Summary
En protokoll for direkte måling av partikkelstørrelsesfordelingen i konsentrerte løsninger ved hjelp av dynamisk lysspredning mikroskopi er presentert.
Protocol
1. Prøvepreparering
- Rensing av temperatur responsive monomerer
- Oppløs 20 g N -isopropylacrylamide (NIPA) i 100 ml toluen.
- Filtrer oppløsningen under sug for å fjerne støv.
- Bland filtratet med 500 ml petroleter.
- Plasser reaksjonsbeholderen i et is-vann-bad.
- Rør løsningen inntil monomerene er utfelt (typisk 30 min).
- Filtrer oppløsningen under sug for å oppnå de utfelte monomerer.
- Tørk monomerene under redusert trykk (100 Pa) over natten.
- Fremstilling av den temperaturfølsomme polymerløsning
- Degas 20 ml avionisert vann i 1,0 minutter ved anvendelse av en membranpumpe.
- Oppløs 780.8 mg av renset NIPA i 9,5 ml avgasset og avionisert vann.
- Plasser reaksjonsbeholderen i et is-vann-bad.
- Skjerme reaksjon fralys ved å dekke apparaturen med aluminiumsfolie.
- Omrør løsningen forsiktig i 10 min under innføring av en moderat strøm av Ar-gass forsiktig via en pipettespiss som er knyttet til gassflasken med et rør.
- Legg 11,9 mL av N, N, N ', N' tetrametyletylendiamin til løsningen via en mikropipette.
- Omrør løsningen i 1,0 minutter mens innføring Ar gass, som nevnt i trinn 1.2.5.
- Under omrøring av prøven, oppløse 4,0 mg av ammonium persulfat i 0,5 ml avgasset og avionisert vann.
- Bland prøveløsningen (fra trinn 1.2.7) og ammoniumpersulfat oppløsning (fra trinn 1.2.8).
- Omrør løsningen i 30 sekunder mens innføring Ar gass, som nevnt i trinn 1.2.5.
- Dekk løsning med aluminiumsfolie, og oppbevar den i kjøleskap (4 ° C) over natten.
- Utarbeidelse av prøve mounts
- Plassere 60 ul av prøveløsningen (fratrinn 1.2.11) i et hulrom lysbilde.
- Dekk av løsningen med en sirkulær dekkglass. Vær forsiktig med å felle luftbobler.
- Fjern overflødig løsning ved hjelp av en mikropipette og laboratorie våtservietter.
- Tett prøven med lim. La limet tørke i romtemperatur (typisk 6 timer).
- Forbered et annet lysbilde fylt med 0,1 vekt% polystyren latex (100 nm partikkeldiameter) suspensjon ved å følge trinn 1.3.1-1.3.4. Dette bilde er brukt som en standard.
2. Particle Size Measurement med en dynamisk lysspredning Microscope
- Optimalisering av instrumentet
- Plasser polystyren latex suspensjon lysbilde (fra trinn 1.3.5) på scenen av invertert mikroskop. Dekkglasset side skal vende nedover.
- Plasser en bjelke spjeld foran detektoren (et skred fotodiode og en autokorrelator).
- Påfør en laserstråle (solid-state laser, λ = 488 nm, 30 mW, kontinuerligbølge) til prøven gjennom en objektivlinse (10 x). En del av det reflekterte lys går gjennom et speil lansering av mikroskopet og blir observert av et CCD-kamera montert ved sideporten av mikroskopet (figur 1).
- Juster høyden på objektiv for å sette fokus på prøven suspensjon av skiftende høyden av objektiv fra lav til høy stilling. I løpet av denne prosedyren, er det reflekterte bildet fokusert tre ganger: på overflaten av dekkglasset, ved grenseflaten mellom glasset og prøven, og i grenseflaten mellom prøven og hullet sklie glass. Sett fokuspunkt mellom den andre og tredje poeng.
- Svekke den spredte lysintensiteten ved å endre lasereffekt.
- Innføre den spredte lyset inn i detektoren ved å fjerne bjelken spjeld foran detektoren. Denne enheten måler tiden korrelasjonen av lysintensiteten.
- Still et pinhole (φ = 50 mikrometer) between mikroskopet og detektoren for å oppnå den konfokal virkning. Justere plasseringen av hullet for å maksimere lysintensiteten ved detektoren.
