष्क तिमाहियों embedding कैसेट में रखें और उत्तरोत्तर क्रमिक अधिक ध्यान केंद्रित किया 1 घंटे इथेनॉल स्नान में ऊतक निर्जलीकरण (70%, 80%, 95%, और 100% X3)।
  2. ऊतक से इथेनॉल लगातार तीन 100% xylene स्नान (1 घंटे प्रत्येक) के साथ साफ। सावधानी: ज़ाइलीन विषाक्त और श हैउचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ एक रासायनिक हुड के तहत नियंत्रित किया जा ould।
  3. (- 58 डिग्री सेल्सियस, 90 मिनट प्रत्येक 56) दो पिघला हुआ पैराफिन मोम स्नान के बाद आयल ब्लॉक में ऊतक शामिल करें।

तीसरा दिन:

  1. 10 आयल एम्बेडेड एक microtome का उपयोग कर दिमाग की माइक्रोन मोटी वर्गों में कटौती। एक पानी के स्नान (1 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस) और वर्गों में डुबकी स्लाइड माइक्रोस्कोप के लिए लागू होते हैं। स्लाइड छोड़ दो हे / एन सुखाने के लिए, स्लाइड के लिए ऊतक आसंजन सुनिश्चित करने।

2. Immunostaining

नोट: एंटीबॉडी के विभिन्न संयोजनों नीचे वर्णित धुंधला प्रक्रिया के लिए उपयोग किया जा सकता है। चूहों और चूहों से मस्तिष्क के ऊतकों के साथ संगत एंटीबॉडी कॉकटेल 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं।

4 दिन:

  1. Deparaffinize मस्तिष्क वर्गों 2x 100% xylene स्नान का उपयोग करते हुए (12 मिनट प्रत्येक)।
  2. followe - 10 मिनट, 5 मिनट के लिए 95%, 10 मिनट के लिए 80%, और 15 मिनट के लिए अंत में 70% के लिए 100% - लगातार इथेनॉल स्नान में मस्तिष्क वर्गों rehydrate3x पीबीएस washes [आरटी पर 5 मिनट, प्रकाश आंदोलन के साथ] द्वारा घ। इस बीच, 95 को गर्मी प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान - 97 डिग्री सेल्सियस चुंबकीय बार सरगर्मी के साथ एक गर्म थाली पर।
  3. 30 मिनट के लिए 97 डिग्री सेल्सियस - 95 पर प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान में मस्तिष्क वर्गों सेते हैं। फिर, पीबीएस में 3x धोने (आरटी पर 5 मिनट, प्रकाश आंदोलन के साथ)।
  4. जल्दी सूख नाजुक कार्य वाइपर का उपयोग ऊतक सूखने से बचने, और एक हाइड्रोफोबिक बाधा कलम के साथ ऊतक क्षेत्र के आसपास एक हाइड्रोफोबिक बाधा आकर्षित करने के लिए स्लाइड। बफर अवरुद्ध [पीबीएस युक्त 0.3% ट्राइटन X-100 और 10% सामान्य गधा सीरम (एनडीएस)], और एक humidified कक्ष में 1 घंटे के लिए आरटी पर सेते के साथ घेर लिया ऊतक क्षेत्र भरें।
  5. (अवरुद्ध बफर में पतला) Iba1 प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ बफर एक humidified कक्ष में 4 डिग्री सेल्सियस पर mononuclear phagocytes लेबल करने के लिए, और सेते हे / एन अवरुद्ध बदलें। एंटीबॉडी मेजबान और काम कर dilutions के लिए, 1 टेबल और सामग्री की तालिका देखें।

दिन 5:

  1. कुल्ला3x पीबीएस स्नान के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी (प्रकाश आंदोलन के साथ आरटी पर 5 मिनट)। 1 घंटे के लिए फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी (एक 594 एनएम उत्सर्जन fluorophore साथ संयुग्मित) (अंधेरे में आरटी पर अवरुद्ध बफर में) 3x पीबीएस स्नान के बाद (प्रकाश आंदोलन के साथ आरटी पर 5 मिनट) के साथ सेते हैं। इस समय, फ्लोरोसेंट संकेत विरंजन से बचने के लिए अंधेरे में वर्गों बनाए रखें।

दिन 6 - 7:

