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Medicine

3D Quantitative doi: 10.3791/54868 Published: December 26, 2016

Summary

Abbiamo sviluppato una metodologia per il 3D quantitativa in silico di modellazione (q3DISM) di cerebrale amiloide-β (Ap) fagocitosi da parte dei fagociti mononucleari in modelli di roditori della malattia di Alzheimer. Questo metodo può essere generalizzato per la quantificazione di praticamente qualsiasi evento fagocitaria in vivo.

Abstract

Neuroinfiammazione è ormai riconosciuto come un importante fattore eziologico nella malattia neurodegenerativa. fagociti mononucleari sono cellule immunitarie innate responsabili della fagocitosi e la bonifica di detriti e detriti. Queste cellule sono macrofagi CNS residenti note come microglia, e fagociti mononucleari infiltrati dalla periferia. La microscopia ottica è stata generalmente utilizzati per la visualizzazione fagocitosi in roditori o campioni di cervello umano. Tuttavia, i metodi qualitativi non hanno fornito la prova definitiva di fagocitosi in vivo. Qui, descriviamo 3D quantitativa nella modellazione in silico (q3DISM), un metodo affidabile che permette una reale quantificazione 3D di amiloide-β (Ap) fagocitosi da parte dei fagociti mononucleari in modelli di roditori malattia di Alzheimer (AD). Il metodo consiste nel visualizzare fluorescente Ap incapsulato all'interno phagolysosomes nelle sezioni roditore cervello. Grandi serie di dati confocale z-dimensionale vengono poi ricostruite in 3D per la quantificazione di A &# 946; spazialmente colocalized all'interno del fagolisosoma. Dimostriamo l'applicazione di successo di q3DISM di topo e ratto cervello, ma questa metodologia può essere esteso a qualsiasi evento di fagocitosi in qualsiasi tessuto.

Introduction

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La malattia di Alzheimer (AD), la demenza legata all'età più comune 1, è caratterizzata da accumulo cerebrale amiloide-β (Ap) come placche "senili" beta-amiloide, neuroinfiammazione cronica di basso livello, tauopathy, perdita neuronale, e disturbi cognitivi 2 . In AD cervelli di pazienti, neuroinflammation è destinato dagli astrociti e fagociti mononucleari reattiva (indicato come microglia, anche se le loro centrali vs. origine periferica rimane poco chiaro) che circonda depositi Ap 3. Come le sentinelle del sistema immunitario innato del sistema nervoso centrale, microglia sono posizionati centralmente per cancellare il cervello Ap. Tuttavia, il reclutamento della microglia placche Ap è accompagnata da molto piccolo, all'occorrenza, Ap fagocitosi 4,5. Una ipotesi è che la microglia sono inizialmente neuroprotettivi da phagocytozing piccole assemblee di Ap. Tuttavia, alla fine queste cellule diventano neurotossico come opprimente fardello Ap e / o legate all'età d funzionaleecline, provoca microglia in un fenotipo proinfiammatoria disfunzionale, contribuendo alla neurotossicità e cognitivo declino 6.

Recenti studi genome-wide (GWAS Association) hanno identificato un gruppo di alleli di rischio AD appartenenti al nucleo innate percorsi immunitario 7 che modulano la fagocitosi 8-11. Di conseguenza, la risposta immunitaria alla deposizione di amiloide cerebrale è diventato un importante area di interesse, sia in termini di comprensione AD eziologia e per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici 12-14. Tuttavia, vi è la necessità vitale per metodologia per valutare fagocitosi Ap in vivo. Per rispondere a questa necessità insoddisfatte, abbiamo sviluppato 3D quantitativa in silico di modellazione (q3DISM) per consentire una vera quantificazione 3D cerebrale fagocitosi Ap dai fagociti mononucleari in modelli di roditori della malattia di Alzheimer-like.

