定量的3D<em>インシリコ</emアルツハイマー病の齧歯類モデルにおける脳アミロイドベータ食作用の>モデリング（q3DISM）
Summary
私たちは、アルツハイマー病のげっ歯類モデルにおいて単核食細胞によって脳アミロイドβ（Aβ）食作用のインシリコモデリング （q3DISM） で定量的な3Dのための方法論を開発しました。この方法は、 インビボで実質的に任意の食イベントの定量のために一般化することができます。
Abstract
神経炎症は現在、神経変性疾患の主要な病因因子として認識されています。単核食細胞は、破片や残骸の食作用およびクリアランスを担当する自然免疫細胞です。これらの細胞は、CNS常駐ミクログリアとして知られるマクロファージ、および周囲から浸潤性単核食細胞が含まれます。光学顕微鏡は、一般に、齧歯類またはヒトの脳標本で食作用を視覚化するために使用されています。しかし、定性的な方法は、in vivo食作用の決定的な証拠を提供していません。ここでは、 シリコモデリング（q3DISM）、げっ歯類アルツハイマー病（AD）モデルにおける単核食細胞によるアミロイドβ（Aβ）食作用の真の3D定量化を可能にする堅牢な方法で定量的な3Dを説明します。この方法は、蛍光齧歯類の脳切片におけるファゴリソソーム内にカプセル化Aβを可視化することを含みます。大型のz次元共焦点のデータセットは、その後、3Dは、A＆の定量のために再構築されます＃946;空間的にファゴリソソーム内で共局在。我々は、マウスおよびラットの脳にq3DISMの適用が成功を実証したが、この方法論は、任意の組織で事実上すべての貪食イベントに拡張することができます。
Introduction
アルツハイマー病（AD）、最も一般的な加齢に関連する認知症1は 、「老人」βアミロイド斑、慢性低レベルの神経炎症、タウオパチー、神経細胞の喪失、および認知障害2などの脳アミロイドβ（Aβ）の蓄積によって特徴付けられます。 （末梢起源対それらの中心は依然として不明であるものの、ミクログリアと呼ばれる）は、AD患者の脳では、神経炎症がAβ沈着物3を取り囲む反応性星状細胞および単核食細胞によって計上されています。 CNSの自然免疫番人として、ミクログリアは中心部の脳Aβをクリアするように配置されています。しかし、Aβプラークのミクログリアの募集は、もしあれば、非常に少ないのAβ貪食4,5を伴っています。 1つの仮説は、ミクログリアがAβの小さなアセンブリをphagocytozingことで、最初は神経保護的であるということです。しかし、最終的にこれらの細胞は圧倒的なAβ負荷および/または年齢関連機能dと神経毒性になりますecline、神経毒性および認知機能の低下6に貢献し、機能不全の前炎症性表現型へのミクログリアを引き起こします。
最近のゲノムワイド関連研究（GWAS）貪食8-11を調節コア先天性免疫経路7に属するADのリスク対立遺伝子のクラスターを同定しました。その結果、脳アミロイド沈着に対する免疫応答は、ADの病因を理解するという点で、および12月14日 、新しい治療法を開発するために、両方の、関心の主要なエリアとなっています。しかし、 生体内でのAβ食作用を評価するための方法論のための重要な必要性があります。この満たされていないニーズに対処するために、我々は、アルツハイマー様疾患のげっ歯類モデルにおいて単核食細胞によって脳のAβ食作用の真の3D定量を可能にするためにシリコモデリング（q3DISM） で定量的な3Dを開発しました。
それらは、動物モデルは、疾患を有する再現する程度によってのみ制限ADのpathoetiologyを理解するために、実験治療法を評価するための貴重な実証済み。プレセニリン（PS）及びアミロイド前駆体タンパク質（APP）遺伝子における変異は、独立して、常染色体優性ADを引き起こすという事実のため、これらの変異導入遺伝子は、広範ジェニック齧歯類モデルを生成するために使用されてきました。同時に「スウェーデン」変異ヒトAPP（APPのSWE）と加速脳アミロイドーシス及び神経炎症15,16を備えた本Δエクソン9変異ヒトプレセニリン1（PS1ΔE9）を共発現するトランスジェニックAPP / PS1マウス。さらに、我々は、（フィッシャー344背景にラインTgF344-AD）のAPP SWEとPS1ΔE9構築物で同時注入二重トランスジェニックラットを生成しました。脳アミロイドーシスのトランスジェニックマウスモデルとは異なり、TgF344-ADラットはタウオパチー、神経細胞のアポトーシス損失、および行動障害17の前脳アミロイドを開発します。
本稿では、IMMのためのプロトコルを記述しますミクログリア、APP / PS1マウスとTgF344-ADラットからの脳切片におけるファゴリソソームおよびAβ沈着物、および大のz次元共焦点画像の取得をunostaining。 シリコ世代とミクログリアのファゴリソソームにAβの取り込みの定量化を可能にする共焦点データセットから真の3D再構成の分析で私たちは、詳細。より広義には、ここでは詳細を、我々の方法は、 インビボでの食作用の実質的に任意の形状を定量化するために使用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、単核食細胞によりin vivoでのAβ食作用の真の3D定量化のために、この報告書に記載したプロトコルは、特定の細胞と細胞内区画の標識だけでなく、Aβ沈着に依存しています。具体的には、脳単核食細胞を染色するためにIBA1（イオン化カルシウムの結合アダプター分子1）、細胞の活性化18、19時に細胞膜の波打ち現象および食作用に関与するタンパク質を?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M-V.G-S. is supported by a BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease Research Fellowship Award (A2015309F) and an Alzheimer’s Association, California Southland Chapter Young Investigator Award. T.M.W. is supported by an ARCS Foundation and John Douglas French Alzheimer’s Foundation Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. This work was supported by the National Institute on Neurologic Disorders and Stroke (1R01NS076794-01, to T.T.), an Alzheimer’s Association Zenith Fellows Award (ZEN-10-174633, to T.T.), and an American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research (M11472, to T.T.). We are grateful for startup funds from the Zilkha Neurogenetic Institute, which helped to make this work possible.
