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Medicine

3D cuantitativa doi: 10.3791/54868 Published: December 26, 2016

Summary

Hemos desarrollado una metodología para 3D cuantitativa en el modelado in silico (q3DISM) de β-amiloide cerebral fagocitosis (Aß) por los fagocitos mononucleares en modelos de roedores de la enfermedad de Alzheimer. Este método puede ser generalizado para la cuantificación de virtualmente cualquier caso fagocítica in vivo.

Abstract

Neuroinflamación es ahora reconocida como un factor etiológico importante en la enfermedad neurodegenerativa. fagocitos mononucleares son células inmunes innatas responsables de la fagocitosis y la eliminación de escombros y detritus. Estas células incluyen macrófagos residentes del SNC conocidas como microglia y fagocitos mononucleares infiltrantes de la periferia. Microscopía de luz en general se ha utilizado para visualizar la fagocitosis en roedores o muestras de cerebro humano. Sin embargo, los métodos cualitativos no han proporcionado pruebas definitivas de la fagocitosis in vivo. A continuación, describimos 3D cuantitativa en el modelado in silico (q3DISM), un método robusto que permite la cuantificación verdadera 3D de amiloide-β fagocitosis (Aß) por los fagocitos mononucleares en modelos de roedores de la enfermedad de Alzheimer (EA). El método implica la visualización de fluorescencia Aß encapsulado dentro fagolisosomas en secciones del cerebro de roedores. Grandes conjuntos de datos confocal z dimensiones son entonces reconstruidos en 3D para la cuantificación de A &# 946; espacialmente colocalized dentro del fagolisosoma. Se demuestra la aplicación exitosa de q3DISM de cerebros de ratones y ratas, pero esta metodología se puede extender a prácticamente cualquier evento de fagocitosis en cualquier tejido.

Introduction

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La enfermedad de Alzheimer (EA), la demencia más común relacionada con la edad 1, se caracteriza por la acumulación de amiloide cerebral-β (Aß) en forma de placas "seniles" ß-amiloide, la neuroinflamación crónica de bajo nivel, taupatía, pérdida neuronal y alteraciones cognitivas 2 . En los cerebros de pacientes con AD, la neuroinflamación se destina por los astrocitos y los fagocitos mononucleares reactiva (referida como microglia, aunque sus centrales vs. origen periférico sigue siendo poco clara) que rodea los depósitos de Aß 3. Como los centinelas inmunes innatas del CNS, microglia se posicionan centralmente para borrar cerebro Aß. Sin embargo, el reclutamiento microglial a las placas de Aß se acompaña de muy poca, o ninguna, la fagocitosis Aß 4,5. Una hipótesis es que la microglía son inicialmente neuroprotector por phagocytozing pequeños montajes de Aß. Sin embargo, con el tiempo estas células se convierten neurotóxico tan abrumadora carga de Aß y / o relacionada con la edad d funcionalecline, provoca la microglía en un fenotipo proinflamatorio disfuncional, lo que contribuye a la neurotoxicidad y la disminución cognitiva 6.

Los estudios de asociación de genoma completo (GWAS recientes) han identificado un grupo de alelos de riesgo de AD que pertenecen al núcleo vías inmune innata que modulan la fagocitosis 7 8-11. En consecuencia, la respuesta inmune a la deposición de amiloide cerebral se ha convertido en una importante área de interés, tanto en términos de la comprensión de la etiología de AD y para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos 12-14. Sin embargo, hay una necesidad vital de la metodología para evaluar la fagocitosis Aß in vivo. Para hacer frente a esta necesidad no satisfecha, hemos desarrollado 3D cuantitativa en el modelado in silico (q3DISM) para permitir la cuantificación real en 3D de la fagocitosis cerebral Aß por los fagocitos mononucleares en modelos de roedores de la enfermedad de Alzheimer similar.