Limitata solo dalla misura in cui esse ricapitolare malattia, modelli animali hannodimostrato prezioso per la comprensione AD pathoetiology e per la valutazione delle terapie sperimentali. A causa del fatto che le mutazioni nei geni presenilina (PS) e della proteina precursore dell'amiloide (APP) causano indipendentemente autosomica dominante dC, questi transgeni mutanti sono stati ampiamente utilizzati per generare modelli di roditori transgenici. Topi transgenici APP / PS1 coexpressing simultaneamente "svedese" mutante umano APP (APP SWE) e Δ esone 9 mutante presenilina umana 1 (PS1ΔE9) presente con accelerata amiloidosi cerebrale e neuroinfiammazione 15,16. Inoltre, abbiamo generato topi bi-transgenici coinjected con APP SWE e costrutti PS1ΔE9 (linea TgF344-AD, su uno sfondo di Fischer 344). A differenza dei modelli di topi transgenici di amiloidosi cerebrale, ratti TgF344-AD sviluppano amiloide cerebrale che precede tauopathy, perdita apoptotica di neuroni, e compromissione del comportamento 17.

In questo rapporto, si descrive un protocollo per immunostaining microglia, phagolysosomes e depositi Ap in sezioni del cervello di topi APP / PS1 e ratti TgF344-AD, e l'acquisizione di immagini di grandi dimensioni confocale z-dimensionale. Noi dettaglio nella generazione e l'analisi di veri ricostruzioni 3D di set di dati confocale che consentono la quantificazione di Ap assorbimento in phagolysosomes microgliali silico. Più in generale, la metodologia che we dettaglio qui può essere utilizzato per quantificare praticamente qualsiasi forma di fagocitosi in vivo.

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Protocol

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Dichiarazione di etica della ricerca: Tutti gli esperimenti che coinvolgono animali descritti nel presente documento sono stati approvati dalla University of Southern California Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso (IACUC) ed eseguito in stretta conformità con National Institutes of linee guida per la salute e le raccomandazioni della Associazione per la valutazione e l'accreditamento del laboratorio Animal Care International.

1. roditori Cervello Isolamento e preparazione per Immunocolorazione

GIORNO 1:

  1. Posizionare ratti TgF344-AD di età (14 mesi) o APP / PS1 topi (12 mesi) in continuo anestesia isoflurano profonda (4%). Valutare la profondità di anestesia pinch punta e l'assenza di recesso reflex.
  2. Tagliare i due lati della gabbia toracica e sollevare per esporre il cuore. Inserire un ago G 23 nel ventricolo sinistro del cuore e fare una piccola incisione nell'atrio destro. Procedere alla dissanguamento da perfusione transcardial con PBS ghiacciata(PBS) utilizzando una pompa peristaltica (30 mL per topi; 150 - 200 ml per i ratti).
  3. Effettuare una incisione mediana caudale nella pelle e spostare la pelle ei muscoli da parte. Tagliare attraverso la parte superiore del cranio lungo la linea mediana e tra gli occhi. Rimuovere le piastre ossee e isolare l'intero cervello dal cranio.
  4. Mettere il cervello in una matrice roditore cervello coronale e si taglia in quarti. Incubare quarti posteriori O / N (16 h) in paraformaldeide fissativo (4% PFA in PBS) a 4 ° C. Lavare 3x in PBS, e poi il trasferimento al 70% di etanolo. Attenzione: PFA è tossico e deve essere manipolato sotto una cappa chimica con opportuni dispositivi di protezione individuale.

GIORNO 2:

  1. Posizionare quarti cerebrali in cassette incorporamento e progressivamente disidratano tessuto in bagni di etanolo 1 h in successione più concentrate (70%, 80%, 95% e 100% x3).
  2. Cancella l'etanolo dal tessuto con tre bagni successivi xilene 100% (1 ora ciascuno). Attenzione: xilene è tossico e should essere trattati sotto una cappa chimica con opportuni dispositivi di protezione individuale.
  3. Incorpora tessuti in blocchi di paraffina dopo due bagni fusi paraffina (56-58 ° C, 90 min ciascuna).

3 ° GIORNO:

  1. Tagliare 10 sezioni micron di spessore di cervelli in paraffina utilizzando un microtomo. sezioni Dip in un bagno d'acqua (50 ° C per 1 min) e si applicano a vetrini da microscopio. Lasciare le diapositive asciugare O / N, garantendo l'adesione dei tessuti alla diapositiva.

2. immunocolorazione

Nota: differenti combinazioni di anticorpi possono essere utilizzati per la procedura di colorazione descritta di seguito. Cocktail di anticorpi compatibili con il tessuto cerebrale di ratti e topi sono elencati nella tabella 1.

