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Medicine

양적 3D doi: 10.3791/54868 Published: December 26, 2016

Summary

우리는 알츠하이머 병의 쥐 모델에서 단핵 식세포에 의해 대뇌 아밀로이드 β (Aβ) 식균 작용의 실리코 모델링 (q3DISM)의 양적 3D에 대한 방법론을 개발했다. 이 방법은 생체 내에서 거의 모든 식세포 이벤트의 정량화를 위해 일반화 될 수있다.

Abstract

신경 염증은 이제 신경 퇴행성 질환의 주요 병인 요소로 인식되고 있습니다. 단핵 식세포는 식균 작용 및 파편과 이물질의 통관에 대한 책임 선천성 면역 세포이다. 이 세포들은 주변에서 침투 미세 아교 세포로 알려진 CNS 상주 식세포 및 단핵 식세포를 포함한다. 광학 현미경은 일반적으로 쥐 또는 인간의 두뇌 표본 식세포를 시각화하는데 사용되었다. 그러나 질적 방법은 생체 내 식균 작용의 결정적인 증거를 제공하지 않았습니다. 여기, 우리는 실리 모델링 (q3DISM), 설치류 알츠하이머 병 (AD) 모델에서 단핵 식세포에 의해 아밀로이드 β (Aβ) 식균 작용의 진정한 3D 정량을 가능하게하는 강력한 방법 양적 차원을 설명합니다. 이 방법은 형광 Aβ는 쥐의 뇌 섹션 phagolysosomes 내에서 캡슐화 시각화하는 것을 포함한다. 대형 Z 차원 공 촛점 데이터 세트는 3D는 A & 정량을 위해 재구성# 946; 공간적으로 phagolysosome 내에서 colocalized. 우리는 마우스 및 래트의 뇌에 q3DISM의 성공적인 적용을 설명하지만,이 방법은 모든 조직에서의 거의 모든 식세포 이벤트에 확장 될 수있다.

Introduction

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알츠하이머 병 (AD), 가장 일반적으로 노인성 치매 1 "치매"β 아밀로이드 플라크 만성 낮은 수준의 신경 염증, 타우 병증, 신경 세포의 상실,인지 장애이 대뇌 아밀로이드 β (Aβ)의 축적을 특징으로 . AD 환자의 뇌에서 신경 염증이 성상 세포와 단핵 식세포 반응에 의해 책정되어 주변 Aβ 예금 3 (자신의 주변 기원은 불분명 대 중앙 있지만, 미세 아교 세포로 함). 중추 신경계의 선천성 면역 파수꾼으로, 미세 아교 세포는 중앙 뇌 Aβ을 취소 위치한다. 그러나, Aβ 플라크에 소교 모집이있는 경우, 약간의 Aβ의 식세포 작용 4,5 동반한다. 하나의 가설은 미세 아교 세포가 Aβ의 작은 어셈블리를 phagocytozing에 의해 초기에 신경 있다는 것입니다. 그러나 결국 이러한 세포는 압도적 인 Aβ 부담 및 / 또는 연령 관련 기능 D와 같은 신경 독성이 될ecline, 신경 독성과인지 기능 저하 (6)에 기여, 기능 장애 염증성 표현형에 미세 아교 세포를 불러 일으킨다.

최근 게놈 넓은 협회 연구 (GWAS)는 식균 작용 8-11을 조절하는 핵심 선천성 면역 경로 (7)에 속하는 AD 위험 대립 유전자의 클러스터를 확인했다. 따라서, 대뇌 아밀로이드 침착에 대한 면역 반응은 AD의 원인을 이해의 관점에서 새로운 치료 방법 개발 12-14 모두에 관심있는 주요 영역이되었다. 그러나, 생체 내에서 Aβ 식균 작용을 평가하는 방법에 대한 중요한 필요가있다. 이 충족되지 않은 요구를 충족하기 위해, 우리는 알츠하이머와 같은 질병의 쥐 모델에서 단핵 식세포에 의해 대뇌 Aβ의 식세포 작용의 진정한 3D 정량을 가능하게 실리 모델링 (q3DISM)의 양적 차원을 개발했다.

