Summary
En protokol til direkte måling af partikelstørrelsesfordelingen i koncentrerede løsninger ved hjælp af dynamisk lysspredning mikroskopi præsenteres.
Protocol
1. Prøvefremstilling
- Oprensning af temperaturfølsomme monomerer
- Opløs 20 g N -isopropylacrylamide (NIPA) i 100 ml toluen.
- Opløsningen filtreres under sugning for at fjerne støv.
- Bland filtratet med 500 ml petroleumsether.
- Placer reaktionsbeholderen i et is-vand-bad.
- Opløsningen omrøres, indtil monomererne udfældes (typisk 30 min).
- Opløsningen filtreres under sugning til opnåelse af de udfældede monomerer.
- Tør monomererne under reduceret tryk (100 Pa) natten over.
- Fremstilling af temperaturfølsomme polymeropløsning
- Degas 20 ml deioniseret vand i 1,0 minut under anvendelse af en membranpumpe.
- Opløs 780.8 mg af de oprensede NIPA i 9,5 ml afgasset og deioniseret vand.
- Placer reaktionsbeholderen i et is-vand-bad.
- Beskyt reaktionen fralys ved at dække apparatet med aluminiumsfolie.
- Omrør opløsningen forsigtigt i 10 minutter, medens indføring af en moderat strøm af argongas forsigtigt via en pipettespids fastgjort til gasflasken med et rør.
- Tilføj 11.9 pi N, N, N ', N' tetramethylethylendiamin til opløsningen via en mikropipette.
- Opløsningen omrøres i 1,0 minutter under indføring Ar gas, som nævnt i trin 1.2.5.
- Under omrøring af prøven opløses 4,0 mg ammoniumpersulfat i 0,5 ml afgasset og deioniseret vand.
- Bland prøveopløsningen (fra trin 1.2.7) og ammoniumpersulfat opløsning (fra trin 1.2.8).
- Opløsningen omrøres i 30 s, mens indføring Ar gas, som nævnt i trin 1.2.5.
- Dæk løsningen med alufolie, og holde det i køleskab (4 ° C) natten over.
- Udarbejdelse af prøveholderne
- Placer 60 uL af prøveopløsningen (fratrin 1.2.11) i et hulrum dias.
- Dæk løsning med en cirkulær dækglas. Pas på ikke at fælde luftbobler.
- Fjern overskydende løsning med en mikropipette og laboratorium klude.
- Forsegl prøven med lim. Lad limen tørre ved stuetemperatur (typisk 6 h).
- Forbered andet dias fyldt med 0,1 vægt-% polystyren latex (100-nm partikeldiameter) suspension ved at følge trin 1.3.1-1.3.4. Denne slide er anvendt som standard.
2. Particle Size Measurement med en dynamisk lysspredning Microscope
- Optimering af instrumentet
- Placer polystyrenlatex suspension slide (fra trin 1.3.5) på den fase af inverteret mikroskop. Dækslet glas side skal vende nedad.
- Placer en stråle spjæld foran detektoren (en lavine fotodiode og en autokorrelator).
- Anvende en laserstråle (solid-state laser, λ = 488 nm, 30 mW, kontinuerligbølge) til prøven gennem en objektiv linse (10 ×). En del af det reflekterede lys går gennem en lancering spejl af mikroskopet og overholdes af et CCD-kamera monteret ved sideporten af mikroskopet (figur 1).
- Juster højden af objektivlinsen at indstille omdrejningspunktet på prøve suspension ved at flytte højden af objektiv fra lav-til-høj position. Under denne procedure er det reflekterede billede fokuseret tre gange: ved overfladen af dækglasset, ved grænsefladen mellem dækglasset og prøven, og ved grænsefladen mellem prøven og hullet-objektglas. Indstil omdrejningspunktet mellem anden og tredje point.
- Dæmpe spredte lysintensitet ved at ændre lasereffekten.
- Indføre det spredte lys til detektoren ved at fjerne bjælken spjæld foran detektoren. Denne enhed måler tidsmæssig sammenhæng af lysintensiteten.