4 ° GIORNO:

  1. Deparaffinare sezioni del cervello che utilizzano 2x 100% bagni xilene (12 min ciascuna).
  2. Reidratare sezioni di cervello in bagni etanolo successive - 100% per 10 min, 95% per 5 min, 80% per 10 min, ed infine 70% per 15 min - followed da lavaggi PBS 3x [5 minuti a temperatura ambiente, con l'agitazione luce]. Nel frattempo, il calore soluzione antigene di recupero di 95-97 ° C su una piastra calda con magnetica barra di agitazione.
  3. Incubare sezioni di cervello in soluzione recupero dell'antigene a 95 - 97 ° C per 30 min. Poi, lavare 3x in PBS (5 minuti a temperatura ambiente, con l'agitazione della luce).
  4. Rapidamente diapositive a secco che utilizzano delicati tergicristalli attività per evitare l'essiccamento dei tessuti, e disegnare una barriera idrofobica intorno alla zona di tessuto con una penna barriera idrofoba. Riempire la regione tessuto circondato con tampone di bloccaggio [PBS contenente 0,3% Triton X-100 e il 10% Normal Donkey Serum (NDS)], ed incubare a temperatura ambiente per 1 h in una camera umidificata.
  5. Sostituire tampone di bloccaggio con Iba1 anticorpo primario (diluito in tampone bloccante) per etichettare fagociti mononucleari, e incubare O / N a 4 ° C in una camera umidificata. Per gli host di anticorpi e diluizioni di lavoro, vedi Tabella 1 e la Tabella dei Materiali.

GIORNO 5:

  1. Sciacquareanticorpo primario con i bagni 3x PBS (5 minuti a temperatura ambiente con agitazione luce). Incubare con immunofluorescenza secondario (coniugato con un fluorocromo di emissione 594 nm) per 1 h (in tampone di bloccaggio a RT al buio) seguita da bagni 3x PBS (5 min a RT agitazione luce). In questo momento, mantenere sezioni al buio per evitare fluorescente sbiancamento segnale.

Giorno 6 - 7:

  1. Ripetere i punti 2.5 e 2.6 con CD68 (cervello dei topi) o LAMP1 (tessuto mouse) anticorpi e appropriati anticorpi secondari (accoppiato con un fluoroforo emissione di 488 nm) per etichettare phagolysosomes.

Giorno 7 - 8:

  1. Ripetere i punti 2.5 e 2.6 con OC (tessuto di ratto) o 4G8 (cervello di topo) anticorpi e appropriati anticorpi secondari (accoppiato ad un fluoroforo 647 nm) per etichettare depositi Ap.
    NOTA: In alternativa, 6E10 anticorpo può essere utilizzato con successo sia sul topo e ratto tessuti. Per opportune combinazioni di anticorpi, vedere la tabella dei materiali
  2. Lasciare sezioni completamente asciutta O / N a RT al buio. Poi, la copertura campioni con un vetrino sigillato da mezzi di montaggio fluorescenza contenenti DAPI.

3. Acquisizione di grande Z-stack confocale Dataset

Nota: Questo protocollo richiede una scansione laser confocale completamente automatizzato dotato di un obiettivo 60X e 405 nm, 488 nm, 594 nm e 647 nm laser. Tutto l'equipaggiamento è controllato da imaging e controllo laser software per computer. Prima di iniziare la procedura di imaging, accendere il computer, lampada epifluorescente, microscopio, laser e macchina fotografica.

9 ° giorno:

  1. Selezionare l'obiettivo microscopio 60X. Aggiungere l'olio di immersione alla lente, e posizionare il campione sul supporto del microscopio fase di diapositive. Sollevare l'obiettivo finché l'olio entra in contatto con la slitta. Regolare il piano focale per individuare placche amiloidi nell'ippocampo o corteccia cerebrale che utilizzano illuminazione epifluorescente attraverso gli oculari.
  2. Acquisire im confocaleetà compresa tra i fagociti mononucleari attivate circostanti depositi di amiloide nell'ippocampo o corteccia di roditori mediante microscopia confocale (ingrandimento 60X, passi z-stack: 0.25 micron <z <0.40 micron, il numero di passi 25 <n <35).

4. q3DISM

Nota: Al fine di produrre risultati significativi, si consiglia l'analisi di un minimo di 3 immagini per animale / regione di interesse. Per ogni immagine, l'abbondanza di cellule da analizzare può variare a seconda paradigmi sperimentali. Nei risultati rappresentativi riportati nella presente relazione, abbiamo analizzato 3 cellule / condizione (per esempio, fagociti mononucleari distanti da o associati a placche, vedi figure 1C - D e 2C - D).