그들은 동물 모델 질병을 요점을 되풀이하는 정도에 의해서만 제한AD의 pathoetiology을 이해하고 실험적인 치료법을 평가하는 귀중한 입증. 프레 (PS) 및 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 유전자의 돌연변이는 상 염색체 우성 독립적 AD의 원인이된다는 사실로 인해, 이러한 돌연변이 유전자는 광범위하게 형질 전환 설치류 모델을 생성하는 데 사용되어왔다. 형질 전환 APP / PS1 마우스는 동시에 "스웨덴어"돌연변이 인간 APP (APP의 SWE) 및 가속 뇌 아밀로이드증과 신경 염증 (15, 16)에 존재 Δ 엑손 9 돌연변이 인간의 프레 1 (PS1ΔE9)를 coexpressing. 또한, 우리는 (피셔 (344) 배경에 라인 TgF344-AD) APP의 SWE와 PS1ΔE9 구조와 coinjected 이중 형질 전환 쥐를 생성했습니다. 뇌 아밀로이드증의 형질 전환 마우스 모델과 달리, TgF344-AD 쥐 타우 병증, 신경 세포의 사멸 손실 및 행동 장애 (17) 앞에 대뇌 아밀로이드을 개발한다.

이 보고서에서 우리는 IMM위한 프로토콜을 설명APP / PS1 마우스 및 TgF344-AD 쥐, 큰 Z 차원 공 촛점 이미지의 취득에서 뇌 부분에서 미세 아교 세포, phagolysosomes 및 Aβ 예금을 unostaining. 실리 생성 및 소교 phagolysosomes에 Aβ 흡수의 정량을 허용 공 초점 데이터 세트에서 진정한 3D 복원의 분석에서 우리는 세부 사항. 더 광범위하게, 여기에 자세히 우리 방법론은 생체 내에서 식균 사실상 어떠한 형태를 정량화하는데 사용될 수있다.

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Protocol

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연구 윤리의 진술 : 여기에 설명 된 동물을 포함한 모든 실험은 남부 캘리포니아 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 대학에 의해 승인 및 연구소의 평가 및 인증을위한 협회 국민 건강 지침의 연구소 및 권장 사항을 엄격히 준수 수행 하였다 동물 관리 국제.

1. 쥐의 뇌 분리 및 면역 염색을위한 준비

DAY 1 :

  1. 세 TgF344-AD 쥐를 놓습니다 (14 개월) 또는 연속 깊은 이소 플루 란 마취 (4 %)에서 APP / PS1 마우스 (12 개월). 발가락 핀치에 의해 마취의 깊이와 철수 반사의 부재를 평가합니다.
  2. 흉곽의 양쪽을 잘라 마음을 노출 올립니다. 심장의 좌심실로 23 G 바늘을 삽입하고 우심방에 작은 절개를합니다. 얼음처럼 차가운 인산 완충 식염수로 transcardial 관류하여 방혈로 진행연동 펌프 (마우스 30 mL를 150 - 쥐에 대한 200 ㎖)을 사용하여 (PBS).
  3. 피부로 꼬리 정중선 절개를 확인하고 옆으로 피부와 근육을 이동합니다. 정중선을 따라 두개골 상부를 통해 상기 눈 사이 잘라. 뼈 플레이트를 제거하고 두개골에서 뇌 전체를 격리.
  4. 코로나 쥐 뇌 매트릭스로 뇌를 놓고는 분기에 슬라이스. 4 ℃에서 파라 포름 알데히드 정착액 (PBS에서 4 % PFA)의 후방 분기 O / N (16 시간)을 품어. PBS에 세척 배 한 다음 70 % 에탄올로 전송할 수 있습니다. 주의 : PFA는 독성 및 적절한 개인 보호 장비와 화학 후드에서 처리되어야합니다.

DAY 2 :

  1. 연속적으로 더 집중을 1 시간 에탄올 화장실에서 (70 %, 80 %, 95 %, 100 %의 X3를) 조직을 탈수 점진적으로 삽입 카세트에 뇌 분기를 놓고.
  2. 3 개의 연속 100 % 크실렌 화장실 (1 시간마다)을 가진 조직에서 삭제 에탄올. 주의 : 크실렌은 독성 쉬입니다적절한 개인 보호 장비와 화학 후드 처리 할 울드.
  3. (- 58 ° C, 90 분 각 56)이 용융 된 파라핀 왁스 목욕 후 파라핀 블록 조직을 포함.

DAY 3 :

  1. 마이크로톰을 이용하여 파라핀 포함 된 두뇌의 10 μm의 두께 부분을 잘라. 수조 (1 분 50 ° C) 및에 딥 섹션은 슬라이드를 현미경에 적용됩니다. 슬라이드에 조직 유착을 보장, O / N을 건조 슬라이드를 둡니다.

2. 면역 염색

주 : 항체의 상이한 조합은 이하의 염색 과정에 이용 될 수있다. 쥐에서 뇌 조직과 호환 항체 칵테일은 표 1에 나열되어 있습니다.

