Abbiamo sviluppato una metodologia per il 3D quantitativa in silico di modellazione (q3DISM) di cerebrale amiloide-β (Ap) fagocitosi da parte dei fagociti mononucleari in modelli di roditori della malattia di Alzheimer. Questo metodo può essere generalizzato per la quantificazione di praticamente qualsiasi evento fagocitaria in vivo.
Neuroinfiammazione è ormai riconosciuto come un importante fattore eziologico nella malattia neurodegenerativa. fagociti mononucleari sono cellule immunitarie innate responsabili della fagocitosi e la bonifica di detriti e detriti. Queste cellule sono macrofagi CNS residenti note come microglia, e fagociti mononucleari infiltrati dalla periferia. La microscopia ottica è stata generalmente utilizzati per la visualizzazione fagocitosi in roditori o campioni di cervello umano. Tuttavia, i metodi qualitativi non hanno fornito la prova definitiva di fagocitosi in vivo. Qui, descriviamo 3D quantitativa nella modellazione in silico (q3DISM), un metodo affidabile che permette una reale quantificazione 3D di amiloide-β (Ap) fagocitosi da parte dei fagociti mononucleari in modelli di roditori malattia di Alzheimer (AD). Il metodo consiste nel visualizzare fluorescente Ap incapsulato all'interno phagolysosomes nelle sezioni roditore cervello. Grandi serie di dati confocale z-dimensionale vengono poi ricostruite in 3D per la quantificazione di A &# 946; spazialmente colocalized all'interno del fagolisosoma. Dimostriamo l'applicazione di successo di q3DISM di topo e ratto cervello, ma questa metodologia può essere esteso a qualsiasi evento di fagocitosi in qualsiasi tessuto.
La malattia di Alzheimer (AD), la demenza legata all'età più comune 1, è caratterizzata da accumulo cerebrale amiloide-β (Ap) come placche "senili" beta-amiloide, neuroinfiammazione cronica di basso livello, tauopathy, perdita neuronale, e disturbi cognitivi 2 . In AD cervelli di pazienti, neuroinflammation è destinato dagli astrociti e fagociti mononucleari reattiva (indicato come microglia, anche se le loro centrali vs. origine periferica rimane poco chiaro) che circonda depositi Ap 3. Come le sentinelle del sistema immunitario innato del sistema nervoso centrale, microglia sono posizionati centralmente per cancellare il cervello Ap. Tuttavia, il reclutamento della microglia placche Ap è accompagnata da molto piccolo, all'occorrenza, Ap fagocitosi 4,5. Una ipotesi è che la microglia sono inizialmente neuroprotettivi da phagocytozing piccole assemblee di Ap. Tuttavia, alla fine queste cellule diventano neurotossico come opprimente fardello Ap e / o legate all'età d funzionaleecline, provoca microglia in un fenotipo proinfiammatoria disfunzionale, contribuendo alla neurotossicità e cognitivo declino 6.
Recenti studi genome-wide (GWAS Association) hanno identificato un gruppo di alleli di rischio AD appartenenti al nucleo innate percorsi immunitario 7 che modulano la fagocitosi 8-11. Di conseguenza, la risposta immunitaria alla deposizione di amiloide cerebrale è diventato un importante area di interesse, sia in termini di comprensione AD eziologia e per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici 12-14. Tuttavia, vi è la necessità vitale per metodologia per valutare fagocitosi Ap in vivo. Per rispondere a questa necessità insoddisfatte, abbiamo sviluppato 3D quantitativa in silico di modellazione (q3DISM) per consentire una vera quantificazione 3D cerebrale fagocitosi Ap dai fagociti mononucleari in modelli di roditori della malattia di Alzheimer-like.
Limitata solo dalla misura in cui esse ricapitolare malattia, modelli animali hannodimostrato prezioso per la comprensione AD pathoetiology e per la valutazione delle terapie sperimentali. A causa del fatto che le mutazioni nei geni presenilina (PS) e della proteina precursore dell'amiloide (APP) causano indipendentemente autosomica dominante dC, questi transgeni mutanti sono stati ampiamente utilizzati per generare modelli di roditori transgenici. Topi transgenici APP / PS1 coexpressing simultaneamente "svedese" mutante umano APP (APP SWE) e Δ esone 9 mutante presenilina umana 1 (PS1ΔE9) presente con accelerata amiloidosi cerebrale e neuroinfiammazione 15,16. Inoltre, abbiamo generato topi bi-transgenici coinjected con APP SWE e costrutti PS1ΔE9 (linea TgF344-AD, su uno sfondo di Fischer 344). A differenza dei modelli di topi transgenici di amiloidosi cerebrale, ratti TgF344-AD sviluppano amiloide cerebrale che precede tauopathy, perdita apoptotica di neuroni, e compromissione del comportamento 17.