GIORNO 10:

  1. Analizzare i set di dati confocale con colocalization elaborazione delle immagini 3D e analisi scientifiche software (coloc) modulo per la vicinanza spaziale di Iba1 / CD68 (tessuto di ratto) o Iba1 / LAMP1 (tessuto mouse) colorazione in tutte le z-aerei simultaneamente.Creare Iba + / CD68 + o canali Iba + / + LAMPADA1 colocalizzazione che corrispondono a phagolysosomes all'interno di fagociti mononucleari attivate.
    1. Selezionare TRITC per il canale A (corrispondente al Iba1 colorazione accoppiato con 594 nm fluoroforo) e FITC per il canale B (corrispondente al CD68 o colorazione LAMPADA1 accoppiato con 488 nm fluoroforo). Sul lato destro della finestra del software per il 'controllo modalità,' selezionare 'soglia' e per 'intensità coloc,' Select 'canali sorgente.
    2. Fare clic su 'Modifica' per selezionare 'colore coloc' sul lato destro della finestra del software.
    3. Per ogni canale in modo indipendente, regolare le soglie per includere colorazione specifica ed escludere sfondo / segnali non specifici. Una volta regolato, non modificare le soglie tra le immagini al fine di garantire un'analisi imparziale. I voxel colocalized (pixel da tutti gli z-stack) apparirà nel colore selezionato al punto 4.1.2 in tutte le z-stack SIMultaneously.
    4. Fare clic su 'costruire canale Coloc'. Il canale co-localizzazione creato apparirà nella finestra di regolazione del display.
    5. Fare clic sul canale coloc per aprire le statistiche del canale. Il '% del volume / materiale A di sopra della soglia colocalized' rappresenta la% di segnale Iba1 (voxel corrispondente al fluoroforo 594 nm) colocalizzava con LAMPADA1 o il segnale CD68 (voxel corrispondente al fluoroforo 488 nm). Più semplicemente, questo è il volume occupato da monociti phagolysosomes (vedi figure 1C e 2C).
      NOTA: '% del volume / materiale B di sopra della soglia colocalized' corrisponde ad% di LAMPADA1 o CD68 segnale colocalized con Iba1. Questo dovrebbe essere vicino al 100%, come phagolysosomes sono strutture intracellulari. I valori sono basati sul rapporto tra segnale da tutte z-stack sopra soglia colocalized.
  2. Utilizzando il modulo coloc, analizzare il canale coloc creato nel passo 4.1 per la vicinanza spaziale con OC (ti rattoSSUE) o 4G8 (tessuto mouse) segnali Ap. Ciò consente la quantificazione di Ap incapsulati all'interno phagolysosomes.
    1. Selezionare il canale A dataset coloc (corrispondente al Iba1 / CD68 o canale Iba1 / LAMP1 coloc creato nel passo 4.1) e Cy5 per il canale B (corrispondente a OC o 4G8 colorazione accoppiato con 647 nm fluoroforo).
    2. Costruire un canale coloc come descritto ai punti 4.1.2 a 4.1.5.
    3. Fare clic sul canale coloc per aprire le statistiche del canale. Il '% del volume / materiale A di sopra della soglia colocalized' rappresenta la% di Iba1 / LAMPADA1 o Iba1 / CD68 (voxel corrispondente al canale coloc costruito nel punto 4.1.5.) Colocalized con OC o il segnale 4G8 (voxel corrispondente al 647 nm fluoroforo). Questo è il volume occupato da fagolisosomale Ap (vedi figure 1D e 2D).
      NOTA: '% del volume / materiale B di sopra della soglia colocalized' corrisponde% del segnale Ap totale colocalized con phagolysosomes.Questo può essere utilizzato per valutare la frazione dei depositi totali Ap incapsulati all'interno phagolysosomes (non mostrato nelle presenti risultati rappresentativi).
  3. Utilizzare il modulo superare per ricostruire le pile di immagini confocale e generare modelli 3D di A? Incapsulati all'interno phagolysosomes monociti.
    1. Nella finestra 'di regolazione del display', selezionare TRITC (per mostrare colorazione solo Iba1). Nella finestra 'Proprietà volume', clicca su 'aggiungi nuova superficie'.
    2. Nel passo '1/5 algoritmo', in 'Impostazioni', selezionare 'superficiale.' Inoltre, in 'colore', selezionare il tipo di colore nella tavolozza o RGB e regolare la trasparenza (rosso è fissato al 60% di trasparenza nelle figure 1B e 2B). Casella 'di selezionare la regione di interesse'. Fare clic su Avanti.
    3. Nel passaggio '2/5 regione di interesse,' disegnare una finestra attorno alla cella di interesse regolando x, y, z coordinate (vedi caselle bianche in figure 1A 2A). Fare clic su Avanti.
    4. Nel passaggio '3/5 canale sorgente', selezionare il canale di origine TRITC. Selezionare la casella 'liscia', e impostare il livello di dettaglio superficie di 0,4 micron. Per 'soglia', selezionare l'intensità assoluta. Fare clic su Avanti.
    5. Nel passaggio '4/5 soglia,' regolare soglia in modo che il volume creato sovrappone perfettamente con il segnale del canale TRITC. Fare clic su Avanti.
    6. Nel passaggio '5/5 classificare superfici,' nella sezione 'filtro', selezionare gli oggetti in base alla loro dimensione per includere o escludere dai volumi da creare. Fare clic su Fine, eseguire tutte le fasi di creazione, e uscire dalla procedura guidata.
    7. Ripetere i punti da 4.3.1 a 4.3.6 per creare una superficie 3D per il canale FITC (LAMPADA1 + o CD68 + phagolysosomes).
    8. Ripetere i punti da 4.3.1 a 4.3.6 per creare una superficie 3D per il canale Cy5 (OC + o depositi 4G8 + Ap).

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Representative Results

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Utilizzando la metodologia più stadi per q3DISM dettagliato sopra, siamo in grado di quantificare l'assorbimento Ap in phagolysosomes monociti nel cervello di APP / PS1 topi (figura 1) e ratti TgF344-AD (Figura 2). Pertanto, la metodologia q3DISM ha permesso l'analisi dei fagociti mononucleari in modelli di topo e ratto di AD. È interessante notare che il volume occupato da CD68 + phagolysosomes è significativamente aumentata in fagociti mononucleari Iba1 + associati rispetto alla distanza dalle placche sia nei ratti TgF344-AD (Figura 2B, C) APP / PS1 topi (Figura 1B, C) e. Questi dati mostrano che fagociti mononucleari vicino placche sono pronti per la fagocitosi rispetto alle cellule situate lontano dalla placca. Al fine di illustrare la gamma di dati da macchie diversi conformeri Ap, abbiamo utilizzato vari anticorpi nel topo e nel tessuto di ratto (dettagliato in TaBLE 1 e discussione) - noi non stiamo cercando di confrontare direttamente i modelli topi e ratti di AD per quanto riguarda la A? fagocitosi. Ciò nonostante, è stato degno di nota che placca associato fagociti mononucleari erano aumentati Ap assorbimento nei topi APP / PS1 rispetto alle cellule distanti dal placche (Figura 1D). Ratti TgF344-AD avuto molto modesto assorbimento di fibrille Ap complessiva, e nessun cambiamento in Ap fibrille fagocitosi in funzione della distanza da placche (Figura 2D).

Tabella 1
Tabella 1: Immunocolorazione Mononuclear fagociti, phagolysosomes e Amiloide-β nel tessuto cerebrale di topi APP / PS1 o ratti TgF344-AD. Ratto o il topo specifici cocktail di anticorpi sono elencati con il loro rispettivo ospite in parentesi. I colori indicano il fluoroforo utilizzato per l'anticorpo secondario. Rosso: Alexa Fluor 594; verde: Alexa Fluor 488;magenta: Alexa Fluor 647.