Materials
| Isoflurane | Abbott | NDC 0044-5260-05 | |
| Dissecting scissors | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting scissors Blunt tip | VWR | 82027-588 | |
| Tweezers | VWR | 94024-408 | |
| 23G needle | VWR | BD305145 | |
| peristaltic pump FH10 | Thermo Scientific | 72-310-010 | |
| PBS 10X | Bioland Scientific | PBS01-02 | Working concentration 1X |
| Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm | Kent Scientific | RBMS-200C | |
| Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm | Kent Scientific | RBMS-305C | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | EMS | 15714-S | Caution: Toxic. Working concentration 4% in PBS |
| Ethanol | VWR | 89125-188 | Various concentrations, see protocol |
| Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura | VWR | 25608-774 | |
| Embedding and Infiltration Paraffin | VWR | 15147-839 | |
| Microtome Leica RM2125 | Leica Biosystems | ||
| Disposable Microtome Blades | VWR | 25608-964 | |
| Water bath Leica HI 1210 | Leica Biosystems | ||
| Micro slide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4X4L | Caution: Toxic |
| Target Retrieval Solution 10X | DAKO | S1699 | Working concentration 1X |
| KimWipes | VWR | 21905-026 | |
| Hydrophobic PAP pen | VWR | 95025-252 | |
| Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
| Coverslips | VWR | 48393081 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Glass Slide Rack | VWR | 100492-942 | |
| Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) | Wako | 019-19741 | Working concentration 1:200 |
| Iba1 antibody (polyclonal, goat) | LifeSpan Bioscience | LS-B2645 | Working concentration 1:200 |
| rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) | Abcam | ab955 | Working concentration 1:200 |
| mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) | Abcam | ab53444 | Working concentration 1:200 |
| mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) | Affymetrix | 14-1071 | Working concentration 1:100 |
| Beta-Amyloid, 17-24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39220 | Working concentration 1:200 |
| Beta-Amyloid, 1-16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39320 | Working concentration 1:200 |
| OC antibody (polyclonal, rabbit) | Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) | Working concentration 1:200 | |
| Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11001 | Working concentration 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 rat secondary antibody | Invitrogen | A-11006 | Working concentration 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Working concentration 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A-11080 | Working concentration 1:1000 |
| Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-21235 | Working concentration 1:1000 |
| Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-21443 | Working concentration 1:1000 |
| Immersion oil | Nikon | ||
| A1 Confocal microscope | Nikon | ||
| NIS Elements Advanced Research software | Nikon | ||
| Imaris:Bitplane software version 7.6 | Bitplane | "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets. | |
References
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