  1. दोहराएँ 2.5 और CD68 के साथ 2.6 (चूहे के दिमाग) या LAMP1 (माउस ऊतक) एंटीबॉडी और उचित माध्यमिक एंटीबॉडी (एक 488 एनएम उत्सर्जन fluorophore के साथ मिलकर) phagolysosomes लेबल करने के लिए कदम।

दिन 7 - 8:

  1. दोहराएँ 2.5 और 2.6 ओसी (चूहा ऊतक) या 4G8 (माउस दिमाग) एंटीबॉडी और उचित माध्यमिक एंटीबॉडी (एक 647 एनएम fluorophore के लिए युग्मित) Aβ जमा लेबल करने के साथ कदम।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, 6E10 एंटीबॉडी सफलतापूर्वक दोनों इस्तेमाल किया जा सकता माउस और चूहा ऊतक पर। उचित एंटीबॉडी संयोजन के लिए, सामग्री की तालिका देखें
  2. अनुमति दें वर्गों के लिए पूरी तरह से सूखे हे / अंधेरे में आरटी पर एन। फिर, कवर एक कवर पर्ची प्रतिदीप्ति बढ़ते मीडिया DAPI युक्त द्वारा सील के साथ नमूनों।

3. बड़े Z ढेर Confocal डेटासेट का अधिग्रहण

नोट: इस प्रोटोकॉल एक पूरी तरह से स्वचालित लेजर स्कैनिंग confocal एक 60x उद्देश्य और 405 एनएम, 488 एनएम, 594 एनएम, और 647 एनएम लेज़रों के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप की आवश्यकता है। सभी उपकरण इमेजिंग और लेजर नियंत्रण सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित कंप्यूटर है। इमेजिंग प्रोटोकॉल, कंप्यूटर, epifluorescent दीपक, माइक्रोस्कोप, लेजर और कैमरे पर बिजली की शुरुआत से पहले।

दिन 9:

  1. 60X खुर्दबीन उद्देश्य का चयन करें। लेंस को विसर्जन के तेल जोड़ें, और खुर्दबीन मंच स्लाइड धारक पर नमूना रखें। उद्देश्य उठाएँ जब तक तेल स्लाइड के साथ संपर्क में आता है। हिप्पोकैम्पस या सेरेब्रल कॉर्टेक्स में amyloid सजीले टुकड़े oculars के माध्यम से epifluorescent रोशनी का उपयोग कर पता लगाने के लिए फोकल हवाई जहाज़ को समायोजित करें।
  2. confocal im मोलहिप्पोकैम्पस या confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा मूषक की त्वचा में amyloid जमा आसपास सक्रिय mononuclear phagocytes की उम्र (60X बढ़ाई, जेड ढेर कदम: 0.25 माइक्रोन <z <0.40 माइक्रोन, चरणों की संख्या 25 <n <35)।

4. q3DISM

नोट: आदेश में महत्वपूर्ण परिणाम उपज के लिए, हम ब्याज के पशु / क्षेत्र प्रति 3 छवियों का एक न्यूनतम का विश्लेषण करने के सुझाव देते हैं। प्रत्येक छवि के लिए, कोशिकाओं की बहुतायत का विश्लेषण करने के लिए प्रयोगात्मक मानदंड के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। (; - डी और 2 सी - डी आंकड़े 1C देख जैसे, mononuclear से दूर या सजीले टुकड़े के साथ जुड़े फ़ैगोसाइट) इस रिपोर्ट में दिखाया प्रतिनिधि परिणाम में, हम 3 कोशिकाओं / स्थिति का विश्लेषण किया।

दिन 10:

  1. वैज्ञानिक 3 डी इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषण सॉफ्टवेयर colocalization (coloc) सभी एक साथ जेड विमानों में Iba1 / CD68 (चूहा ऊतक) या Iba1 / LAMP1 (माउस ऊतक) धुंधला के स्थानिक निकटता के लिए मॉड्यूल के साथ confocal डेटासेट का विश्लेषण।मोबाइल + / CD68 + या मोबाइल + / LAMP1 + colocalization चैनलों कि सक्रिय mononuclear phagocytes भीतर phagolysosomes के अनुरूप बनाएं।
    1. चैनल बी (CD68 के लिए इसी या LAMP1 धुंधला 488 एनएम fluorophore के साथ मिलकर) के लिए चैनल ए के लिए TRITC (Iba1 धुंधला 594 एनएम fluorophore के साथ युग्मित के लिए इसी) और FITC का चयन करें। 'मोड जांच,' 'सीमा' का चयन करने के लिए और 'coloc तीव्रता,' चयन 'स्रोत' चैनल के लिए सॉफ्टवेयर विंडो के दाएँ हाथ की ओर।
    2. सॉफ्टवेयर विंडो के दाएँ हाथ की ओर 'coloc रंग' का चयन करने के लिए 'संपादन' पर क्लिक करें।
    3. स्वतंत्र रूप से प्रत्येक चैनल के लिए, विशिष्ट धुंधला शामिल और बाहर पृष्ठभूमि / गैर विशिष्ट संकेतों के थ्रेसहोल्ड समायोजित करें। एक बार समायोजित, एक निष्पक्ष विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए छवियों के बीच थ्रेसहोल्ड बदल नहीं है। colocalized voxels (सभी जेड के ढेर से पिक्सल) सभी Z ढेर सिम में कदम 4.1.2 में चयनित रंग में दिखाई देगाultaneously।
    4. 'Coloc चैनल का निर्माण' पर क्लिक करें। colocalization बनाया चैनल प्रदर्शन समायोजन विंडो में दिखाई देगा।
    5. चैनल के आंकड़े को खोलने के लिए coloc चैनल पर क्लिक करें। 'Colocalized सीमा से ऊपर मात्रा / सामग्री एक के%' Iba1 संकेत (594 एनएम fluorophore के लिए इसी voxels) LAMP1 या CD68 संकेत (488 एनएम fluorophore के लिए इसी voxels) के साथ colocalized का% का प्रतिनिधित्व करता है। अधिक बस, इस एककेंद्रकश्वेतकोशिका मात्रा phagolysosomes (आंकड़े 1 सी और -2 सी देखें) के कब्जे में है।
      नोट: 'colocalized सीमा से ऊपर मात्रा / सामग्री बी के%' LAMP1 या CD68 संकेत Iba1 साथ colocalized का% से मेल खाती है। यह 100% के करीब होना चाहिए, के रूप में phagolysosomes intracellular संरचनाओं हैं। मान colocalized सीमा से ऊपर सभी जेड के ढेर से संकेत के अनुपात के आधार पर कर रहे हैं।
  2. coloc मॉड्यूल का उपयोग करना, आयोजन समिति (चूहा तिवारी के साथ स्थानिक निकटता के लिए 4.1 चरण में बनाया coloc चैनल का विश्लेषणssue) या 4G8 (माउस ऊतक) Aβ का संकेत है। इस Aβ के quantitation phagolysosomes भीतर समझाया के लिए अनुमति देता है।
    1. चैनल एक coloc डाटासेट और चैनल बी (ओसी या 4G8 धुंधला 647 एनएम fluorophore के साथ युग्मित के लिए इसी) के लिए Cy5 (Iba1 / CD68 या Iba1 / LAMP1 coloc चैनल 4.1 चरण में बनाया करने के लिए इसी) का चयन करें।
    2. 4.1.5 करने के लिए कदम 4.1.2 में वर्णित के रूप में एक coloc चैनल बनाएँ।
    3. चैनल के आंकड़े को खोलने के लिए coloc चैनल पर क्लिक करें। 'Colocalized सीमा से ऊपर मात्रा / सामग्री एक के%' Iba1 / LAMP1 या Iba1 / CD68 (voxels coloc कदम 4.1.5 में बनाया चैनल के लिए इसी।) ओसी या 4G8 संकेत (voxels 647 के लिए इसी के साथ colocalized के% का प्रतिनिधित्व एनएम fluorophore)। इस phagolysosomal Aβ (आंकड़े -1 डी और 2 डी देखें) के कब्जे में मात्रा है।
      नोट: 'colocalized सीमा से ऊपर मात्रा / सामग्री बी के%' phagolysosomes साथ colocalized कुल Aβ संकेत के% के साथ मेल खाती है।इस phagolysosomes (वर्तमान प्रतिनिधि परिणाम में नहीं दिखाया गया है) के भीतर समझाया कुल Aβ जमा के अंश का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. confocal छवि के ढेर को फिर से संगठित और Aβ के 3D मॉडल एककेंद्रकश्वेतकोशिका phagolysosomes भीतर समझाया उत्पन्न करने के लिए पार मॉड्यूल का प्रयोग करें।
    1. 'प्रदर्शन समायोजन' विंडो में, TRITC का चयन करें (केवल Iba1 धुंधला दिखाने के लिए)। 'मात्रा गुण' विंडो में, 'नई सतह जोड़ें' पर क्लिक करें।
    2. कदम '1/5 एल्गोरिथ्म', में में 'सेटिंग', 'सतह' को चुनें। इसके अलावा, में 'रंग' पैलेट या आरजीबी में रंग प्रकार का चयन करें और पारदर्शिता को समायोजित (लाल आंकड़े 1 बी और 2 बी में 60% पारदर्शिता पर सेट किया जाता है)। बॉक्स को चेक करें 'ब्याज के क्षेत्र का चयन करें। अगला पर क्लिक करें।
    3. चरण में 'रुचि 2/5 क्षेत्र है,' एक्स, वाई का समायोजन करके ब्याज की सेल के चारों ओर एक खिड़की आकर्षित और जेड निर्देशांक (आंकड़े 1A में सफेद बक्से देखना 2 ए)। अगला पर क्लिक करें।
    4. चरण '3/5 स्रोत चैनल' में, TRITC स्रोत चैनल का चयन करें। 0.4 माइक्रोन के लिए बॉक्स 'चिकनी,' और सेट सतह क्षेत्र के विस्तार के स्तर की जाँच करें। के लिए 'thresholding,' पूर्ण तीव्रता का चयन करें। अगला पर क्लिक करें।
    5. चरण में '4/5 दहलीज,' सीमा को समायोजित इतना है कि मात्रा बनाया TRITC चैनल संकेत के साथ पूरी तरह से overlaps। अगला पर क्लिक करें।
    6. चरण में '5/5 वर्गीकृत सतहों,' खंड में 'फिल्टर प्रकार,' वस्तुओं उनके आकार पर निर्भर करता है शामिल है या मात्रा में पैदा किए जाने से बाहर रखा जाना करने के लिए चयन करें। , समाप्त क्लिक करें सारी सृष्टि कदम पर अमल, और विज़ार्ड से बाहर निकलें।
    7. दोहराएँ 4.3.1 4.3.6 करने के लिए कदम FITC चैनल (LAMP1 + या CD68 + phagolysosomes) के लिए एक 3 डी सतह बनाने के लिए।
    8. दोहराएँ 4.3.1 4.3.6 करने के लिए कदम Cy5 चैनल के लिए (ओसी + या 4G8 + Aβ जमा) एक 3 डी सतह बनाने के लिए।

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Representative Results

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के लिए q3DISM ऊपर विस्तृत बहुमंज़िला पद्धति का प्रयोग, हम एपीपी / PS1 चूहों (चित्रा 1) और TgF344-ई चूहों (चित्रा 2) के दिमाग में monocyte phagolysosomes में Aβ तेज यों करने में सक्षम हैं। इसलिए, q3DISM कार्यप्रणाली ईस्वी के माउस और चूहे मॉडल में mononuclear phagocytes के विश्लेषण के लिए सक्षम है। दिलचस्प बात यह मात्रा CD68 + phagolysosomes के कब्जे में काफी दोनों एपीपी / PS1 चूहों (चित्रा 1 बी, सी) और TgF344-ई चूहों (चित्रा 2 बी, सी) में सजीले टुकड़े से दूर की तुलना के साथ जुड़े Iba1 + mononuclear phagocytes में वृद्धि हुई है। इन आंकड़ों से पता चलता है कि सजीले टुकड़े के पास mononuclear phagocytes पट्टिका से दूर स्थित कोशिकाओं की तुलना में phagocytosis के लिए तैयार कर रहे हैं। आदेश में अलग Aβ conformers धुंधला से डेटा की श्रेणी उदाहरण देकर स्पष्ट करने के लिए, हम माउस और चूहे के ऊतकों में विभिन्न एंटीबॉडी का इस्तेमाल (टा में विस्तृतble 1 और चर्चा) - हम सीधे Aβ phagocytosis के संबंध के साथ ई के माउस और चूहे मॉडल की तुलना करने की मांग नहीं कर रहे हैं। बहरहाल, यह उल्लेखनीय था कि पट्टिका जुड़े mononuclear phagocytes एपीपी / PS1 चूहों में Aβ तेज वृद्धि हुई थी सजीले टुकड़े (चित्रा -1) से दूर कोशिकाओं की तुलना में। TgF344-ई चूहों समग्र Aβ तंतुओं का बहुत मामूली तेज है, और कोई सजीले टुकड़े से दूरी के एक समारोह के रूप में Aβ तंतु phagocytosis में परिवर्तन (चित्रा 2 डी) था।

तालिका एक
तालिका 1: Immunostaining mononuclear phagocytes, Phagolysosomes और एपीपी / PS1 चूहों या TgF344-ई चूहों से मस्तिष्क के ऊतकों में amyloid-β। चूहा या माउस विशिष्ट एंटीबॉडी कॉकटेल कोष्ठकों में उनके संबंधित मेजबान के साथ सूचीबद्ध हैं। रंग माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए इस्तेमाल किया fluorophore संकेत मिलता है। लाल: एलेक्सा स्त्राव 594; ग्रीन: एलेक्सा स्त्राव 488;मैजेंटा: एलेक्सा स्त्राव 647।

आकृति 1
चित्रा 1: दृश्य और एपीपी / PS1 माउस दिमाग में amyloid-β phagocytosis की Quantitation। (ए) एक एपीपी / PS1 माउस से मस्तिष्क वर्गों दिखा Iba1 + कोशिकाओं (लाल), LAMP1 + phagolysosomes (हरा) और 4G8 + amyloid जमा (मैजंटा) के confocal छवियों। इनसेट 1, एक mononuclear भक्षककोशिकीय पट्टिका से दूर प्रकाश डाला गया है, जबकि इनसेट 2 पट्टिका के साथ जुड़े एक mononuclear भक्षककोशिकीय पता चलता है। स्केल बार 50 माइक्रोन अर्थ। सही पर छोटे पैनलों insets 1 और 2 स्केल पट्टी के लिए Iba1, LAMP1 की enlargements और insets 1 और Iba1, LAMP1 2. (बी) 3 डी पुनर्निर्माण के भीतर 4G8 संकेतों और 4G8 संकेत हैं 3 माइक्रोन अर्थ। (सी) Iba1 + mononuclear भक्षककोशिकीय LAMP1 + phagolysosomes के कब्जे में मात्रा के quantitation। ( + Aβ के कब्जे में intracellular LAMP1 + phagolysosomal मात्रा के quantitation। मान सीमा से ऊपर संकेत के अनुपात (voxels) कि colocalized कर रहे हैं पर आधारित हैं। डेटा के रूप में मतलब ± सजीले टुकड़े से दूर mononuclear phagocytes के लिए मतलब (एन = 6 कोशिकाओं) की मानक त्रुटि को दिखाया जाता है (1), या सजीले टुकड़े के साथ जुड़े (2)। ** पी <0.01 छात्र की टी परीक्षण के द्वारा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: दृश्य और amyloid-β phagocytosis की Quantitation TgF344-ई चूहे के दिमाग में। (ए) एक TgF344-ई चूहे से मस्तिष्क वर्गों Iba1 + कोशिकाओं को दिखाने का Confocal छवियों (लाल), CD68 + phagolysosomes (हरा), और ओसी + घुलनशील fibrillar ए & # 946; (मैजंटा)। इनसेट 1, एक mononuclear भक्षककोशिकीय पट्टिका से दूर प्रकाश डाला गया है, जबकि इनसेट 2 पट्टिका के साथ जुड़े एक mononuclear भक्षककोशिकीय पता चलता है। स्केल बार 50 माइक्रोन अर्थ। सही पर छोटे पैनलों insets 1 और 2 स्केल पट्टी के लिए insets 1 और 2 (बी) Iba1, CD68 के 3D पुनर्निर्माण और आयोजन समिति के संकेतों के भीतर Iba1, CD68 के enlargements और आयोजन समिति के संकेत हैं अर्थ 3 माइक्रोन। (सी) Iba1 + mononuclear भक्षककोशिकीय CD68 + phagolysosomes के कब्जे में मात्रा के quantitation। (डी) ओसी + Aβ के कब्जे में intracellular CD68 + phagolysosomal मात्रा के quantitation। मान सीमा से ऊपर संकेत के अनुपात (voxels) कि colocalized कर रहे हैं पर आधारित हैं। डेटा के रूप में मतलब ± सजीले टुकड़े से दूर mononuclear phagocytes के लिए मतलब (एन = 6 कोशिकाओं) की मानक त्रुटि को दिखाया जाता है (1), या सजीले टुकड़े के साथ जुड़े (2)। ** पी <0.01 छात्र की टी परीक्षण के द्वारा।rge.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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प्रोटोकॉल है कि हम mononuclear phagocytes द्वारा विवो में Aβ phagocytosis का असली 3 डी quantitation के लिए इस रिपोर्ट में वर्णन सेलुलर और subcellular डिब्बों के विशिष्ट लेबलिंग के साथ ही Aβ जमा राशि पर निर्भर करता है। विशेष रूप से, हम Iba1 (आयनित कैल्शियम अडैप्टर अणु 1 बंधन), एक प्रोटीन है कि सेल सक्रियण 18, 19 पर झिल्ली ruffling और phagocytosis में शामिल है, मस्तिष्क mononuclear phagocytes दाग का उपयोग करें। Iba1 + कोशिकाओं आम तौर पर मस्तिष्क निवासी microglia के रूप में माना जाता है, यह संभव है कि सतही तौर पर बनी हुई घुसपैठ mononuclear phagocytes immunolabeled कोशिकाओं के एक सबसेट शामिल। LAMP1 20 या CD68 21: intracellular phagolysosomes एंटीबॉडी लाइसोसोमल / endosomal जुड़े झिल्ली ग्लाइकोप्रोटीन (दीपक) परिवार के सदस्यों को पहचानने के साथ पता चला रहे हैं। मुख्य रूप से उत्तरार्द्ध, लाइसोसोम और endosomes के लिए स्थानीय है एक छोटे अंश सेल एस के लिए घूम साथurface। LAMP1 और CD68 एंटीबॉडी दोनों सफलतापूर्वक चूहा और माउस के ऊतकों में इस्तेमाल किया गया है, और जिस पर उपयोग करने के निर्णय मुख्य रूप से अन्य सह-धुंधला (1 टेबल देखें) के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के मेजबान पर निर्भर है। यह जानते हैं कि विभिन्न एंटीबॉडी Aβ का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता होना जरूरी है। माउस के ऊतकों में, 4G8 (मानव और माउस अमीनो एसिड के अवशेष 17 पहचानने - Aβ पेप्टाइड 22, चित्रा 1 24) और 6E10 (पहचानने मानव अमीनो एसिड के अवशेष 1 - 17 23, नहीं दिखाया डेटा) को सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है, का पता लगाने और quantitation की इजाजत दी LAMP1 + या CD68 + Iba1 + mononuclear phagocytes में मौजूद phagolysosomes में Aβ सामग्री की। / - - हमारे q3DISM पद्धति का प्रयोग, हम Iba1 + के APPPS1 / आईएल -10 दिमाग में Aβ लोड की वैश्विक कमी के साथ जुड़े कोशिकाओं में वृद्धि हुई Aβ लोड मनाया चूहों 16, जबकि दूसरों को दिखाया Iba1 + में Aβ तेज कमी आई है < / sup> चीर-5xfAD चूहों 24 के दिमाग में वृद्धि हुई Aβ लोड और पट्टिका मात्रा के साथ कोशिकाओं। इन परिणामों का सुझाव है कि घटना मनाया, एक सक्रिय Aβ phagocytosis की "स्नैपशॉट" है, हालांकि हमारी कार्यप्रणाली की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, तो फैगोसाइटोसयुक्त सामग्री कुशलता से पचता है और मंजूरी दे दी है।