- Sæt et pinhole (φ = 50 um) between mikroskopet og detektoren for at opnå den konfokale virkning. Justere placeringen af taphullet at maksimere lysintensiteten ved detektoren.
- Måle den tid korrelationsfunktionen af spredte lysintensitet i 30 s ved at initiere driften af korrelatoren via en computer. Den målte korrelationsfunktion udtrykkes ofte som g (2) (t) - 1, hvor t er korrelationstiden 4 og
. Her, I (t) er det spredte lys intensiteten til tiden t og (•••) T er tidsmidling. Den henfald tid vil være ca. 0,1 ms. - Justere fokuspunktet for at opnå et bredt område for den første amplitude af tiden korrelationsfunktionen (g (2) (t = 0) - 1).
BEMÆRK: Den oprindelige amplitude er stærkt påvirket af mængden af reflekteret lys. Ved at flytte omdrejningspunktet slæbard grænsefladen mellem dækglasset og prøven, mængden af reflekteret lys stiger. For stærke lys spredere, såsom polystyren latex, kan den oprindelige amplitude ændres fra 0 til 1. Det er imidlertid vanskeligt at sætte det oprindelige amplitude tæt på 1 for mere almindelige polymeropløsninger, fordi intensiteten af det reflekterede lys er meget højere end den af det spredte lys. - Påfør den inverse Laplace transformation (ved hjælp af den begrænsede legalisering programmet CONTIN 13,14) til den opnåede tid korrelationsfunktionen at erhverve funktionen størrelsesfordeling. I tilfælde, hvor den oprindelige amplitude er indstillet til mindre end 0,2, vil fordelingsfunktionen for den hydrodynamiske radius viser en skarp top omkring 100 nm, hvilket er to gange den faktiske radius (se diskussionen for detaljer).
- prøve måling
- Sætte scenen temperaturen til 25 ° C.
- Placer et dias forberedt med poly-NIPA (PNIPA) solution (trin 1.3.4) på scenen af mikroskopet.
- Mål tidsmæssige sammenhæng funktion af spredte lysintensitet ved at følge trin 2.1.4-2.1.8. Hvis den første amplitude er større end 0,2, justere fokuspunktet for at gøre den indledende amplitude af tiden korrelationsfunktionen mindre end 0,2 ved at følge trin 2.1.9. En lille indledende amplitude forenkler analysen.
- Indstil scenen temperaturen til 35 ° C, og vent, indtil opløsningen bliver uklar. Den nedre kritiske opløsningstemperatur (LCST) af PNIPA løsning er 32 ° C 15.
- Mål tid korrelationsfunktionen ved følgende trin 2.1.4-2.1.8. Hvis muligt, justere placeringen af fokuspunktet for at gøre den indledende amplitude af tiden korrelationsfunktionen mindre end 0,2. For grumsede opløsninger, deres oprindelige amplituder tendens til at stige, idet intensiteten af det spredte lys forøges, mens den for det reflekterede lys forbliver konstant.
- Påfør den inverse Laplace transformatividere til de opnåede tidskorrelationsfunktioner at opnå de funktioner størrelsesfordeling. Bemærk, at den faktiske størrelse er halvdelen den opnåede værdi i tilfælde, hvor den oprindelige amplitude er mindre end 0,2.
. Her, I (t) er det spredte lys intensiteten til tiden t og (•••) T er tidsmidling. Den henfald tid vil være ca. 0,1 ms. Representative Results
Tidskorrelationsfunktioner af spredt lys styrke for en polystyrenlatex suspension (partikel radius: 50 nm) blev målt ved forskellige knudepunkter, som vist i figur 2 (a). Disse Korrelationsfunktionerne blev omregnet til distributions- funktioner hydrodynamiske radius af den inverse Laplace transformation (se figur 2 (b) og (c)). Under anvendelse af samme procedure blev tidskorrelationsfunktioner og fordelingsfunktioner af den hydrodynamiske radius af PNIPA opløsning opnået ved 25 ° C og 35 ° C. Figurerne 3 (a) og (b) viser de tidskorrelationsfunktioner af det spredte lysintensitet og de tilsvarende størrelse fordelingsfunktioner af PNIPA opløsning nedenfor (25 ° C) og derover (35 ° C) LCST. Størrelsesfordelingen funktioner blev opnået ved den inverse Laplace transformation efterfulgt afkorrektion af den delvise heterodyne. Den gennemsnitlige hydrodynamiske radius under LCST er adskillige tiendedele af en nanometer, hvilket er typisk for polymeropløsninger. I modsætning hertil den hydrodynamiske radius over LCST er ca. 1,0 um. Dette resultat er i overensstemmelse med det forhold, at opløsningen er uklar over LCST. De røde og blå linier i figur 3 repræsenterer størrelsesfordelingen af PNIPA opnåede opløsninger umiddelbart efter og 20 minutter efter at opløsningen blev uklar, hhv. Figur 3 (b) viser klart væksten af aggregeringen.