Figura 1
Figura 1: Visualizzazione e quantificazione di amiloide-β fagocitosi in Brains APP / PS1 mouse. (A) immagini confocale di sezioni del cervello da un mouse / PS1 APP che mostrano Iba1 cellule + (rosso), LAMP1 + phagolysosomes (verde) e 4G8 + depositi di amiloide (magenta). Inserto 1 mette in evidenza una fagociti mononucleari distante dalla targa, mentre inserto 2 mostra una fagociti mononucleari associato alla targa. barra della scala indica 50 micron. Pannelli più piccoli sulla destra sono ingrandimenti di Iba1, LAMPADA1 e 4G8 segnali all'interno inserti 1 e ricostruzione 2. (B) 3D di Iba1, LAMPADA1 e segnali 4G8 per inserti 1 e 2. Barra di scala denota 3 micron. (C) Quantificazione del Iba1 + volume di fagociti mononucleati occupato da LAMP1 + phagolysosomes. ( + fagolisosomale volume occupato dal 4G8 + Ap. I valori sono basati sul rapporto del segnale (voxel) sopra la soglia che sono colocalizzava. I dati sono mostrati come media ± errore standard della media (n = 6 cellule) per fagociti mononucleari lontane dalle placche (1), o associata a placche (2). ** P <0.01 da test t. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Visualizzazione e quantificazione di amiloide-β fagocitosi nel cervello dei topi TgF344-AD. (A) immagini confocale di sezioni del cervello di un ratto TgF344-AD mostrano cellule Iba1 + (rosso), CD68 + phagolysosomes (verde), e OC + solubile fibrillare A & # 946; (magenta). Inserto 1 mette in evidenza una fagociti mononucleari distante dalla targa, mentre inserto 2 mostra una fagociti mononucleari associato alla targa. barra della scala indica 50 micron. Pannelli più piccoli sulla destra sono ingrandimenti di Iba1, CD68 e segnali OC all'interno di inserti 1 e 2. (B) ricostruzione 3D di Iba1, CD68 e segnali OC per inserti 1 e 2. Barra di scala denota 3 micron. (C) Quantificazione del Iba1 + volume di fagociti mononucleati occupato da CD68 + phagolysosomes. (D) La determinazione quantitativa di intracellulare CD68 + fagolisosomale volume occupato da OC + Ap. I valori sono basati sul rapporto del segnale (voxel) sopra la soglia che sono colocalizzava. I dati sono mostrati come media ± errore standard della media (n = 6 cellule) per fagociti mononucleari lontane dalle placche (1), o associata a placche (2). ** P <0.01 da test t.rge.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Il protocollo che descriviamo in questa relazione per una vera quantificazione 3D di Ap fagocitosi in vivo dai fagociti mononucleari si basa sulla etichettatura specifica dei compartimenti cellulari e subcellulari così come depositi di Ap. In particolare, usiamo Iba1 (ionizzata-calcio Binding Adaptor molecola 1), una proteina che è coinvolta nella arruffarsi membrana e fagocitosi delle cellule dopo l'attivazione 18, 19, a macchia fagociti mononucleari cerebrali. Mentre le cellule Iba1 + sono generalmente considerati come microglia del cervello residente, resta possibile che perifericamente infiltranti fagociti mononucleari comprendono un sottogruppo di cellule immunolabeled. Phagolysosomes intracellulari vengono rivelati con anticorpi riconoscere i membri della famiglia Lysosomal / glicoproteina di membrana endosomal-associato (LAMP): LAMPADA1 20 o CD68 21. Quest'ultimo è localizzato principalmente lisosomi e endosomi, con una frazione minore circolazione alla cella sla tua faccia. LAMPADA1 e CD68 anticorpi sono stati utilizzati con successo sia nel tessuto ratto e nel topo, e la decisione su quale usare dipende in primo luogo la miriade di altri anticorpi utilizzati per la co-colorazione (vedi Tabella 1). È importante tenere presente che vari anticorpi possono essere utilizzati per il rilevamento di Ap. Nel tessuto del mouse, 4G8 (riconoscendo residui di aminoacidi del mouse umani e 17 - 24 di Ap peptide 22, Figura 1) e 6E10 (riconoscimento di residui di aminoacidi umano 1-17 23, i dati non riportati) sono stati utilizzati con successo, permettendo la rilevazione e quantificazione di contenuti Ap in LAMPADA1 + o CD68 + phagolysosomes presenti in fagociti mononucleari Iba1 +. Utilizzando la nostra metodologia q3DISM, abbiamo osservato un aumento del carico Ap a + cellule Iba1 connessi con la riduzione globale di carico Ap nel cervello dei APPPS1 / IL-10 - / - mice 16, mentre altri hanno mostrato diminuito assorbimento Ap in Iba1 + < / sup> cellule accompagnati da carico e placca aumento del volume Ap nel cervello di Rag-5xfAD topi 24. Questi risultati suggeriscono che il fenomeno osservato è una "istantanea" attiva fagocitosi Ap, anche se il metodo non può essere usato per predire se il materiale fagocitato è efficacemente digerito ed eliminato.