चूहे के ऊतकों में, हम ओसी का उपयोग कर Aβ जमा पता लगाया या 6E10 17 (नहीं दिखाया गया है) (घुलनशील Aβ 42 oligomers / तंतुओं 25,26, चित्रा 2 पहचानने)। दिलचस्प है, बहुत कम ओसी + तंतुओं TgF344-ई चूहे के दिमाग में monocyte phagolysosomes में उपस्थित थे। यह घटना पहले से APP23 ट्रांसजेनिक immunogold धुंधला और 3 डी पुनर्निर्माण 27 का प्रयोग चूहों में सूचना दी गई है। नोट: विभिन्न प्रजातियों Aβ / conformers का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी की एक किस्म उपलब्ध हैं और संभवतः परीक्षण किया है और उपयोगकर्ता के विवेक पर नियोजित किया जा सकता है।

NT "> हमारे q3DISM तकनीक हमें और दूसरों के द्वारा अपनाया गया है ई 16,24,28 के संदर्भ में Aβ phagocytosis यों की। हालांकि, विधि phagocytosis के लगभग किसी भी रूप का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह भी ऊतकों को लागू किया जा सकता है अन्य मस्तिष्क की तुलना में, और अन्य जानवरों की प्रजातियों (मानव सहित) के लिए। प्रक्रियाओं इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, मानक immunostaining पर भरोसा प्रतिदीप्ति के साथ पता लगाया और एक confocal खुर्दबीन के साथ imaged। इस रिपोर्ट में, हम दिशा-निर्देशों के अनुसार आयल एम्बेडेड ऊतक का इस्तेमाल किया है एंटीबॉडी निर्माताओं द्वारा प्रदान की। अगर वांछित, वर्तमान प्रोटोकॉल भी ताजा ऊतक (पीबीएस में 2% agarose में एम्बेडेड) के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल भी प्रोटीन coaggregating के phagocytosis पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह धुंधला हो जाना और प्राप्त करके ही संभव बनाया है छवियों और अधिक से अधिक 4 फ्लोरोसेंट रंगों 29 की रचना की। इस मामले में, पहले colocalization चैनल (monocyte / phagolysosome) के निर्माण के सृजन के बाद किया जाएगाएक दूसरे colocalization चैनल के (एकत्रित प्रोटीन 1 / सह एकत्रित प्रोटीन 2)। फिर, दो चैनलों 3 डी विश्लेषण और मॉडलिंग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

q3DISM तकनीक विशिष्टता और immunostaining, एंटीबॉडी की गुणवत्ता की संवेदनशीलता, और colocalization दृष्टिकोण द्वारा मुख्य सीमित है। इस multistep प्रक्रिया में कुछ संभावित नुकसान है कि धुंधला की गुणवत्ता और इसलिए, Aβ तेज की 3 डी quantitation को प्रभावित कर सकता है। प्रक्रिया का पहला महत्वपूर्ण कदम कृंतक दिमाग के अलगाव है। दरअसल, सावधान ऊतक से निपटने के मस्तिष्क को नुकसान से बचने के लिए और गारंटी है कि मस्तिष्क संरचना बरकरार रहेगा जब sectioned मौलिक है। दूसरा, ऊतक निर्धारण समय के बाद से ओवर-निर्धारण (4% पीएफए ​​में अधिक से अधिक 16 ज) subcellular phagolysosomes और Aβ सामग्री का पता लगाने सीमा काफी महत्वपूर्ण है। महत्वपूर्ण बात है, 1) monocytes, 2) phagolysosomes की लगातार धुंधला और 3) Aβ विधि की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। यह essent हैial का उपयोग करने के लिए एंटीबॉडी समन्वित रूप से नहीं consecutively-। इसके अतिरिक्त, जेड ढेर confocal छवियों के अधिग्रहण की कोशिकाओं, phagolysosomes और Aβ पेप्टाइड का 3 डी मॉडलिंग के साथ-साथ colocalization विश्लेषण के बाद से ऊतक अनुभाग की मोटाई के माध्यम से सेलुलर और subcellular संरचनाओं की इमेजिंग की गुणवत्ता पर निर्भर करती है, अत्यंत महत्व का है। अंत में, सॉफ्टवेयर में थ्रेसहोल्ड के समायोजन के लिए 3 डी मॉडलिंग और colocalization विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। दरअसल, विभिन्न चैनलों के लिए थ्रेसहोल्ड सावधानी से विश्लेषण से चुना करने के लिए किया जा के बाद से वे तय करेंगे जो संकेत शामिल है (विशिष्ट) या बाहर रखा गया (पृष्ठभूमि) की जरूरत है। यह भी मौलिक है कि थ्रेसहोल्ड चुना विभिन्न जानवरों / नमूनों की तुलना के मामले में नमूने के बीच लगातार बने हुए है। अब तक, शास्त्रीय immunohistostaining, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग और पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी इन विवो दृश्य और Aβ के quantitation के लिए पसंद की इमेजिंग तरीकों किया गया है30। मूषक या ई रोगियों के दिमाग में amyloid बोझ से बड़े पैमाने पर quantitation के लिए अत्यधिक उपयोगी हालांकि, इन तरीकों intracellular Aβ के दृश्य के लिए अक्षम हैं। Confocal माइक्रोस्कोपी, प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी और प्रवाह का उपयोग अन्य तकनीकों cytometry मौजूद हैं और भेदभाव और इन विट्रो 16,31,32 में intracellular Aβ सामग्री यों करने के लिए हमें और दूसरों के द्वारा इस्तेमाल किया गया है। Immunogold धुंधला 3 डी पुनर्निर्माण के साथ मिलकर पहले APP23 ट्रांसजेनिक चूहों 27 में vivo में microglia भीतर amyloid तंतु के अभाव को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और एक अन्य अध्ययन सफलतापूर्वक microglia जुड़े β-amyloid सजीले टुकड़े के साथ की confocal इमेजिंग और 3 डी सतह पुनर्निर्माण के लिए इस्तेमाल किया सीमित Aβ दिखाने के लिए बातचीत और तेज 33। हालांकि, इन तकनीकों इंट्रा-phagolysosomal Aβ प्रजातियों के quantitation के लिए अनुमति नहीं है। दूसरों के हाल ही में विवो परख में एक प्रतिदीप्ति आधारित माप की अनुमति देता है विकसित किया हैचूहे 34 में परिधीय मैक्रोफेज द्वारा phagocytic गतिविधि की। इस विधि प्रवीणा की अनुमति देता है विवो में phagolysosomes में फ्लोरोसेंट bioprobes के quantitation के लिए, हालांकि, उपलब्ध आंकड़ों अब तक परिधि तक सीमित हैं।