Figur 1. Skema af den dynamisk lysspredning mikroskop. Pinhole (PH), beam splitter (BS), polarisator (Pol), og lavine fotodiode (APD). Klik her for at seen større version af denne figur.
Figur 2. Repræsentative resultater for en polystyrenlatex suspension. (A) tidskorrelationsfunktioner af det spredte lysintensitet for polystyren latex suspension. Den nominelle radius er 50 nm, og koncentrationen er 0,1 vægt%. To datasæt blev opnået fra forskellige spredningsretninger point. (B), (c) Tilsvarende størrelse fordelingsfunktioner for polystyren latex suspension opnået ved invers Laplacetransformation af (a). Den røde linje svarer til den tid korrelationsfunktionen hvis oprindelige amplitude er ca. 1,0, og den blå linje svarer til den, der med en første amplitude, der er cirka 0,2. Den vandrette akse blev beregnet uden (b) og med (c) at overveje effekten af delvis heterodyning (PHD) når A << ; 1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Repræsentative resultater for en PNIPA løsning. (A) Time korrelation funktioner spredt lysintensitet for PNIPA løsning. (B) Tilsvarende størrelse fordelingsfunktioner for PNIPA opløsning opnået ved den inverse Laplace transformation af (a). Den vandrette akse blev beregnet på basis af effekten af delvis heterodyning for hvert datasæt. Den sorte linje repræsenterer de opnåede data ved 25 ° C. Den røde linje repræsenterer de opnåede data lige efter opløsningen blev uklar (35 ° C). Den blå linje repræsenterer de opnåede data efter en 20-min måling af den røde linje./54885/54885fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Den indledende amplitude af tiden korrelationsfunktionen stærkt afhænger omdrejningspunktet som vist i figur 2 (a). Dette strider tilsyneladende det faktum, at opløsningen er homogen (bortset fra den tynde lag ved grænsefladen) 8. Denne variation i den oprindelige amplitude tilskrives en variation i mængden af reflekteret lys. Delvis heterodyne teori 16 forudsiger, at den oprindelige amplitude, A, den spredte lys Intensitet, jeg s, og det reflekterede lys intensitet, jeg r, tilfredsstille følgende ligning 1
Denne ligning viser, at den større jeg r bliver, bliver den mindre A. Derfor er en reduceret ved at indstille omdrejningspunkt position tæt på grænsefladen. Den tilsyneladende diffusionskonstant D A CAn opnås ved at montere den tid korrelationsfunktionen i tilfælde af monodisperse løsninger:
hvor 
. Her, n er brydningsindekset for opløsningsmidlet (vand, 1,33), θ er det spredte vinkel (180 °), og λ er bølgelængden af lys (514,5 nm). Da vi anvendte tilbagespredning geometri, er værdien af q fast. Imidlertid er dette punkt løses ved anvendelse af forskellige bølgelængder af lys. Bemærk, at enhver form for kontinuerlig bølge laserkilde er tilgængelig til at konstruere DLS mikroskop. Takket være den lille bestrålet rumfang, er sammenhængen faktor 17 estimeret til at være mere end 0,99 og er ubetydelig. For polydisperse løsninger, er fordelingsfunktionen for D A opnås ved den inverse Laplace transformation. Delvis heterodyne theory forudsiger også, at D A er ikke det samme som den faktiske diffusionskonstant D. Disse to diffusionskonstanter opfylder følgende ligning:
Diffusionskonstanten D omdannes til den hydrodynamiske radius R h under anvendelse af Einstein-Stokes ligning 4. Når A = 1, dette forhold bliver D A = D. I dette tilfælde er datakonvertering processen er den samme som for den fælles dynamisk lysspredning. Den røde linje vist i figur 2 (b), svarer til denne sag. Derimod dette forhold bliver D A = 0,5 D på grænsen af A → 0. Derfor er størrelsen anslås at være dobbelt så stor som den faktiske størrelse, når A er lille (praktisk, mindre end 0,2), som vist ved blå linie i figur 2 (b) A er signifikant lille, kan den vandrette akse forskydes, som vist i figur 2 (c). I princippet kan vi konvertere D A til D som helst værdi af A. I praksis er det imidlertid bedre at sætte det oprindelige amplitude mindre end 0,2, da den simple tilnærmelse D A ~ 0,5 D gælder.
De fremtrædende træk ved den dynamisk lysspredning mikroskop teknik blev påvist under anvendelse af en PNIPA opløsning. Konformationen af PNIPA under og over LCST er blevet grundigt undersøgt ved anvendelse små-vinkel neutronspredning 15,18. I modsætning hertil har dynamisk lysspredning ikke udnyttet til analyse af PNIPA over LCST grund af dens turbiditet 19. Dette problem løses ved den dynamisk lysspredning mikroskop, som vist i figurerne 3 (a) og (b). Størrelsen af disse aggregater er flere &# 181; m, hvilket ikke kan opnås ved enten små-vinkel røntgen / neutronspredning eller konventionelle lysspredningsteknikker. Time-løst målinger ved hjælp af dette system giver oplysninger om sammenlægning proces i løbet af temperaturændring.
Ulempen ved dynamisk lysspredning mikroskop er også illustreret i figur 3. For resultatet under LCST, tiden korrelationsfunktionen stærkt påvirket af den meget lille mængde støv til stede (de sorte linjer i figur 3). For eksempel giver det tid korrelationsfunktionen ikke henfalder fuldstændigt, selv med korrelation gange i størrelsesordenen 1,0 s. Dette skyldes, at volumen bestrålet med dette apparat (ca. 1,0 um) er betydeligt mindre end den bestrålede med den sædvanlige dynamisk lysspredning apparat (ca. 100 um). I tilfælde, hvor intensiteten af spredt lys er svag, bliver signalet sløres af støj, som den, der forårsages af small mængder støv i opløsningen. Derfor kan de tre toppe, der er vist i figur 3 (b) ikke har kvantitativ betydning selv om den generelle rækkefølge af størrelsen er meningsfuldt. Bemærk, at sådan en svag spreder kan måles ved en konventionel dynamisk lysspredning apparat.
Vi har vist, at den dynamisk lysspredning mikroskop gør os i stand til at måle både gennemsigtige og uklare prøver med samme opsætning. Da den optiske vejlængde i prøverne er kort, kan denne teknik anvendes på stærke lys-absorberende prøver, såsom kulstof nanorør suspensioner 20. Som følge af sin høje rumlige opløsning, denne teknik kan anvendes på biologiske celler. For deres anvendelse til biologi, kan denne metode også kombineres med andre billeddannende teknikker, såsom fluorescens og Raman billedbehandling. Derfor mener vi, at den dynamisk lysspredning mikroskop er et stærkt værktøj til en lang række forskningsområder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-isopropylacrylamide, 98% | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | I0401 | |
| toluene, 99% | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 201-01876 | |
| petroleum ether, distillation temperature 30 ~ 60 °C | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-22565 | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine, 99% | Sigma | T9281 | |
| ammonium persulfate, 98% | Sigma | 248614 | |
| polystyrene latex suspension, 1 wt% | Duke Scientific Corporation | 3500A | |
| argon | Koike Sanso Kogyo Co., Ltd. | purity > 99.999 vol.% | |
| cavity slide | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | 83-0336 | |
| inverted microscope | Nikon Instech Co., Ltd. | ECLIPSE Ti-U | |
| Thermo Plate | Tokai Hit CO.,Ltd | TP-108R-C | |
| Solid-state laser | Coherent | OBIS 488LX | |
| avalanche photodiode | ALV-GmbH | ALV-High Q.E. Avalanche Photo Diode | |
| correlator | ALV-GmbH | ALV-5000/EPP |
References
- Hiroi, T., Shibayama, M. Dynamic Light Scattering Microscope: Accessing Opaque Samples with High Spatial Resolution. Opt. Express. 21, 20260-20267 (2013).
- Barth, H. G., Flippen, R. B. Particle Size Analysis. Anal. Chem. 67, 257-272 (1995).
- Liu, Y., Wang, Z., Zhang, X. Characterization of supramolecular polymers. Chem. Soc. Rev. 41, 5922-5932 (2012).
- Berne, B. J., Pecora, R. Dynamic Light Scattering with Applications to Chemistry, Biology and Physics. , Dover Publications, Inc. (2000).
- Phillies, G. D. J. Experimental demonstration of ruultiple-scattering suppression in quasielastic-light-scattering spectroscopy by homodyne coincidence techniques. Phys. Rev. A. 24, 1939-1943 (1981).
- Phillies, G. D. J. Suppression of multiple scattering effects in quasielastic light scattering by homodyne crosscorrelation techniques. J. Chem. Phys. 74, 260-262 (1981).
- Ishii, K., Yoshida, R., Iwai, T. Single-scattering spectroscopy for extremely dense colloidal suspensions by use of a low-coherence interferometer. Opt. Lett. 30, 555-557 (2005).
- Xia, H., Ishi, K., Iwai, T. Hydrodynamic Radius Sizing of Nanoparticles in Dense Polydisperse Media by Low-Coherence Dynamic Light Scattering. Jpn. J. Appl. Phys. 44, 6261-6264 (2005).
- Maret, G., Wolf, P. E. Multiple light scattering from disordered media. The effect of brownian motion of scatterers. Z. Phys. B. 65, 409-413 (1987).
- Pine, D. J., Weitz, D. A., Chaikin, P. M., Herbolzheimer, E. Diffusing wave spectroscopy. Phys. Rev. Lett. 60, 1134-1137 (1988).
- Cerbino, R., Trappe, V. Differential Dynamic Microscopy: ProbingWave Vector Dependent Dynamics with a Microscope. Phys. Rev. Lett. 108, 188102 (2012).
- Lu, P. J., et al. Characterizing Concentrated, Multiply Scattering, and Actively Driven Fluorescent Systems with Confocal Differential Dynamic Microscopy. Phys. Rev. Lett. 108, 218103 (2012).
- Provencher, S. W. A constrained regularization method for investing data represented by linear algebraic or integral equations. Comp. Phys. Comm. 27, 213-227 (1982).
- Provencher, S. W., Stepanek, P. Global analysis of dynamic light scattering autocorrelation functions. Part. Part. Syst. Charact. 13, 291 (1996).
- Takata, S., Norisuye, T., Shibayama, M. Small-angle Neutron Scattering Study on Preparation Temperature Dependence of Thermosensitive Gels. Macromolecules. 35, 4779-4784 (2002).
- Pusey, P. N., van Megen, W. Dynamic Light Scattering by Non-Ergodic Media. Physica A. 157, 705-741 (1989).
- Chu, B. Laser Light Scattering. 2nd Ed. , Academic Press. (1991).
- Shibayama, M., Tanaka, T., Han, C. C. Small-Angle Neutron-Scattering Study on Poly(N-Isopropyl Acrylamide) Gels near Their Volume-Phase Transition-Temperature. J. Chem. Phys. 97, 6829-6841 (1992).
- Tanaka, T., Sato, E., Hirokawa, Y., Hirotsu, S., Peetermans, J. Critical Kinetics of Volume Phase Transition of Gels. Phys. Rev. Lett. 55, 2455-2458 (1985).
- Hiroi, T., Ata, S., Shibayama, M. Transitions of Aggregation States for Concentrated Carbon Nanotube Dispersion. J. Phys. Chem. C. 120, 5776-5782 (2016).