Limitada sólo por el grado en que recapitular la enfermedad, los modelos animales tienensido de gran ayuda para la comprensión de pathoetiology AD y para la evaluación terapéutica experimental. Debido al hecho de que las mutaciones en los genes presenilina (PS) y la proteína amiloide Precursor (APP) causan independientemente AD autosómica dominante, estos transgenes mutantes se han utilizado ampliamente para generar modelos de roedores transgénicos. Los ratones transgénicos APP / PS1 co-expresar de forma simultánea "sueca" APP mutante humana (SWE APP) y Δ exón 9 presenilina humana mutante 1 (PS1ΔE9) presentes con amiloidosis cerebral acelerada y la neuroinflamación 15,16. Además, hemos generado ratones bi-transgénico coinjected con APP SWE y construcciones PS1ΔE9 (línea TgF344-AD, sobre un fondo Fischer 344). A diferencia de modelos de ratones transgénicos de amiloidosis cerebral, ratas TgF344-AD desarrollan amiloide cerebral que precede taupatía, pérdida de apoptosis de las neuronas, y el deterioro del comportamiento 17.

En este informe, se describe un protocolo para la immunostaining microglia, fagolisosomas y depósitos de Aß en secciones cerebrales de ratones APP / PS1 y ratas TgF344-AD, y la adquisición de grandes imágenes confocal z-dimensional. Nos detalle en la generación y análisis de las verdaderas reconstrucciones 3D a partir de conjuntos de datos confocal que permite la cuantificación de la captación de Aß en fagolisosomas microgliales silico. En términos más generales, la metodología que detallamos aquí se puede utilizar para cuantificar prácticamente cualquier forma de fagocitosis in vivo.

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Protocol

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Declaración de ética de la investigación: Todos los experimentos con animales que se detallan en este documento fueron aprobados por la Universidad del Sur de California Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) y lleva a cabo estrictamente de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud directrices y recomendaciones de la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Internacional de los Animales.

1. Aislamiento del roedor del cerebro y la preparación para la inmunotinción

DÍA 1:

  1. Coloque ratas TgF344-AD de edades (de 14 meses de edad) o APP / PS1 ratones (12 meses de edad) bajo anestesia con isoflurano profunda continua (4%). Evaluar la profundidad de la anestesia por pellizco del dedo del pie y la ausencia de reflejo de retirada.
  2. Corte a través de ambos lados de la caja torácica y levantar para exponer el corazón. Insertar una aguja de 23 G en el ventrículo izquierdo del corazón y hacer una pequeña incisión en la aurícula derecha. Continúe con el desangramiento por perfusión transcardial con solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo(PBS) usando una bomba peristáltica (30 ml para los ratones; 150-200 ml para ratas).
  3. Se practica una incisión en la línea media caudal en la piel y mover la piel y el músculo a un lado. Corte a través de la parte superior del cráneo a lo largo de la línea media y entre los ojos. Retire las placas óseas y aislar todo el cerebro del cráneo.
  4. Coloque el cerebro en una matriz de cerebro de roedores coronal y cortar en cuartos. Incubar cuartas partes posteriores O / N (16 h) en fijador paraformaldehído (4% PFA en PBS) a 4 ° C. Lavar 3x en PBS y, a continuación, transferir a un 70% de etanol. Precaución: PFA es tóxico y debe ser manejado bajo una campana química con el equipo de protección personal adecuado.

DIA 2:

  1. Coloque cuartas partes del cerebro en casetes de incrustación y progresivamente deshidratar tejido en sucesivamente más concentradas baños de etanol 1 h (70%, 80%, 95% y 100% x3).
  2. etanol Borrar en el tejido con tres sucesivos baños de xileno 100% (1 h cada una). Precaución: El xileno es tóxico y shOuld ser manejado bajo una campana química con el equipo de protección personal adecuado.
  3. Insertar el tejido en bloques de parafina después de dos cuartos de baño fundido de cera de parafina (56 a 58 ° C, 90 min cada uno).

DÍA 3:

  1. Cortar secciones de 10 micras de espesor de cerebros incluidos en parafina utilizando un microtomo. secciones se sumergen en un baño de agua (50 ° C durante 1 min) y se aplican a portaobjetos de microscopio. Deja las diapositivas para O / N se seque, lo que garantiza la adhesión del tejido a la diapositiva.

2. La inmunotinción

Nota: Las diferentes combinaciones de anticuerpos pueden ser utilizados para el procedimiento de tinción se describe a continuación. Cócteles de anticuerpos compatibles con el tejido cerebral de ratas y ratones se enumeran en la Tabla 1.