- Mål tiden korrelasjonsfunksjon av spredt lys intensitet i 30 sekunder ved å initiere driften av korrelatoren via en datamaskin. Den målte korrelasjonsfunksjon er ofte uttrykt som g (2) (t) - 1, hvor t er den korrelasjonstiden og 4
. Her er I (t) den spredte lysintensiteten på tiden t, og (•••) T er tidsmidling. Desintegrasjonstids vil være ca. 0,1 ms. - Juster navet for å oppnå et bredt område for den innledende amplitude av tiden korrelasjonsfunksjonen (g (2) (t = 0) - 1).
MERK: Den opprinnelige amplitude er sterkt påvirket av mengden av reflektert lys. Ved å flytte fokus slepard grenseflaten mellom dekkglass og prøven, er mengden av reflektert lys øker. For sterke lys-spredningsobjekter, for eksempel polystyren-lateks, kan den innledende amplitude endres fra 0 til 1. Imidlertid er det vanskelig å sette den innledende amplitude i nærheten av en for mer vanlige polymeroppløsninger på grunn av intensiteten av det reflekterte lyset er mye høyere enn at av de spredte lyset. - Påfør den inverse Laplace transformasjon (med begrenset regularisering program CONTIN 13,14) til den oppnådde tiden korrelasjonsfunksjonen til å tilegne seg den størrelsen fordelingsfunksjonen. I de tilfeller hvor den opprinnelige amplitude er innstilt til mindre enn 0,2, blir fordelingsfunksjonen til den hydrodynamiske radius viser en skarp topp rundt 100 nm, noe som er to ganger den faktiske radius (se diskusjonen for detaljer).
- Sample måling
- Satt scenen temperaturen til 25 ° C.
- Plasser et lysbilde forberedt med poly-NIPA (PNIPA) solution (trinn 1.3.4) på scenen av mikroskopet.
- Mål tiden korrelasjonsfunksjonen av den spredte lysintensiteten ved å følge fremgangsmåten 2.1.4-2.1.8. Hvis det første amplitude er større enn 0,2, justere fokuspunkt for å gjøre den innledende amplitude av tiden korrelasjonsfunksjonen mindre enn 0,2, ved å følge trinn 2.1.9. En liten innledende amplitude forenkler analysen.
- Satt scenen temperaturen til 35 ° C og vente til løsningen blir uklar. Den lavere kritiske oppløsningstemperatur (LCST) av PNIPA oppløsning er 32 ° C 15.
- Mål tiden korrelasjonsfunksjonen ved følgende trinn 2.1.4-2.1.8. Hvis mulig, justere plasseringen av navet for å gjøre den innledende amplitude av tiden korrelasjonsfunksjonen mindre enn 0,2. For turbide løsninger sine opprinnelige amplituder tendens til å øke, siden intensiteten av spredt lys øker, mens det av det reflekterte lyset forblir konstant.
- Påfør den inverse Laplace transformatividere til de oppnådde tidskorrelasjonsfunksjoner for å oppnå størrelsesfordelingsfunksjonene. Vær oppmerksom på at den aktuelle størrelsen er halve erholdt verdien i tilfeller hvor innledende amplituden er mindre enn 0,2.
. Her er I (t) den spredte lysintensiteten på tiden t, og (•••) T er tidsmidling. Desintegrasjonstids vil være ca. 0,1 ms. Representative Results
Tidskorrelasjonsfunksjoner av spredt lysintensitet for en polystyren-lateks-suspensjon (partikkel radius: 50 nm) ble målt ved forskjellige brennpunkter, som vist i figur 2 (a). Disse korrelasjonsfunksjoner ble omdannet til fordelingsfunksjoner av den hydrodynamiske radius av den inverse Laplace-transformasjonen (se Figur 2 (b) og (c)). Ved anvendelse av samme fremgangsmåte, ble de tidskorrelasjonsfunksjoner og fordelingsfunksjoner av den hydrodynamiske radius av PNIPA erholdte løsning ved 25 ° C og 35 ° C, respektivt. Figurene 3 (a) og (b) viser tidskorrelasjonsfunksjoner av den spredte lysintensiteten og de tilsvarende størrelsesfordelingsfunksjonene til PNIPA oppløsning under (25 ° C) og over (35 ° C) LCST. Størrelsesfordelingen funksjonene ble oppnådd ved den inverse Laplace-transformasjonen fulgt avkorreksjon av den partielle heterodyne. Den gjennomsnittlige hydrodynamiske radius under LCST er flere titalls nanometer, som er typisk for polymeroppløsninger. I motsetning til dette, den hydrodynamiske radius ovenfor LCST er omtrent 1,0 um. Dette resultatet er i overensstemmelse med det faktum at løsningen er uklar over LCST. De røde og blå linjer i figur 3 representerer størrelsesfordelingen av PNIPA oppløsninger som oppnås umiddelbart etter og 20 minutter etter at løsningen ble uklar, respektivt. Figur 3 (b) viser tydelig vekst av aggregeringen.
Figur 1. Skjematisk av dynamisk lysspredning mikroskop. Pinhole (PH), stråledeler (BS), polarisator (Pol), og skredfotodiode (APD). Klikk her for å seen større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representative resultater for en polystyren latex suspensjon. (A) Tid korrelasjonsfunksjoner av den spredte lysintensiteten for den polystyrenlateks suspensjon. Den nominelle radius er 50 nm, og konsentrasjonen er 0,1 vekt%. To datasett ble oppnådd fra forskjellige spredningspunkter. (B), (c) Tilsvarende størrelsesfordelingsfunksjoner for polystyrenlateks suspensjonen som oppnås ved den inverse Laplace-transformasjonen av (a). Den røde linje tilsvarer tidskorrelasjonsfunksjonen hvis opprinnelige amplitude er omtrent 1,0, og den blå linje tilsvarer det med en første amplitude som er omtrent 0,2. Den horisontale aksen ble beregnet uten (b) og med (c) å vurdere effekten av delvis heterodyning (PHD) når A << ; 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Representative resultater for en PNIPA løsning. (A) Tid korrelasjonsfunksjoner av spredt lysintensitet for PNIPA løsning. (B) Tilsvarende størrelsesfordelingsfunksjoner for PNIPA løsning erholdt ved den inverse Laplace-transformasjonen av (a). Den horisontale aksen ble beregnet å vurdere effekten av delvis heterodyning for hvert datasett. Den svarte linjen representerer de data som oppnås ved 25 ° C. Den røde linje representerer de data som oppnås like etter Løsningen ble turbid (35 ° C). Den blå linjen representerer dataene oppnådd etter en 20 minutters måling av den røde linje./54885/54885fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Den innledende amplitude av tiden korrelasjonsfunksjonen er svært avhengig av navet, som vist i figur 2 (a). Dette motsier tilsynelatende det faktum at løsningen er homogen (med unntak av det tynne lag ved grenseflaten) 8. Denne variasjon i den innledende amplitude skyldes en variasjon i mengden av reflektert lys. Delvis heterodyne teori 16 forutsier at den innledende amplitude, A, den spredte lysintensiteten, jeg s, og den reflekterte lysintensitet, I r, tilfredsstiller den følgende ligning 1
Denne ligning viser at den større I r blir, blir mindre A. Derfor er en redusert ved å sette fokus posisjon nær grensesnittet. Den tilsynelatende diffusjon konstant D A can oppnås ved å montere den tid korrelasjonsfunksjonen i tilfelle av monodisperse løsninger:
hvor 
. Her, n er brytningsindeksen for det oppløsningsmiddel (vann, 1,33), er θ det spredte vinkel (180 °), og λ er bølgelengden for lys (514,5 nm). Siden vi brukt backscattering geometri, er verdien av q fast. Imidlertid er dette punktet løses ved å bruke forskjellige bølgelengder av lys. Legg merke til at enhver form for kontinuerlig-bølge laser kilde er tilgjengelig for å konstruere DLS mikroskop. Takket være den lille bestrålte volum, blir koherensen faktor 17 anslått til å være mer enn 0,99 og er neglisjerbar. For polydisperse løsninger, er fordelingsfunksjonen av D A erholdt ved den inverse Laplace-transformasjonen. Delvis heterodyne theory forutsier også at D A er ikke den samme som den faktiske diffusjonskonstant D. Disse to konstanter diffusjon tilfredsstiller følgende ligning:
Diffusjonskonstanten D omdannes til den hydrodynamiske radius R h ved bruk av Einsteins-Stokes ligning 4. Når A = 1, blir dette forholdet D A = D. I dette tilfelle er datakonverteringsprosessen den samme som for den felles dynamisk lysspredning. Den røde linje vist i figur 2 (b) tilsvarer dette tilfellet. I motsetning til dette, blir dette forholdet D A = 0,5 D på grensen av A → 0. Derfor er størrelsen anslått til å være dobbelt så stor som den faktiske størrelsen når A er liten (i praksis, mindre enn 0,2), som vist ved blå linje på figur 2 (b) A er vesentlig liten, kan den horisontale aksen forskyves, slik som vist i figur 2 (c). I prinsippet kan vi konvertere D A til D for enhver verdi av A. I praksis er det imidlertid bedre å sette den innledende amplitude som er mindre enn 0,2, fordi den enkle tilnærming D A ~ 0,5 D gjelder.
Den fremtredende trekk ved dynamisk lysspredning mikroskop teknikken ble demonstrert ved hjelp av en PNIPA løsning. Den konformasjon av PNIPA under og over LCST har blitt grundig studert ved hjelp av små-vinkel nøytron spredning 15,18. I motsetning til dette, har dynamisk lysspredning ikke blitt benyttet for analyse av PNIPA ovenfor LCST på grunn av dens turbiditet 19. Dette problem løses ved dynamisk lysspredning mikroskop, som vist i figur 3 (a) og (b). Størrelsen på disse aggregater er flere &# 181; m, noe som ikke kan oppnås ved enten liten vinkel røntgen / nøytronspredning eller konvensjonelle lysspredningsteknikker. Tids løst målinger ved hjelp av dette systemet gi informasjon om aggregering prosessen i løpet av temperaturendringer.
Ulempen med dynamisk lysspredning mikroskop er også illustrert i figur 3. For resultatet under LCST er tidskorrelasjonsfunksjonen sterkt preget av svært liten mengde støv tilstede (de svarte linjene i figur 3). For eksempel, ikke tidskorrelasjonsfunksjonen ikke råtner helt, selv med korrelasjonstider i størrelsesorden 1,0 sek. Dette er fordi volumet bestråles med dette apparat (ca. 1,0 mm) er betydelig mindre enn det bestrålt med vanlig dynamisk lysspredning apparat (ca. 100 pm). I de tilfeller hvor intensiteten av spredt lys er svak, blir signalet skjules av støy, slik som den som forårsakes av small mengder støv i løsningen. Derfor kan de tre toppene er vist i figur 3 (b) ikke har kvantitativ betydning, selv om den generelle rekkefølgen av størrelsen er meningsfylt. Legg merke til at en slik svak spredningsobjekt kan måles ved en konvensjonell dynamisk lysspredning apparat.
Vi har vist at dynamisk lysspredning mikroskop gjør oss i stand til å måle både gjennomsiktige og grumsete prøver med samme oppsett. Siden den optiske veilengde i prøvene er kort, kan denne teknikken bli anvendt for sterkt lys-absorberende prøver, slik som karbon nanorør suspensjoner 20. I tillegg, på grunn av høy romlig oppløsning, denne teknikken kan anvendes på biologiske celler. For sin anvendelse til biologi, kan denne metoden også kan kombineres med andre avbildningsteknikker, slik som fluorescens og Raman avbildning. Følgelig tror vi at den dynamisk lysspredning mikroskop er et kraftig verktøy for et omfattende forskningsfelt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-isopropylacrylamide, 98% | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | I0401 | |
| toluene, 99% | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 201-01876 | |
| petroleum ether, distillation temperature 30 ~ 60 °C | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-22565 | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine, 99% | Sigma | T9281 | |
| ammonium persulfate, 98% | Sigma | 248614 | |
| polystyrene latex suspension, 1 wt% | Duke Scientific Corporation | 3500A | |
| argon | Koike Sanso Kogyo Co., Ltd. | purity > 99.999 vol.% | |
| cavity slide | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | 83-0336 | |
| inverted microscope | Nikon Instech Co., Ltd. | ECLIPSE Ti-U | |
| Thermo Plate | Tokai Hit CO.,Ltd | TP-108R-C | |
| Solid-state laser | Coherent | OBIS 488LX | |
| avalanche photodiode | ALV-GmbH | ALV-High Q.E. Avalanche Photo Diode | |
| correlator | ALV-GmbH | ALV-5000/EPP |
References
- Hiroi, T., Shibayama, M. Dynamic Light Scattering Microscope: Accessing Opaque Samples with High Spatial Resolution. Opt. Express. 21, 20260-20267 (2013).
- Barth, H. G., Flippen, R. B. Particle Size Analysis. Anal. Chem. 67, 257-272 (1995).
- Liu, Y., Wang, Z., Zhang, X. