Summary

定量的3D<em>インシリコ</emアルツハイマー病の齧歯類モデルにおける脳アミロイドベータ食作用の>モデリング(q3DISM)

Published: December 26, 2016
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Summary

私たちは、アルツハイマー病のげっ歯類モデルにおいて単核食細胞によって脳アミロイドβ(Aβ)食作用のインシリコモデリング (q3DISM) 定量的な3Dのための方法論を開発しました。この方法は、 インビボで実質的に任意の食イベントの定量のために一般化することができます。

Abstract

神経炎症は現在、神経変性疾患の主要な病因因子として認識されています。単核食細胞は、破片や残骸の食作用およびクリアランスを担当する自然免疫細胞です。これらの細胞は、CNS常駐ミクログリアとして知られるマクロファージ、および周囲から浸潤性単核食細胞が含まれます。光学顕微鏡は、一般に、齧歯類またはヒトの脳標本で食作用を視覚化するために使用されています。しかし、定性的な方法は、in vivo食作用の決定的な証拠を提供していません。ここでは、 シリコモデリング(q3DISM)、げっ歯類アルツハイマー病(AD)モデルにおける単核食細胞によるアミロイドβ(Aβ)食作用の真の3D定量化を可能にする堅牢な方法定量的な3Dを説明します。この方法は、蛍光齧歯類の脳切片におけるファゴリソソーム内にカプセル化Aβを可視化することを含みます。大型のz次元共焦点のデータセットは、その後、3Dは、A&の定量のために再構築されます#946;空間的にファゴリソソーム内で共局在。我々は、マウスおよびラットの脳にq3DISMの適用が成功を実証したが、この方法論は、任意の組織で事実上すべての貪食イベントに拡張することができます。

Introduction

アルツハイマー病(AD)、最も一般的な加齢に関連する認知症1は 、「老人」βアミロイド斑、慢性低レベルの神経炎症、タウオパチー、神経細胞の喪失、および認知障害2などの脳アミロイドβ(Aβ)の蓄積によって特徴付けられます。 (末梢起源対それらの中心は依然として不明であるものの、ミクログリアと呼ばれる)は、AD患者の脳では、神経炎症がAβ沈着物3を取り囲む反応性星状細胞および単核食細胞によって計上されています。 CNSの自然免疫番人として、ミクログリアは中心部の脳Aβをクリアするように配置されています。しかし、Aβプラークのミクログリアの募集は、もしあれば、非常に少ないのAβ貪食4,5を伴っています。 1つの仮説は、ミクログリアがAβの小さなアセンブリをphagocytozingことで、最初は神経保護的であるということです。しかし、最終的にこれらの細胞は圧倒的なAβ負荷および/または年齢関連機能dと神経毒性になりますecline、神経毒性および認知機能の低下6に貢献し、機能不全の前炎症性表現型へのミクログリアを引き起こします。

最近のゲノムワイド関連研究(GWAS)貪食8-11を調節コア先天性免疫経路7に属するADのリスク対立遺伝子のクラスターを同定しました。その結果、脳アミロイド沈着に対する免疫応答は、ADの病因を理解するという点で、および12月14日 、新しい治療法を開発するために、両方の、関心の主要なエリアとなっています。しかし、 生体内でのAβ食作用を評価するための方法論のための重要な必要性があります。この満たされていないニーズに対処するために、我々は、アルツハイマー様疾患のげっ歯類モデルにおいて単核食細胞によって脳のAβ食作用の真の3D定量を可能にするためにシリコモデリング(q3DISM) 定量的な3Dを開発しました。

それらは、動物モデルは、疾患を有する再現する程度によってのみ制限ADのpathoetiologyを理解するために、実験治療法を評価するための貴重な実証済み。プレセニリン(PS)及びアミロイド前駆体タンパク質(APP)遺伝子における変異は、独立して、常染色体優性ADを引き起こすという事実のため、これらの変異導入遺伝子は、広範ジェニック齧歯類モデルを生成するために使用されてきました。同時に「スウェーデン」変異ヒトAPP(APPのSWE)と加速脳アミロイドーシス及び神経炎症15,16を備えた本Δエクソン9変異ヒトプレセニリン1(PS1ΔE9)を共発現するトランスジェニックAPP / PS1マウス。さらに、我々は、(フィッシャー344背景にラインTgF344-AD)のAPP SWEとPS1ΔE9構築物で同時注入二重トランスジェニックラットを生成しました。脳アミロイドーシスのトランスジェニックマウスモデルとは異なり、TgF344-ADラットはタウオパチー、神経細胞のアポトーシス損失、および行動障害17の前脳アミロイドを開発します。

本稿では、IMMのためのプロトコルを記述しますミクログリア、APP / PS1マウスとTgF344-ADラットからの脳切片におけるファゴリソソームおよびAβ沈着物、および大のz次元共焦点画像の取得をunostaining。 シリコ世代とミクログリアのファゴリソソームにAβの取り込みの定量化を可能にする共焦点データセットから真の3D再構成の分析私たちは、詳細。より広義には、ここでは詳細を、我々の方法は、 インビボでの食作用の実質的に任意の形状を定量化するために使用することができます。