In questo rapporto, si descrive un protocollo per immunostaining microglia, phagolysosomes e depositi Ap in sezioni del cervello di topi APP / PS1 e ratti TgF344-AD, e l'acquisizione di immagini di grandi dimensioni confocale z-dimensionale. Noi dettaglio nella generazione e l'analisi di veri ricostruzioni 3D di set di dati confocale che consentono la quantificazione di Ap assorbimento in phagolysosomes microgliali silico. Più in generale, la metodologia che we dettaglio qui può essere utilizzato per quantificare praticamente qualsiasi forma di fagocitosi in vivo.
Il protocollo che descriviamo in questa relazione per una vera quantificazione 3D di Ap fagocitosi in vivo dai fagociti mononucleari si basa sulla etichettatura specifica dei compartimenti cellulari e subcellulari così come depositi di Ap. In particolare, usiamo Iba1 (ionizzata-calcio Binding Adaptor molecola 1), una proteina che è coinvolta nella arruffarsi membrana e fagocitosi delle cellule dopo l'attivazione 18, 19, a macchia fagociti mononucleari cerebrali. Mentre le …
The authors have nothing to disclose.
M-V.G-S. is supported by a BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease Research Fellowship Award (A2015309F) and an Alzheimer’s Association, California Southland Chapter Young Investigator Award. T.M.W. is supported by an ARCS Foundation and John Douglas French Alzheimer’s Foundation Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. This work was supported by the National Institute on Neurologic Disorders and Stroke (1R01NS076794-01, to T.T.), an Alzheimer’s Association Zenith Fellows Award (ZEN-10-174633, to T.T.), and an American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research (M11472, to T.T.). We are grateful for startup funds from the Zilkha Neurogenetic Institute, which helped to make this work possible.
Isoflurane | Abbott | NDC 0044-5260-05 | |
Dissecting scissors | VWR | 82027-582 | |
Dissecting scissors Blunt tip | VWR | 82027-588 | |
Tweezers | VWR | 94024-408 | |
23G needle | VWR | BD305145 | |
peristaltic pump FH10 | Thermo Scientific | 72-310-010 | |
PBS 10X | Bioland Scientific | PBS01-02 | Working concentration 1X |
Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm | Kent Scientific | RBMS-200C | |
Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm | Kent Scientific | RBMS-305C | |
32% Paraformaldehyde aqueous solution | EMS | 15714-S | Caution: Toxic. Working concentration 4% in PBS |
Ethanol | VWR | 89125-188 | Various concentrations, see protocol |
Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura | VWR | 25608-774 | |
Embedding and Infiltration Paraffin | VWR | 15147-839 | |
Microtome Leica RM2125 | Leica Biosystems | ||
Disposable Microtome Blades | VWR | 25608-964 | |
Water bath Leica HI 1210 | Leica Biosystems | ||
Micro slide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4X4L | Caution: Toxic |
Target Retrieval Solution 10X | DAKO | S1699 | Working concentration 1X |
KimWipes | VWR | 21905-026 | |
Hydrophobic PAP pen | VWR | 95025-252 | |
Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
Coverslips | VWR | 48393081 | |
Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
Glass Slide Rack | VWR | 100492-942 | |
Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) | Wako | 019-19741 | Working concentration 1:200 |
Iba1 antibody (polyclonal, goat) | LifeSpan Bioscience | LS-B2645 | Working concentration 1:200 |
rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) | Abcam | ab955 | Working concentration 1:200 |
mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) | Abcam | ab53444 | Working concentration 1:200 |
mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) | Affymetrix | 14-1071 | Working concentration 1:100 |
Beta-Amyloid, 17-24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39220 | Working concentration 1:200 |
Beta-Amyloid, 1-16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39320 | Working concentration 1:200 |
OC antibody (polyclonal, rabbit) | Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) | Working concentration 1:200 | |
Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11001 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 488 rat secondary antibody | Invitrogen | A-11006 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A-11080 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-21235 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-21443 | Working concentration 1:1000 |
Immersion oil | Nikon | ||
A1 Confocal microscope | Nikon | ||
NIS Elements Advanced Research software | Nikon | ||
Imaris:Bitplane software version 7.6 | Bitplane | "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets. | |