Nel tessuto ratto, abbiamo rilevato depositi Ap utilizzando OC (riconoscendo solubili Ap 42 oligomeri / fibrille 25,26, Figura 2) o 6E10 17 (non mostrato). È interessante notare che, molto poco OC + fibrille erano presenti in phagolysosomes monociti nel cervello di ratto TgF344-AD. Questo fenomeno è stato riportato in precedenza in APP23 topi transgenici che utilizzano immunogold colorazione e la ricostruzione 3D 27. Nota: una varietà di anticorpi per il rilevamento di differenti specie / Ap conformeri sono disponibili e possono potenzialmente essere testato e impiegato a discrezione dell'utente.

nt "> nostra tecnica q3DISM è stata adottata da noi e altri per quantificare Ap fagocitosi nel contesto AD 16,24,28. Tuttavia, il metodo può essere adattato per valutare praticamente qualsiasi forma di fagocitosi. Esso può essere applicato anche ai tessuti diverso il cervello, e ad altre specie animali (uomo compreso). le procedure descritte in questo protocollo si basano su immunostaining di serie, rilevato con fluorescenza e ripreso con un microscopio confocale. in questo rapporto, abbiamo utilizzato il tessuto incluso in paraffina secondo le linee guida fornite dai produttori di anticorpi. Se lo si desidera, la presente protocollo potrebbe anche essere ottimizzato per tessuto fresco (incorporato in 2% agarosio in PBS). il protocollo può anche essere ottimizzato per rilevare fagocitosi di coaggregating proteine. Ciò è reso possibile dalla colorazione e acquisendo immagini composte da più di 4 colori fluorescenti 29. In questo caso, la creazione del primo canale colocalizzazione (monociti / fagolisosoma) sarà seguita dalla creazionedi un secondo canale colocalizzazione (aggregate proteina 1 / co-aggregati protein 2). Poi, i due canali sarebbero stati utilizzati per l'analisi e modellazione 3D.

La tecnica q3DISM è limitata principalmente dalla specificità e sensibilità di immunostaining, qualità di anticorpi, e l'approccio colocalizzazione. Questa procedura multistep ha alcuni potenziali insidie ​​che possono influenzare la qualità della colorazione e, quindi, quantificazione 3D di Ap assorbimento. Il primo passo fondamentale della procedura è l'isolamento di cervello di roditori. Infatti, la gestione attenta dei tessuti è fondamentale per evitare danni al cervello e per garantire che le strutture cerebrali rimangono intatti quando sezionato. In secondo luogo, tempo di fissazione dei tessuti è molto importante in quanto un eccesso di fissaggio (più di 16 ore in 4% PFA) limiti di rivelazione di phagolysosomes subcellulari e contenuti Ap. È importante sottolineare che la colorazione successiva di 1), 2) monociti phagolysosomes e 3) Ap è critico per il successo del metodo. E 'EssentIAL per utilizzare gli anticorpi non consecutively- concomitanza. Inoltre, l'acquisizione delle z-stack immagini confocali è di estrema importanza, poiché modellazione 3D di cellule, phagolysosomes e Ap peptide nonché colocalizzazione analisi dipende dalla qualità delle immagini di strutture cellulari e subcellulari attraverso lo spessore della sezione di tessuto. Infine, la regolazione delle soglie nel software è di fondamentale importanza per la modellazione 3D e per l'analisi colocalizzazione. Infatti, le soglie per i vari canali devono essere scelti con cura, poiché condizionano il quale segnale è incluso (specifico) o escludere (background) dall'analisi. È anche essenziale che le soglie prescelte restano coerenti tra i campioni nel caso del confronto di diversi animali / campioni. Finora, immunohistostaining classica, la risonanza magnetica e la tomografia ad emissione di positroni sono stati i metodi di imaging di scelta per la visualizzazione in vivo e la quantificazione di A?30. Anche se molto utile per la quantificazione su larga scala di carico di amiloide nel cervello di roditori o pazienti AD, questi metodi sono inefficienti per la visualizzazione di intracellulare Ap. Altre tecniche che utilizzano la microscopia confocale, spettroscopia di fluorescenza e citometria a flusso esistono e sono state utilizzate da noi e gli altri di discriminare e quantificare il contenuto Ap intracellulare in vitro 16,31,32. Colorazione immunogold accoppiato con ricostruzione 3D è stato precedentemente utilizzato per evidenziare l'assenza di fibrille amiloidi all'interno microglia in vivo in APP23 topi transgenici 27, e un altro studio ha utilizzato con successo confocale di imaging e 3D ricostruzione superficie della microglia-associata a placche beta-amiloide a mostrare Ap limitata interazione e assorbimento 33. Tuttavia, queste tecniche non consentono per la quantificazione degli scambi intra-specie fagolisosomale Ap. Altri hanno recentemente sviluppato un basato sulla fluorescenza in vivo test permette di misuraredi attività fagocitaria dai macrofagi periferici nel ratto 34. Questo metodo consente ingegnosamente per la quantificazione di bioprobes fluorescenti phagolysosomes in vivo, tuttavia, i dati finora disponibili sono limitate alla periferia.