Protocol

研究倫理の声明:本明細書に詳述動物に関わる全ての実験は、南カリフォルニア制度動物実験委員会(IACUC)の大学によって承認され、研究室の評価および認定協会からの国民健康ガイドラインの研究所や勧告に厳密に従って行きましたアニマルケア国際。 1.齧歯類の脳の単離と免疫染色のための準備 1日目: 連続深いイソフルラン麻酔(4%)の下で(12ヶ月?…

Representative Results

上記で詳述しq3DISMのための多段階方法論を使用して、我々はAPP / PS1マウス( 図1)とTgF344-ADラットの脳における単球のファゴリソソーム( 図2)にAβの取り込みを定量化することができます。したがって、q3DISMの方法論は、ADのマウスおよびラットモデルにおける単核食細胞の解析を可能にしました。興味深いことに、CD68 +ファゴリソ?…

Discussion

我々は、単核食細胞によりin vivoでのAβ食作用の真の3D定量化のために、この報告書に記載したプロトコルは、特定の細胞と細胞内区画の標識だけでなく、Aβ沈着に依存しています。具体的には、脳単核食細胞を染色するためにIBA1(イオン化カルシウムの結合アダプター分子1)、細胞の活性化18、19時に細胞膜の波打ち現象および食作用に関与するタンパク質を?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M-V.G-S. is supported by a BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease Research Fellowship Award (A2015309F) and an Alzheimer’s Association, California Southland Chapter Young Investigator Award. T.M.W. is supported by an ARCS Foundation and John Douglas French Alzheimer’s Foundation Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. This work was supported by the National Institute on Neurologic Disorders and Stroke (1R01NS076794-01, to T.T.), an Alzheimer’s Association Zenith Fellows Award (ZEN-10-174633, to T.T.), and an American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research (M11472, to T.T.). We are grateful for startup funds from the Zilkha Neurogenetic Institute, which helped to make this work possible.  

Materials

Isoflurane Abbott NDC 0044-5260-05
Dissecting scissors VWR 82027-582
Dissecting scissors Blunt tip VWR 82027-588
Tweezers VWR 94024-408
23G needle VWR BD305145
peristaltic pump FH10 Thermo Scientific 72-310-010
PBS 10X Bioland Scientific PBS01-02 Working concentration 1X
Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm  Kent Scientific RBMS-200C
Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm  Kent Scientific RBMS-305C 
32% Paraformaldehyde aqueous solution EMS 15714-S Caution: Toxic. Working concentration 4% in PBS
Ethanol VWR 89125-188 Various concentrations, see protocol
Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura VWR 25608-774
Embedding and Infiltration Paraffin VWR 15147-839
Microtome Leica RM2125 Leica Biosystems
Disposable Microtome Blades  VWR 25608-964
Water bath Leica HI 1210 Leica Biosystems
Micro slide Superfrost plus VWR 48311-703
Xylene Sigma-Aldrich 534056-4X4L Caution: Toxic 
Target Retrieval Solution 10X DAKO S1699 Working concentration 1X
KimWipes VWR 21905-026
Hydrophobic PAP pen VWR 95025-252
Triton X-100 VWR 97062-208
Normal Donkey Serum Jackson Immuno 017-000-121
Coverslips VWR 48393081
Prolong Gold antifade reagent with DAPI Life Technologies P36935
Glass Slide Rack VWR 100492-942
Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) Wako 019-19741  Working concentration 1:200
Iba1 antibody (polyclonal, goat) LifeSpan Bioscience LS-B2645 Working concentration 1:200
rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) Abcam ab955 Working concentration 1:200
mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) Abcam ab53444 Working concentration 1:200
mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) Affymetrix 14-1071 Working concentration 1:100
Beta-Amyloid, 17-24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) Covance SIG-39220 Working concentration 1:200
Beta-Amyloid, 1-16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) Covance SIG-39320 Working concentration 1:200
OC antibody (polyclonal, rabbit) Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) Working concentration 1:200
Alexa Fluor 488  mouse secondary antibody Invitrogen A-11001 Working concentration 1:1000
Alexa Fluor 488  rat secondary antibody Invitrogen A-11006 Working concentration 1:1000
Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody Invitrogen A-11037 Working concentration 1:1000
Alexa Fluor 594 goat secondary antibody Invitrogen A-11080 Working concentration 1:1000
Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody Invitrogen A-21235 Working concentration 1:1000
Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody Invitrogen A-21443 Working concentration 1:1000
Immersion oil Nikon 
A1 Confocal microscope Nikon 
NIS Elements Advanced Research software Nikon 
Imaris:Bitplane software version 7.6 Bitplane "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets.

References

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Cite This Article
Guillot-Sestier, M., Weitz, T. M., Town, T. Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer’s Disease. J. Vis. Exp. (118), e54868, doi:10.3791/54868 (2016).

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