DAY 4 :

  1. 배 100 % 크실렌 화장실을 사용 Deparaffinize 뇌 섹션 (12 분 각각).
  2. 연속 에탄올 욕 뇌 부분을 재수 - 100 % 10 분, 5 분 95 % 10 분 80 % 15 분 동안 마지막 70 % - followe배 PBS 세척 [빛 교반하면서 실온에서 5 분]에 의해 라. 한편, 95 열 항원 검색 솔루션 - 자기 바 교반 핫 플레이트에 97 ° C.
  3. 30 분 동안 97 °의 C - 95에서 항원 검색 솔루션의 뇌 부분을 품어. 그런 다음, PBS의 배 세척 (빛 교반 RT에서 5 분).
  4. 조직의 건조를 방지하고, 소수성 장벽 펜 조직 주변 소수성 장벽을 그리는 섬세한 작업이 와이퍼를 이용하여 신속하게 건조 슬라이드. 그리고 가습 챔버 내에서 1 시간 동안 RT에서 배양한다 [PBS 0.3 % 트리톤 X-100 및 10 % 정상 당나귀 혈청 (NDS)를 함유하는 완충액으로 차단 둘러싸인 조직 영역을 채운다.
  5. 가습 챔버에서 4 ° C에서 O / N을 단핵 식세포 라벨 및 부화하기 (차단 버퍼에 희석) Iba1 차 항체와 버퍼를 차단 교체합니다. 항체 호스트와 작업 희석은 표 1재료의 표를 참조하십시오.

DAY 5 :

  1. 헹구기배 PBS 욕조와 차 항체 (빛 교반 RT에서 5 분). 배 PBS 화장실 다음에 (어둠 속에서 실온에서 버퍼를 차단에서) 1 시간 동안의 (a 594 nm의 방출 형광 물질과 결합) 형광 차 항체 (빛 교반 RT에서 5 분)에 품어. 이 때, 형광 신호 표백을 피하기 위해 어둠 속에서 섹션을 유지한다.

DAY 6-7 :

  1. 반복 2.5 CD68 2.6 (쥐의 뇌) 또는 phagolysosomes 라벨을 램프 1 (마우스 조직) 항체 및 적절한 보조 항체 (488 nm의 방출 형광과 함께) 단계를 반복합니다.

DAY 7-8 :

  1. 반복 Aβ 예금에 레이블 (A 647 나노 형광 결합) OC (쥐의 조직) 또는 4G8 (마우스 뇌) 항체 및 적절한 보조 항체 2.5 및 2.6 단계를 반복합니다.
    참고 : 또는 6E10 항체는 마우스와 쥐 조직에 성공적으로 모두 사용할 수 있습니다. 적절한 항체 조합, 재료의 표를 참조하십시오
  2. 허용 섹션에 완전히 건조 O / 어둠 속에서 실온에서 N. 그런 다음, 커버 DAPI를 포함하는 형광 설치 미디어에 의해 밀봉 된 커버 슬립으로 표본.

대형 Z-스택 공 촛점 데이터 세트 3. 취득

참고 :이 프로토콜은 60X 목적 및 405 nm의, 488 nm의, 594 nm의 및 647 nm의 레이저가 장착 된 완전 자동화 된 레이저 스캐닝 공 초점 현미경이 필요합니다. 모든 장치는 영상화 레이저 제어 소프트웨어에 의해 제어되는 시스템이다. 컴퓨터, epifluorescent 램프, 현미경, 레이저와 카메라의 영상 프로토콜, 전원을 시작하기 전에.

DAY 9 :

  1. 60X 현미경 목표를 선택합니다. 렌즈에 침지 기름을 추가하고 현미경 단계 슬라이드 홀더 상에 샘플을 배치합니다. 오일이 슬라이드에 닿을 때까지 목표를 올립니다. 접안을 통해 epifluorescent 조명을 사용하여 해마 또는 대뇌 피질의 아밀로이드 플라크를 찾는 데 초점면을 조정합니다.
  2. 공 초점 메신저 획득해마 또는 공 초점 현미경에 의한 설치류의 피질에서 아밀로이드 침착을 둘러싼 활성화 단핵 식세포의 나이 (60X 배율, Z-스택 단계 : 0.25 μm의 <Z <0.40 μm의 단계의 수 (25) <N <35).

4. q3DISM

참고 : 의미있는 결과를 산출하기 위해, 우리는 관심의 동물 / 지역 당 3 이미지의 최소를 분석하는 것이 좋습니다. 각 이미지의 경우, 분석 할 수있는 세포의 풍부한 실험 패러다임에 따라 다를 수 있습니다. (- D2C - D도 1C를 참조 예로부터 멀리 또는 플라크와 관련된 단핵 식세포)가이 보고서에 나타난 대표적인 결과에서, 우리는 3 셀 / 상태를 분석 하였다.

DAY 10 :

  1. 과학적인 3D 이미지 처리 및 분석 소프트웨어 colocalization을 (coloc) 동시에 모든 Z-면에서 Iba1 / CD68 (쥐의 조직) 또는 Iba1 / 램프 1 (마우스 조직) 염색의 공간적 근접성을위한 모듈과 공 촛점 데이터 세트를 분석합니다.이바 + / CD68 + 또는 활성화 된 단핵 식세포 내에서 phagolysosomes에 해당 이바 + / 램프 1 + colocalization을 채널을 만듭니다.
    1. (CD68에 해당하는 또는 488 나노 형광과 함께 램프 1 염색) 채널 B에 대한 (594 나노 형광체와 결합 Iba1 염색에 해당) 채널 A의 TRITC 및 FITC를 선택합니다. '모드 체크,'선택 '임계 값'과 'coloc 강도,'선택 '소스 채널'에 대한 소프트웨어 창의 오른쪽에.
    2. 소프트웨어 윈도우의 오른쪽에있는 'coloc 색상을'선택 '수정'을 클릭합니다.
    3. 독립적으로 각 채널에 대해, 특정 염색을 포함하고 배경 / 비 특정 신호를 제외 할 임계 값을 조정합니다. 조정되면, 편견 분석을 위해 이미지 사이의 임계 값을 변경하지 마십시오. colocalized 복셀 (모든 Z-스택의 픽셀)는 모든 Z-스택 SIM의 단계 4.1.2에서 선택한 색상으로 표시됩니다ultaneously.
    4. 'coloc 채널을 구축'을 클릭합니다. 생성 된 colocalization을 채널은 화면 조정 창에 나타납니다.
    5. 채널 통계를 엽니 다 coloc 채널을 클릭합니다. 'colocalized 임계 값 이상의 볼륨 / 재료 A의 %는'램프 1 또는 CD68 신호 (488 나노 형광체에 해당하는 복셀)와 colocalized Iba1 신호합니다 (594 나노 형광체에 해당하는 복셀)의 %를 나타냅니다. 더 간단하게, 이것은 phagolysosomes (도 1C 및도 2C 참조)에 의해 점유 된 단핵구 볼륨이다.
      참고 : 'colocalized 임계 값 이상의 볼륨 / 소재 B의 %는'Iba1와 colocalized 램프 1 또는 CD68 신호 %에 해당한다. phagolysosomes은 세포 내 구조이기 때문에이 100 %에 가까워 야합니다. 값은 colocalized 임계 값 위의 모든 Z-스택에서 신호의 비율을 기준으로합니다.
  2. coloc 모듈을 사용하면, OC (래트 TI와 공간적 근접성 단계 4.1에서 생성 coloc 채널 분석ssue) 또는 4G8 (마우스 조직) Aβ 신호. 이 phagolysosomes 내에서 캡슐화 Aβ의 정량이 가능합니다.
    1. 채널을 (OC 또는 647 나노 형광체와 결합 4G8 염색에 해당) 채널 B 및 Cy5에합니다 (Iba1 / CD68 또는 Iba1 / 램프 1의 coloc 채널 단계 4.1에서 만든에 상당) coloc 데이터 세트를 선택합니다.
    2. 4.1.5 단계 4.1.2에 설명 된대로 coloc 채널을 구축 할 수 있습니다.
    3. 채널 통계를 엽니 다 coloc 채널을 클릭합니다. 'colocalized 임계 값 이상의 볼륨 / 재료 A의 %는'Iba1 / 램프 1 또는 Iba1 / CD68 (복셀 단계 4.1.5에 내장 된 coloc 채널에 대응.) OC 또는 4G8 신호 (복셀은 647에 대응 colocalized의 %를 차지 나노 형광). 이는 Aβ (도 1D2D 참조)에 의해 점유 된 포식 용해 소체 볼륨이다.
      참고 : 'colocalized 임계 값 이상의 볼륨 / 소재 B의 %는'phagolysosomes와 colocalized 총 Aβ 신호 %에 해당한다.이것은 phagolysosomes (본 대표적인 결과 미도시) 내에 캡슐화 총 Aβ 침착의 비율을 평가하는 데 사용될 수있다.
  3. 공 촛점 이미지 스택을 재구성 및 단핵구 phagolysosomes 내에서 캡슐화 Aβ의 3D 모델을 생성하기 위해 능가 모듈을 사용합니다.
    1. '게재 조정'창에서 (만 Iba1 염색을 표시하기 위해) TRITC을 선택합니다. '볼륨 등록 정보'창에서 '새로운면을 추가'를 클릭합니다.
    2. 에서 '1/5 알고리즘'단계에서 '설정', '면'을 선택합니다. 또한,의 '색'(적색도 (1B)와 (b)에 60 %의 투명도로 설정) 팔레트 또는 RGB 컬러 유형을 선택하고 투명도를 조정합니다. 확인란을 선택 '관심 지역을 선택'. 다음을 클릭합니다.
    3. 단계에서 '관심의 2/5 지역,'x는, y를 조절하여 관심의 세포 주위에 창을 그릴 및 z 좌표는 (도 1a에 흰색 상자를 참조하십시오 2A). 다음을 클릭합니다.
    4. 단계 '3/5 소스 채널'에서 TRITC 소스 채널을 선택합니다. 0.4 μm의 상자 '부드러운'및 설정 표면적 상세 수준을 확인합니다. 내용은 '임계'절대 강도를 선택합니다. 다음을 클릭합니다.
    5. 생성 된 볼륨이 TRITC 채널 신호와 완벽하게 겹치도록 단계에서 '4/5 임계 값,'임계 값을 조정합니다. 다음을 클릭합니다.
    6. 단계에서 '5/5는 표면을 분류,'섹션에서 '필터 유형'에 포함 또는 생성 할 볼륨에서 제외 할 자신의 크기에 따라 개체를 선택합니다. 마침을 클릭합니다 모든 창조의 단계를 실행하고 마법사를 종료합니다.
    7. 반복 FITC 채널 (램프 1 + 또는 CD68 + phagolysosomes)에 대한 3D 표면을 만들 4.3.1 4.3.6 단계를.
    8. 반복 Cy5에 채널에 대한 (OC + 또는 4G8 + Aβ 예금) 3 차원 표면을 만들 4.3.1 4.3.6 단계를.

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Representative Results

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q3DISM 위에서 상세히위한 다단계 방법을 사용하여, 우리는 APP / PS1 마우스 (도 1) 및 TgF344-AD 래트 (도 2)의 뇌에서 단핵 phagolysosomes으로 Aβ 흡수를 정량화 할 수있다. 따라서, q3DISM 방법론은 AD의 마우스 및 쥐 모델에서 단핵 식세포의 분석을 사용할 수있다. 흥미롭게도, CD68 + phagolysosomes가 차지하는 체적은 크게 두 APP / PS1 마우스 (도 1b, C) 및 TgF344-AD 래트 (도 2B, C)의 플라크로부터 떨어진 비교와 연관된 Iba1 + 단핵 식세포에서 증가된다. 이러한 데이터는 플라크 근처 단핵 식세포가 떨어져 플라크에서있는 세포에 비해 식균 작용을위한 태세 것으로 나타났다. 다른 Aβ 이형태 염색 데이터의 범위를 예시하기 위해, 우리는 마우스 및 래트 조직 각종 항체를 사용하는 탄탈 (Ta에 상세히1 및 토론을) BLE - 우리가 직접 Aβ의 식세포 작용에 관해서 AD의 마우스와 쥐 모델을 비교하고자되지 않습니다. 그럼에도 불구하고,이 플라크 관련된 단핵 식세포가 플라크 (그림 1D)에서 먼 세포에 비해 APP / PS1 마우스에 Aβ의 흡수를 증가했다고 주목했다. TgF344-AD 쥐은 매우 겸손 전체 Aβ 원 섬유의 흡수 및 플라크에서 거리의 함수로 Aβ 소 섬유 식균 작용에 변화 (그림 2D)를했다.

1 번 테이블
표 1 : 면역 염색 단핵 식세포, Phagolysosomes 및 APP / PS1 마우스 또는 TgF344-AD 쥐의 뇌 조직에서 아밀로이드 - β. 쥐 또는 마우스 특이 항체 칵테일은 괄호 안에 각각의 호스트로 표시됩니다. 색상은 이차 항체에 사용되는 형광을 나타낸다. 레드 : 알렉사 플 루어 594; 녹색 : 알렉사 플 루어 488;마젠타 : 알렉사 플 루어 647.

그림 1
그림 1 : 시각화 및 APP / PS1 마우스 뇌에서 아밀로이드 - β 탐식의 정량. (A) 뇌 Iba1 + 세포 (빨간색)를 보여주는 APP / PS1 마우스에서 섹션, 램프 1 + phagolysosomes (녹색) 및 4G8 + 아밀로이드 예금 (마젠타)의 공 촛점 이미지. 인셋 2 플라크와 관련된 단핵 식세포를 나타내고있다 인셋 1 플라크로부터 떨어진 단핵 식세포를 강조한다. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. 오른쪽에 작은 패널은 세트 1, 2 스케일 바 Iba1, 램프 1의 확대 한과 세트 1 Iba1, 램프 1의 2 (B) 3D 재구성 내 4G8 신호 및 4G8 신호 인 3 μm의를 나타냅니다. LAMP1 + phagolysosomes 의해 점유 Iba1 + 단핵 식세포 볼륨 (C) 정량. ( + Aβ에 의해 점유 된 세포 램프 1 + 포식 용해 소체 볼륨 D) 정량. 값은 colocalized하는 임계 값 이상의 신호의 비율 (복셀)를 기반으로합니다. 데이터는 평균 ±에게 플라크로부터 떨어진 단핵 식세포에 대한 평균 (N = 6 셀)의 표준 오차를 나타낸다 (1) 또는 플라크와 관련된 (2). ** 학생의 t 검정에 의한 P <0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
TgF344-AD 쥐의 뇌에서 시각화 및 아밀로이드 - β 탐식의 정량 : 그림 2. (A) 공 초점 Iba1 + 세포를 나타내는 TgF344-AD 쥐의 뇌 부분의 화상 (적색), CD68 + phagolysosomes (초록), OC + 수용성 섬유상 A & # 946; (마젠타). 인셋 2 플라크와 관련된 단핵 식세포를 나타내고있다 인셋 1 플라크로부터 떨어진 단핵 식세포를 강조한다. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. 오른쪽에 작은 패널은 세트 1, 2 스케일 바 세트 1 Iba1, CD68의 2 (B) 3D 재구성 및 OC 신호 내에서 Iba1, CD68의 확대 한 및 OC 신호 인 3 μm의를 나타냅니다. CD68 + phagolysosomes 의해 점유 Iba1 + 단핵 식세포 볼륨 (C) 정량. OC + Aβ에 의해 점유 된 세포 CD68 + 포식 용해 소체 볼륨 (D) 정량. 값은 colocalized하는 임계 값 이상의 신호의 비율 (복셀)를 기반으로합니다. 데이터는 평균 ±에게 플라크로부터 떨어진 단핵 식세포에 대한 평균 (N = 6 셀)의 표준 오차를 나타낸다 (1) 또는 플라크와 관련된 (2). ** 학생의 t 검정에 의한 P <0.01.rge.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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우리는 단핵 식세포에 의해 생체 내에서 Aβ의 식세포 작용의 진정한 3D 정량이 보고서에서 설명하는 프로토콜은 특정 세포와 세포 내 구획의 표시뿐만 아니라 Aβ 예금에 의존한다. 특히, 우리는 Iba1 (이온화 된 칼슘이 어댑터 분자 1 바인딩), 세포 활성화 (18, 19)에 막 파동 운동과 식균 작용에 관여하는 단백질이 뇌 단핵 식세포를 염색하는 데 사용. Iba1 + 세포는 일반적으로 뇌의 미세 아교 상주 간주되는 반면, 말초 단핵 식세포 침윤이 immunolabeled 셀의 서브 세트를 포함 할 가능성이 남아있다. 램프 1 20 CD68 21 : 세포 내 phagolysosomes 항체가 리소좀 / 엔도 솜 관련 막 당 단백질 (LAMP) 가족의 구성원 인식에 공개됩니다. 후자는 주로 작은 분수가 셀 s의 순환과, 리소좀과 엔도 좀에 지역화urface. 램프 1과 CD68 항체는 모두 성공적으로 쥐와 마우스 조직에서 사용되었으며, 사용에 대한 결정은 공동 염색 (표 1 참조)에 사용되는 다른 항체의 호스트에 주로 의존한다. 다양한 Aβ 항체의 검출에 사용될 수 있음에 유의하는 것이 중요하다. 마우스 조직에서 4G8가 (17, 인간 및 마우스의 아미노산 잔기 인식 - 24 Aβ 펩티드 22,도 1) - 검출 및 정량 분석을 가능하게 성공적으로 사용되었으며 6E10을 (17 (23), 도시하지 않은 데이터가 인간 아미노산 잔기 1 인식) 램프 1 + 또는 CD68 + Iba1 + 단핵 식세포에 존재하는 phagolysosomes에서 Aβ 콘텐츠. 다른 사람들이 보여 반면, 마우스 (16) <Iba1 +로 Aβ 흡수를 감소 - / - 우리 q3DISM 방법을 사용하여, 우리는 APPPS1 / IL-10의 뇌에서 Aβ 부하의 글로벌 감소와 관련된 Iba1 + 세포에서 증가 Aβ 부하를 관찰 / SUP> 헝겊-5xfAD 마우스 (24)의 뇌에서 증가 Aβ 부하와 플라크 부피 함께 세포. 이러한 결과는 포식 물질을 효율적으로 소화을 선택하지 않으면 우리의 방법론은 예측하는데 사용될 수는 없지만 관찰 된 현상이 활성 Aβ의 식세포 작용의 "스냅 샷"입니다 것이 좋습니다.

랫트 조직에서 우리는 OC를 사용하여 Aβ 침착 물을 검출하거나 (미도시) 6E10 17 (가용성 Aβ 올리고머 42 / 브릴 25, 26,도 2를 인식). 흥미롭게도, 아주 작은 OC + 피 브릴은 TgF344-AD 쥐의 뇌에서 단핵구 phagolysosomes에 참석했다. 이러한 현상은 이전 immunogold 염색 및 3D 재구성을 사용하여 27 APP23 트랜스 제닉 마우스에서보고 된 바있다. 주의 : 다른 Aβ 종 / 이형태 검출하기위한 항체의 다양한 가능한 잠재적으로 시험하고, 사용자의 결정에 사용될 수있다.

우리 q3DISM 기술이 미국 및 다른 사람들에 의해 채택되었다> NT는 "AD 16,24,28 컨텍스트에서 Aβ의 식균 작용을 정량화한다. 그러나,이 방법은 식균 작용의 거의 모든 형태를 평가하도록 구성 될 수있다. 또한, 조직에 적용될 수있다 뇌 이상, 그리고 (인간을 포함한) 다른 동물 종에 다른.이 프로토콜에 설명 된 절차는 형광 검출 및 공 초점 현미경으로 몇 군데, 표준 면역 염색에 의존하고 있습니다.이 보고서에서 우리는 가이드 라인에 따라 파라핀 조직을 사용했다 원한다면, 항체 제조에 의해 제공 하였다. 본 프로토콜은 또한 (PBS 2 % 아가로 오스에 내장) 신선한 조직에 대해 최적화 될 수있다.이 프로토콜은 또한 단백질 coaggregating의 식균 작용을 검출하기 위해 최적화 될 수있다. 이는 염색 획득함으로써 가능해진다 이미지는 4 개 이상의 색 형광체 (29)로 구성.이 경우, 제 colocalization을 채널 (단핵구 / phagolysosome)의 생성을 작성 하였다 될두 번째 colocalization을 채널의 (단백질 1 / 공동 집계 단백질이 집계). 그리고, 두 개의 채널은 3 차원 모델링 및 분석을 위해 사용된다.

q3DISM 기술은 특이 면역 항체의 품질의 감도 및 colocalization을 접근 방식에 의해 주로 제한됩니다. 이 다단계 절차에 따라서 염색의 품질과, Aβ 흡수의 3D 정량에 영향을 미칠 수있는 몇 가지 잠재적 인 함정이 있습니다. 프로 시저의 첫 번째 중요한 단계는 쥐의 뇌의 분리이다. 실제로 조심 조직 처리는 뇌의 손상을 방지하고, 절단시의 뇌의 구조를 그대로 유지하는 것이 보장하는 기본이다. 둘째, 조직 고정 시간에 걸쳐-고정 (4 % PFA 이상 16 시간)이 세포 내 phagolysosomes 및 Aβ 콘텐츠의 검색을 제한하기 때문에 매우 중요하다. 중요한 것은, 연속 1) 단핵구, 2) phagolysosomes의 염색 및 3) Aβ는 방법의 성공을 위해 중요하다. 그것은 ESSENT입니다IAL은 항체가 병용하지 consecutively- 사용할 수 있습니다. 3 차원 셀 phagolysosomes 및 Aβ 펩티드의 모델링뿐만 아니라 colocalization을이 조직 절편의 두께를 통한 세포 및 세포 내 구조의 이미징 품질에 의존 분석 이후 또한 Z 스택 공 초점 화상의 취득은 매우 중요하다. 마지막으로, 소프트웨어의 임계 값의 조정은 3D 모델링 및 colocalization을 분석을 위해 매우 중요합니다. 사실, 다른 채널에 대한 임계 값을주의 깊게 분석에서 그들이 (특정) 포함 된 신호를 결정하기 때문에, 선택 또는 제외 (배경) 할 필요가있다. 이 선택된 임계 값을 다른 동물 / 검체의 비교의 경우 샘플 간의 일관성을 유지하는 것이 또한 기본적인 것이다. 지금까지 고전 면역 조직 염색, 자기 공명 영상과 양전자 방출 단층 촬영 Aβ의 생체 내 시각화 및 정량에 대한 선택의 이미징 방법이었다30. 설치류 또는 AD 환자의 뇌에서 아밀로이드 부담의 대규모 정량에 매우 유용하지만,이 방법은 세포 내 Aβ의 시각화를위한 비효율적이다. 공 초점 현미경, 형광 분광법과 흐름을 사용하여 다른 기술은 세포 계측법 존재하고 차별과 체외 16,31,32에서 세포 내 Aβ 내용을 정량화하기 위해 우리와 다른 사람에 의해 사용되어왔다. 3D 재구성과 함께 Immunogold 염색 이전에 APP23 형질 전환 마우스 (27) 생체 내에서 미세 아교 세포에서 아밀로이드 원 섬유의 부재를 강조하기 위해 사용하고, 또 다른 연구가 성공적으로 제한 Aβ를 표시하는 미세 아교 세포 관련 β 아밀로이드 플라크와의 공 초점 이미징 및 3D 표면 재구성을 사용 상호 작용과 33 통풍 관. 그러나 이러한 기술은 내 포식 용해 소체 Aβ 종의 정량을 허용하지 않습니다. 기타 최근에 측정을 허용하는 생체 내 분석에서 형광 기반 개발쥐 (34)의 주변 대 식세포에 의한 식세포 활동. 이 방법은 생체 내에서 독창적 phagolysosomes 형광 bioprobes의 정량하지만, 사용 가능한 데이터가 원경 주변부에 한정되어 있습니다.

우리의 지식에, q3DISM는 설치류 AD 모델의 뇌에서 3D 시각화 및 Aβ의 식세포 작용의 정량을 가르치시는 첫 번째 방법입니다. 이 강력한 도구는 의심 할 여지없이 대뇌 Aβ의 식세포 작용의 깊은 이해에 방법을 포장하며, 다른 상황에서 유용 할 수 있습니다.

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Disclosures

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott NDC 0044-5260-05
Dissecting scissors VWR 82027-582
Dissecting scissors Blunt tip VWR 82027-588
Tweezers VWR 94024-408
23 G needle VWR BD305145
peristaltic pump FH10 Thermo Scientific 72-310-010
PBS 10x Bioland Scientific PBS01-02 Phosphate-buffered Saline; Working concentration 1x
Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm  Kent Scientific RBMS-200C
Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm  Kent Scientific RBMS-305C 
32% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) EMS 15714-S Caution: Toxic. Working concentration: 4% in PBS
Ethanol VWR 89125-188 Various concentrations, see protocol
Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura VWR 25608-774
Embedding and Infiltration Paraffin VWR 15147-839
Microtome Leica RM2125 Leica Biosystems
Disposable Microtome Blades  VWR 25608-964
Water bath Leica HI 1210 Leica Biosystems
Micro slide Superfrost plus VWR 48311-703
Xylene Sigma-Aldrich 534056-4X4L Caution: Toxic 
Target Retrieval Solution 10x DAKO S1699 Working concentration 1x
KimWipes VWR 21905-026
Hydrophobic PAP pen VWR 95025-252
Triton X-100 VWR 97062-208
Normal Donkey Serum (NDS) Jackson Immuno 017-000-121
Coverslips VWR 48393081
Prolong Gold antifade reagent with DAPI Life Technologies P36935
Glass Slide Rack VWR 100492-942
Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) Wako 019-19741  Working concentration 1:200
Iba1 antibody (polyclonal, goat) LifeSpan Bioscience LS-B2645 Working concentration 1:200
rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) Abcam ab955 Working concentration 1:200
mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) Abcam ab53444 Working concentration 1:200
mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) Affymetrix 14-1071 Working concentration 1:100
Beta-Amyloid, 17 - 24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) Covance SIG-39220 Working concentration 1:200
Beta-Amyloid, 1 - 16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) Covance SIG-39320 Working concentration 1:200
OC antibody (polyclonal, rabbit) Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) Working concentration 1:200
Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody Invitrogen A-11001 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 488 rat secondary antibody Invitrogen A-11006 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody Invitrogen A-11037 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 goat secondary antibody Invitrogen A-11080 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody Invitrogen A-21235 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody Invitrogen A-21443 Working concentration 1:1,000
Immersion oil Nikon 
A1 Confocal microscope Nikon 
NIS Elements Advanced Research software Nikon 
Imaris:Bitplane software version 7.6 Bitplane "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets.

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References

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양적 3D<em&gt; 인 실리코</em알츠하이머 병의 쥐 모델에서 뇌 아밀로이드 - 베타 탐식&gt; 모델링 (q3DISM)
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Guillot-Sestier, M. V., Weitz, T. M., Town, T. Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (118), e54868, doi:10.3791/54868 (2016).More

Guillot-Sestier, M. V., Weitz, T. M., Town, T. Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (118), e54868, doi:10.3791/54868 (2016).

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