हमारे ज्ञान करने के लिए, q3DISM पहली विधि है कि 3 डी दृश्य और कृंतक ई मॉडल के दिमाग में Aβ phagocytosis की quantitation देता है। इस विकट उपकरण निस्संदेह मस्तिष्क Aβ phagocytosis की एक गहरी समझ के लिए मार्ग प्रशस्त होगा, और भी अन्य संदर्भों में उपयोगी साबित हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott NDC 0044-5260-05
Dissecting scissors VWR 82027-582
Dissecting scissors Blunt tip VWR 82027-588
Tweezers VWR 94024-408
23 G needle VWR BD305145
peristaltic pump FH10 Thermo Scientific 72-310-010
PBS 10x Bioland Scientific PBS01-02 Phosphate-buffered Saline; Working concentration 1x
Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm  Kent Scientific RBMS-200C
Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm  Kent Scientific RBMS-305C 
32% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) EMS 15714-S Caution: Toxic. Working concentration: 4% in PBS
Ethanol VWR 89125-188 Various concentrations, see protocol
Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura VWR 25608-774
Embedding and Infiltration Paraffin VWR 15147-839
Microtome Leica RM2125 Leica Biosystems
Disposable Microtome Blades  VWR 25608-964
Water bath Leica HI 1210 Leica Biosystems
Micro slide Superfrost plus VWR 48311-703
Xylene Sigma-Aldrich 534056-4X4L Caution: Toxic 
Target Retrieval Solution 10x DAKO S1699 Working concentration 1x
KimWipes VWR 21905-026
Hydrophobic PAP pen VWR 95025-252
Triton X-100 VWR 97062-208
Normal Donkey Serum (NDS) Jackson Immuno 017-000-121
Coverslips VWR 48393081
Prolong Gold antifade reagent with DAPI Life Technologies P36935
Glass Slide Rack VWR 100492-942
Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) Wako 019-19741  Working concentration 1:200
Iba1 antibody (polyclonal, goat) LifeSpan Bioscience LS-B2645 Working concentration 1:200
rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) Abcam ab955 Working concentration 1:200
mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) Abcam ab53444 Working concentration 1:200
mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) Affymetrix 14-1071 Working concentration 1:100
Beta-Amyloid, 17 - 24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) Covance SIG-39220 Working concentration 1:200
Beta-Amyloid, 1 - 16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) Covance SIG-39320 Working concentration 1:200
OC antibody (polyclonal, rabbit) Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) Working concentration 1:200
Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody Invitrogen A-11001 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 488 rat secondary antibody Invitrogen A-11006 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody Invitrogen A-11037 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 goat secondary antibody Invitrogen A-11080 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody Invitrogen A-21235 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody Invitrogen A-21443 Working concentration 1:1,000
Immersion oil Nikon 
A1 Confocal microscope Nikon 
NIS Elements Advanced Research software Nikon 
Imaris:Bitplane software version 7.6 Bitplane "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets.

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Guillot-Sestier, M. V., Weitz, T. M., Town, T. Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (118), e54868, doi:10.3791/54868 (2016).More

Guillot-Sestier, M. V., Weitz, T. M., Town, T. Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (118), e54868, doi:10.3791/54868 (2016).

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