A nostra conoscenza, q3DISM è il primo metodo che permette la visualizzazione 3D e la quantificazione di Ap fagocitosi nel cervello di modelli di roditori AD. Questo strumento formidabile senza dubbio aprire la strada ad una più profonda comprensione cerebrale fagocitosi Ap, e può rivelarsi utile anche in altri contesti.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott NDC 0044-5260-05
Dissecting scissors VWR 82027-582
Dissecting scissors Blunt tip VWR 82027-588
Tweezers VWR 94024-408
23 G needle VWR BD305145
peristaltic pump FH10 Thermo Scientific 72-310-010
PBS 10x Bioland Scientific PBS01-02 Phosphate-buffered Saline; Working concentration 1x
Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm  Kent Scientific RBMS-200C
Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm  Kent Scientific RBMS-305C 
32% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) EMS 15714-S Caution: Toxic. Working concentration: 4% in PBS
Ethanol VWR 89125-188 Various concentrations, see protocol
Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura VWR 25608-774
Embedding and Infiltration Paraffin VWR 15147-839
Microtome Leica RM2125 Leica Biosystems
Disposable Microtome Blades  VWR 25608-964
Water bath Leica HI 1210 Leica Biosystems
Micro slide Superfrost plus VWR 48311-703
Xylene Sigma-Aldrich 534056-4X4L Caution: Toxic 
Target Retrieval Solution 10x DAKO S1699 Working concentration 1x
KimWipes VWR 21905-026
Hydrophobic PAP pen VWR 95025-252
Triton X-100 VWR 97062-208
Normal Donkey Serum (NDS) Jackson Immuno 017-000-121
Coverslips VWR 48393081
Prolong Gold antifade reagent with DAPI Life Technologies P36935
Glass Slide Rack VWR 100492-942
Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) Wako 019-19741  Working concentration 1:200
Iba1 antibody (polyclonal, goat) LifeSpan Bioscience LS-B2645 Working concentration 1:200
rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) Abcam ab955 Working concentration 1:200
mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) Abcam ab53444 Working concentration 1:200
mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) Affymetrix 14-1071 Working concentration 1:100
Beta-Amyloid, 17 - 24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) Covance SIG-39220 Working concentration 1:200
Beta-Amyloid, 1 - 16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) Covance SIG-39320 Working concentration 1:200
OC antibody (polyclonal, rabbit) Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) Working concentration 1:200
Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody Invitrogen A-11001 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 488 rat secondary antibody Invitrogen A-11006 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody Invitrogen A-11037 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 goat secondary antibody Invitrogen A-11080 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody Invitrogen A-21235 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody Invitrogen A-21443 Working concentration 1:1,000
Immersion oil Nikon 
A1 Confocal microscope Nikon 
NIS Elements Advanced Research software Nikon 
Imaris:Bitplane software version 7.6 Bitplane "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets.

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References

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3D Quantitative<em&gt; In Silico</em&gt; Modeling (q3DISM) di cerebrale amiloide-beta fagocitosi in roditori modelli di malattia di Alzheimer
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Guillot-Sestier, M. V., Weitz, T. M., Town, T. Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (118), e54868, doi:10.3791/54868 (2016).More

Guillot-Sestier, M. V., Weitz, T. M., Town, T. Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (118), e54868, doi:10.3791/54868 (2016).

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