DÍA 4:

  1. Desparafinar secciones del cerebro usando 2x 100% baños de xileno (12 min cada uno).
  2. Rehidratar secciones de cerebro en baños sucesivos de etanol - 100% durante 10 min, 95% para 5 min, 80% para 10 min y, finalmente, 70% para 15 min - followed por lavados con PBS 3x [5 min a temperatura ambiente, con agitación ligera]. Mientras tanto, el calor solución de recuperación de antígenos a 95 - 97ºC en una placa caliente con agitación barra magnética.
  3. Incubar las secciones del cerebro en la solución de recuperación de antígeno a 95 - 97ºC durante 30 min. A continuación, lavar 3 veces en PBS (5 min a temperatura ambiente, con agitación ligera).
  4. Rápidamente secar los portaobjetos utilizando limpiaparabrisas tarea delicada para evitar la desecación del tejido, y trazar una barrera hidrofóbica alrededor de la zona de tejido con una pluma barrera hidrofóbica. Llene la región de tejido rodeada con tampón de bloqueo [PBS que contiene 0,3% de Triton X-100 y 10% normal burro suero (NDS)], y se incuba a TA durante 1 h en una cámara humidificada.
  5. Sustituir el tampón Iba1 anticuerpo primario (diluido en tampón de bloqueo) para etiquetar los fagocitos mononucleares, y se incuba O / N a 4 ° C en una cámara humidificada de bloqueo. Para los hosts de anticuerpos y diluciones de trabajo, véase la Tabla 1 y la Tabla de Materiales.

DÍA 5:

  1. Enjuagueanticuerpo primario con baños 3x PBS (5 min a temperatura ambiente con agitación ligera). Incubar con anticuerpo fluorescente secundario (conjugado con un fluoróforo de emisión 594 nm) durante 1 h (en tampón de bloqueo a temperatura ambiente en la oscuridad) seguido de baños 3x PBS (5 min a temperatura ambiente con agitación la luz). En este momento, mantener las secciones en la oscuridad para evitar la decoloración de la señal fluorescente.

DÍA 6 - 7:

  1. Repita los pasos 2.5 y 2.6 con CD68 (los cerebros de ratas) o LÁMPARA1 (tejido de ratón) de anticuerpos y anticuerpos secundarios apropiados (junto con un fluoróforo emisión de 488 nm) para etiquetar fagolisosomas.

DÍA 7 - 8:

  1. Repita los pasos 2.5 y 2.6 con OC (tejido de rata) o 4G8 (cerebros de ratón) de anticuerpos y anticuerpos secundarios apropiados (acoplado a un fluoróforo 647 nm) para marcar los depósitos de Aß.
    NOTA: Como alternativa, el anticuerpo 6E10 puede ser utilizado con éxito tanto en el ratón y la rata de tejido. Para las combinaciones de anticuerpos adecuados, consulte la Tabla de Materiales
  2. Permitir a las secciones completamente seca O / N a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, la cubierta especímenes con una hoja de cubierta sellada por medio de montaje de fluorescencia DAPI.

3. Adquisición de Gran Z-pila confocal Conjuntos de datos

Nota: Este protocolo requiere un escaneo láser confocal microscopio totalmente automatizado equipado con un objetivo de 60X y 405 nm, 488 nm, 594 nm, y 647 nm láser. Todo el equipo es controlado por un software de imagen y control del láser ordenador. Antes de comenzar el protocolo de imagen, encendido de la computadora, lámpara de epifluorescencia, microscopio, láser y cámara.

DÍA 9:

  1. Seleccione el objetivo del microscopio 60X. Añadir el aceite de inmersión de la lente, y colocar la muestra en el soporte del microscopio de diapositivas. Elevar el objetivo hasta que el aceite se pone en contacto con la corredera. Ajustar el plano focal para localizar las placas de amiloide en el hipocampo o la corteza cerebral y requiere una iluminación de epifluorescencia a través de los oculares.
  2. Adquirir im confocaledades de los fagocitos mononucleares activados que rodean los depósitos de amiloide en el hipocampo o la corteza de los roedores por microscopía confocal (ampliación 60X, pasos pila Z: 0,25 m <z <0,40 m, el número de pasos 25 <n <35).

4. q3DISM

Nota: Con el fin de producir resultados significativos, se sugiere el análisis de un mínimo de 3 imágenes por animal / región de interés. Para cada imagen, la abundancia de células a analizar puede variar dependiendo de los paradigmas experimentales. En los resultados representativos mostrados en este informe, analizamos 3 células / condición (por ejemplo, los fagocitos mononucleares distantes o asociados con placas; véanse las Figuras 1C - D y 2C - D).

DÍA 10:

  1. Analizar conjuntos de datos confocal con colocalización de procesamiento de imágenes 3D científica y análisis de software (coloc) Módulo de proximidad espacial de Iba1 / CD68 (tejido de rata) o Iba1 / LÁMPARA1 (tejido de ratón) tinción en todos los planos z simultáneamente.Crear Iba + / CD68 + o canales Iba + / + LÁMPARA1 colocalización que corresponden a fagolisosomas dentro de los fagocitos mononucleares activados.
    1. Seleccionar TRITC para el canal A (correspondiente a la tinción Iba1 junto con 594 fluoróforo nm) y FITC para el canal B (correspondiente a CD68 o tinción LAMP1 junto con 488 fluoróforo nm). En la parte derecha de la ventana del software de 'modo de chequeo,' 'umbral', seleccionar y de 'intensidades Coloc,' Seleccionar '' canales de origen.
    2. Haga clic en 'Editar' para seleccionar 'de color coloc' en el lado derecho de la ventana del software.
    3. Para cada canal de forma independiente, ajustar los umbrales para incluir y excluir a una tinción específica fondo señales / no específicos. Una vez ajustado, no cambie umbrales entre imágenes para garantizar un análisis imparcial. Los voxels (pixels colocalized de todos los z-pilas) aparecerán en el color seleccionado en el paso 4.1.2 en todos los z-pilas SIMultaneously.
    4. Haga clic en "construir el canal coloc '. El canal de colocalización creado aparecerá en la ventana de ajuste de visualización.
    5. Haga clic en el canal coloc para abrir estadísticas del canal. El '% del volumen / material A por encima del umbral colocalizó' representa el% de señal Iba1 (voxels correspondientes al fluoróforo 594 nm) colocalized con LÁMPARA1 o señal de CD68 (voxels correspondientes al fluoróforo 488 nm). Más simplemente, esto es el volumen ocupado por los monocitos fagolisosomas (ver las figuras 1C y 2C).
      NOTA: '% del volumen / material B por encima del umbral colocalizó' corresponde al% de la señal LÁMPARA1 o CD68 colocalized con Iba1. Esto debería ser cercana al 100%, como fagolisosomas son estructuras intracelulares. Los valores se basan en la relación entre la señal de todos los z-pilas por encima del umbral colocalized.
  2. Con el módulo de coloc, analizar el canal coloc creado en el paso 4.1 para la proximidad espacial con OC (ti rataN ú mero) o 4G8 (tejido de ratón) señales de Aß. Esto permite la cuantificación de Aß encapsulado dentro de fagolisosomas.
    1. Seleccione el canal Un conjunto de datos coloc (correspondiente a la Iba1 / CD68 o canal Iba1 / LAMP1 coloc creado en el paso 4.1) y Cy5 para el canal B (correspondiente a OC o tinción 4G8 junto con 647 fluoróforo nm).
    2. Construir un canal coloc como se describe en los pasos 4.1.2 a 4.1.5.
    3. Haga clic en el canal coloc para abrir estadísticas del canal. El "% de volumen / material A por encima del umbral colocalized 'representa el% de Iba1 / LAMP1 o Iba1 / CD68 (voxels correspondiente al canal coloc construido en el paso 4.1.5.) Colocalized con OC o señal 4G8 (voxels que corresponde a la 647 nm fluoróforo). Este es el volumen ocupado por fagolisosómico beta (véanse las figuras 1D y 2D).
      NOTA: '% del volumen / material B por encima del umbral colocalizó' se corresponde con la señal de Aß% de total de colocalized con fagolisosomas.Esto se puede utilizar para evaluar la fracción del total de depósitos de Aß encapsulados dentro fagolisosomas (no se muestra en los presentes resultados representativos).
  3. Utilice el módulo de superar a reconstruir las pilas de imágenes confocal y generar modelos 3D de Aß encapsulados dentro fagolisosomas monocitos.
    1. En la ventana de "ajuste de visualización ', seleccione TRITC (tinción para mostrar solamente Iba1). En la ventana '' propiedades del volumen, haga clic en "añadir nueva superficie '.
    2. En el paso '1/5 algoritmo', en 'Configuración', seleccione 'superficie'. Además, en 'Color', seleccionar el tipo de color en la paleta o RGB y ajustar la transparencia (rojo se fija en el 60% de transparencia en las figuras 1B y 2B). casilla de verificación "Seleccionar una región de interés". Haga clic en Siguiente.
    3. En el Paso '2/5 región de interés,' dibujar una ventana alrededor de la célula de interés mediante el ajuste de X, Y y Z coordenadas (ver cuadros blancos en las figuras 1A 2A). Haga clic en Siguiente.
    4. En el Paso '3/5 canal de origen', seleccione el canal de origen TRITC. Marque la casilla 'suave', y el nivel de detalle superficie de 0,4 micras. Para 'umbral', seleccione la intensidad absoluta. Haga clic en Siguiente.
    5. En el Paso '4/5 umbral,' ajustar el umbral de modo que el volumen creado superpone a la perfección con la señal del canal TRITC. Haga clic en Siguiente.
    6. En el Paso '5/5 clasifican superficies,' en la sección 'tipo de filtro,' seleccionar objetos en función de su tamaño para ser incluidos o excluidos de los volúmenes a ser creados. Haga clic en Finalizar, ejecutar todos los pasos de creación, y salir del asistente.
    7. Repetir los pasos 4.3.1 a 4.3.6 para crear una superficie 3D para el canal de FITC (LAMP1 + o CD68 + fagolisosomas).
    8. Repita los pasos 4.3.1 a 4.3.6 para crear una superficie 3D para el canal de Cy5 (4G8 + depósitos de Aß OC + o).

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Representative Results

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Utilizando la metodología de múltiples etapas para q3DISM se ha detallado anteriormente, somos capaces de cuantificar la absorción de Aß en fagolisosomas monocitos en los cerebros de APP / PS1 ratones (Figura 1) y ratas TgF344-AD (Figura 2). Por lo tanto, la metodología q3DISM ha permitido el análisis de los fagocitos mononucleares en ratón y rata modelos de AD. Curiosamente, el volumen ocupado por CD68 + fagolisosomas es significativamente mayor en los fagocitos mononucleares Iba1 + asociados con comparación con distante de placas tanto en APP / PS1 ratones (Figura 1B, C) y las ratas TgF344-AD (Figura 2B, C). Estos datos muestran que los fagocitos mononucleares cerca de las placas están listas para la fagocitosis en comparación con las células situadas lejos de la placa. Con el fin de ilustrar la gama de datos de la tinción de diferentes confórmeros Aß, hemos utilizado varios anticuerpos en el ratón y el tejido de rata (detallado en Table 1 y discusión) - no estamos tratando de comparar directamente los modelos de ratón y de rata de la EA con respecto a Aß fagocitosis. No obstante, era digno de mención que la placa asociada fagocitos mononucleares habían aumento de la captación de Aß en ratones APP / PS1 comparación con las células distantes de las placas (Figura 1D). Ratas TgF344-AD tenían muy modesto absorción de fibrillas Aß en general, y no hay cambio en la fagocitosis de fibrillas Aß como una función de la distancia de las placas (Figura 2D).

tabla 1
Tabla 1: La inmunotinción los fagocitos mononucleares, fagolisosomas y β-amiloide en el tejido cerebral de ratones APP / PS1 o ratas TgF344-AD. Ratas o ratones cócteles de anticuerpos específicos se enumeran con sus respectivos acogida entre paréntesis. Los colores indican el fluoróforo usado para el anticuerpo secundario. Red: Alexa Fluor 594; verde: Alexa Fluor 488;magenta: Alexa Fluor 647.

Figura 1
Figura 1: La visualización y cuantificación de amiloide-β fagocitosis en los cerebros de APP / PS1 de ratón. (A) Confocal de imágenes de secciones del cerebro de un ratón APP / PS1 que muestran Iba1 + células (rojo), LÁMPARA1 + fagolisosomas (verde) y 4G8 + depósitos de amiloide (magenta). El recuadro 1 pone de relieve un fagocito mononuclear distante de la placa, mientras que la inserción 2 muestra un fagocito mononuclear asociado con la placa. La barra de escala indica 50 micras. Los paneles más pequeños de la derecha son ampliaciones de Iba1, LÁMPARA1 y 4G8 señales dentro de inserciones 1 y 2. reconstrucción (B) 3D de Iba1, LÁMPARA1 y señales 4G8 para inserciones 1 y 2. La barra de escala de puntos marca el 3 micras. (C) La cuantificación de Iba1 + volumen de fagocitos mononucleares ocupado por LÁMPARA1 + fagolisosomas. ( + intracelular phagolysosomal ocupado por 4G8 + Aß. Los valores se basan en la relación de la señal (voxels) por encima del umbral que se colocalizó. Los datos se muestran como media ± error estándar de la media (n = 6 células) por fagocitos mononucleares distantes de las placas (1), o asociados con las placas (2). ** P <0,01 por la prueba t de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: La visualización y cuantificación de amiloide-β fagocitosis en los cerebros de ratas TgF344-AD. (A) Confocal de imágenes de secciones del cerebro de una rata TgF344-AD que muestra células Iba1 + (rojo), CD68 + fagolisosomas (verde), y OC + fibrilar soluble A & # 946; (magenta). El recuadro 1 pone de relieve un fagocito mononuclear distante de la placa, mientras que la inserción 2 muestra un fagocito mononuclear asociado con la placa. La barra de escala indica 50 micras. Los paneles más pequeños de la derecha son ampliaciones de Iba1, CD68 y señales OC dentro de inserciones 1 y 2. (B) la reconstrucción 3D de Iba1, CD68 y las señales de CO para inserciones 1 y 2. La barra de escala indica 3 micras. (C) La cuantificación de Iba1 + volumen de fagocitos mononucleares ocupado por fagolisosomas CD68 +. (D) La cuantificación del volumen de CD68 + intracelular phagolysosomal ocupado por OC + Aß. Los valores se basan en la relación de la señal (voxels) por encima del umbral que se colocalizó. Los datos se muestran como media ± error estándar de la media (n = 6 células) por fagocitos mononucleares distantes de las placas (1), o asociados con las placas (2). ** P <0,01 por la prueba t de Student.rge.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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El protocolo que se describe en este informe para una verdadera cuantificación 3D de Aß fagocitosis in vivo por los fagocitos mononucleares se basa en el etiquetado específico de los compartimentos celulares y subcelulares, así como los depósitos de Aß. Específicamente, usamos Iba1 (ionizada-calcio Encuadernación adaptador molécula 1), una proteína que está implicada en ruffling membrana y la fagocitosis tras la activación de células 18, 19, para teñir los fagocitos mononucleares cerebrales. Mientras que las células Iba1 + son generalmente considerados como microglia cerebro residente, sigue siendo posible que periféricamente infiltrantes fagocitos mononucleares comprenden un subconjunto de células inmunomarcadas. Fagolisosomas intracelulares se revelaron con anticuerpos que reconocen los miembros de la familia lisosomal / endosomal-glicoproteína asociada a la membrana (LAMP): LÁMPARA1 20 o 21 CD68. Esta última se localiza principalmente a los lisosomas y endosomas, con una fracción más pequeña de circulación a la s célulasTu cara. LÁMPARA1 anticuerpos CD68 y ambos se han utilizado con éxito en el tejido de la rata y el ratón, y la decisión sobre cuál utilizar depende principalmente de la cantidad de otros anticuerpos utilizados para la co-tinción (véase el cuadro 1). Es importante tener en cuenta que diversos anticuerpos se pueden utilizar para la detección de Aß. En tejido de ratón, 4G8 (que reconoce los residuos de aminoácidos humanos y de ratón 17-24 de Aß péptido 22, Figura 1) y 6E10 (que reconoce los residuos de aminoácidos humana 1-17 23, datos no mostrados) se han utilizado con éxito, lo que permite la detección y cuantificación de contenido Aß en LAMP1 + o CD68 + fagolisosomas presentes en fagocitos mononucleares Iba1 +. El uso de nuestra metodología q3DISM, se observó aumento de la carga de Aß en las células Iba1 + asociados con la reducción global de la carga de Aß en el cerebro de los APPPS1 / IL-10 - / - ratones 16, mientras que otros mostraron disminución de la captación de Aß en Iba1 + < / sup> células acompañados por un mayor volumen de carga y la placa de Aß en el cerebro de los ratones de trapo-5xfAD 24. Estos resultados sugieren que el fenómeno observado es una "instantánea" de la fagocitosis activa Aß, aunque nuestra metodología no se puede usar para predecir si el material fagocitado se digiere y se aclaró de manera eficiente.

En el tejido de rata, se detectó depósitos de Aß utilizando OC (reconociendo solubles Aß 42 oligómeros / fibrillas 25,26, Figura 2) o 6E10 17 (no mostrado). Curiosamente, muy pocas fibrillas OC + estaban presentes en fagolisosomas monocitos en los cerebros de ratas TgF344-AD. Este fenómeno ha sido previamente informado en APP23 ratones transgénicos utilizando tinción inmuno y la reconstrucción 3D 27. Nota: una variedad de anticuerpos para la detección de diferentes especies / confórmeros Aß están disponibles y, potencialmente, puede ser probado y emplearse a discreción del usuario.

nt "> Nuestra técnica q3DISM ha sido adoptado por nosotros y otros para cuantificar Aß fagocitosis en el contexto de AD 16,24,28. Sin embargo, el método puede adaptarse para evaluar prácticamente cualquier forma de la fagocitosis. También se puede aplicar a los tejidos aparte del cerebro, y para otras especies animales (incluidos los humanos). los procedimientos descritos en este protocolo se basan en la inmunotinción estándar, que se detectó con fluorescencia y fotografiado con un microscopio confocal. en este informe, hemos utilizado tejido incluido en parafina de acuerdo con las directrices proporcionada por los fabricantes de anticuerpos. Si se desea, el presente protocolo podría también ser optimizado para tejido fresco (incrustado en 2% de agarosa en PBS). el protocolo también se puede optimizar para detectar la fagocitosis de coaggregating proteínas. Esto se hace posible mediante la tinción y la adquisición imágenes compuestas de más de 4 colores fluorescentes 29. En este caso, la creación de la primera canal de colocalización (monocitos / fagolisosoma) sería seguido por la creaciónde un segundo canal de colocalización (agregado de proteínas 1 / co-agregados de proteínas 2). Entonces, los dos canales se utilizan para el análisis y modelado 3D.

La técnica q3DISM está limitada principalmente por la especificidad y sensibilidad de la inmunotinción, la calidad de los anticuerpos, y el enfoque de colocalización. Este procedimiento de múltiples etapas tiene algunos peligros potenciales que pueden afectar la calidad de la tinción y, por lo tanto, la cuantificación de la captación de 3D Aß. El primer paso crítico del procedimiento es el aislamiento de cerebros de roedores. De hecho, la manipulación de tejidos cuidadosa es fundamental para evitar daños en el cerebro y para garantizar que las estructuras cerebrales permanecen intactas cuando seccionada. En segundo lugar, el tiempo de fijación del tejido es muy importante, ya que el exceso de fijación (más de 16 horas en PFA al 4%) de los límites de detección fagolisosomas subcelulares y contenido de Aß. Es importante destacar que, la tinción sucesiva de 1) monocitos, 2) fagolisosomas y 3) Aß es crítico para el éxito del método. Es Essential de usar los anticuerpos no consecutively- concomitantemente. Además, la adquisición de las imágenes confocal z-pila es de suma importancia, ya que el modelado 3D de células, fagolisosomas y péptido Aß así como colocalización análisis depende de la calidad de las imágenes de las estructuras celulares y subcelulares a través del espesor de la sección de tejido. Por último, el ajuste de los umbrales en el software es crucial para el modelado 3D y para el análisis de colocalización. De hecho, los umbrales de los diferentes canales deben ser elegidos cuidadosamente, ya que determinarán qué señal se incluyó (específica) o excluidos (fondo) del análisis. También es fundamental que los umbrales elegidos se mantienen consistentes entre muestras en el caso de la comparación de diferentes animales / especímenes. Hasta el momento, inmunohistotinción clásica, la resonancia y la tomografía por emisión de positrones magnética han sido los métodos de imagen de elección para la visualización in vivo y cuantificación de Aß30. Aunque muy útil para la cuantificación a gran escala de la carga de amiloide en los cerebros de roedores o pacientes con AD, estos métodos son ineficaces para la visualización de intracelular Aß. Otras técnicas mediante microscopía confocal, la espectroscopia de fluorescencia y citometría de flujo existen y se han utilizado por nosotros y otros para discriminar y cuantificar el contenido de Aß intracelular in vitro 16,31,32. Tinción Inmunoelectrónica junto con reconstrucción 3D fue utilizado anteriormente para poner de relieve la ausencia de fibrillas de amiloide dentro de la microglia in vivo en APP23 ratones transgénicos 27, y otro estudio utilizó con éxito imagen confocal y 3D reconstrucción de la superficie de la microglia asociada con placas de beta-amiloide para mostrar Aß limitada interacción y absorción 33. Sin embargo, estas técnicas no permiten la cuantificación de intra-fagolisosómico especies Aß. Otros han desarrollado recientemente una fluorescencia basado en ensayo in vivo que permite la mediciónde la actividad fagocítica de los macrófagos periféricos en la rata 34. Este método permite ingeniosamente para la cuantificación de biosondas fluorescentes en fagolisosomas en vivo, sin embargo, los datos disponibles hasta ahora se limitan a la periferia.

Para nuestro conocimiento, es la primera q3DISM método que permite la visualización en 3D y cuantificación de Aß fagocitosis en los cerebros de modelos de roedores de AD. Esta herramienta formidable, sin duda, allanar el camino a una comprensión más profunda de Aß cerebral fagocitosis, y también puede resultar útil en otros contextos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott NDC 0044-5260-05
Dissecting scissors VWR 82027-582
Dissecting scissors Blunt tip VWR 82027-588
Tweezers VWR 94024-408
23 G needle VWR BD305145
peristaltic pump FH10 Thermo Scientific 72-310-010
PBS 10x Bioland Scientific PBS01-02 Phosphate-buffered Saline; Working concentration 1x
Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm  Kent Scientific RBMS-200C
Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm  Kent Scientific RBMS-305C 
32% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) EMS 15714-S Caution: Toxic. Working concentration: 4% in PBS
Ethanol VWR 89125-188 Various concentrations, see protocol
Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura VWR 25608-774
Embedding and Infiltration Paraffin VWR 15147-839
Microtome Leica RM2125 Leica Biosystems
Disposable Microtome Blades  VWR 25608-964
Water bath Leica HI 1210 Leica Biosystems
Micro slide Superfrost plus VWR 48311-703
Xylene Sigma-Aldrich 534056-4X4L Caution: Toxic 
Target Retrieval Solution 10x DAKO S1699 Working concentration 1x
KimWipes VWR 21905-026
Hydrophobic PAP pen VWR 95025-252
Triton X-100 VWR 97062-208
Normal Donkey Serum (NDS) Jackson Immuno 017-000-121
Coverslips VWR 48393081
Prolong Gold antifade reagent with DAPI Life Technologies P36935
Glass Slide Rack VWR 100492-942
Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) Wako 019-19741  Working concentration 1:200
Iba1 antibody (polyclonal, goat) LifeSpan Bioscience LS-B2645 Working concentration 1:200
rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) Abcam ab955 Working concentration 1:200
mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) Abcam ab53444 Working concentration 1:200
mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) Affymetrix 14-1071 Working concentration 1:100
Beta-Amyloid, 17 - 24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) Covance SIG-39220 Working concentration 1:200
Beta-Amyloid, 1 - 16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) Covance SIG-39320 Working concentration 1:200
OC antibody (polyclonal, rabbit) Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) Working concentration 1:200
Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody Invitrogen A-11001 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 488 rat secondary antibody Invitrogen A-11006 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody Invitrogen A-11037 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 goat secondary antibody Invitrogen A-11080 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody Invitrogen A-21235 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody Invitrogen A-21443 Working concentration 1:1,000
Immersion oil Nikon 
A1 Confocal microscope Nikon 
NIS Elements Advanced Research software Nikon 
Imaris:Bitplane software version 7.6 Bitplane "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets.

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References

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3D cuantitativa<em&gt; In silico</em&gt; Modelado (q3DISM) de beta-amiloide cerebral fagocitosis en roedores modelos de enfermedad de Alzheimer
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Guillot-Sestier, M. V., Weitz, T. M., Town, T. Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (118), e54868, doi:10.3791/54868 (2016).More

Guillot-Sestier, M. V., Weitz, T. M., Town, T. Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (118), e54868, doi:10.3791/54868 (2016).

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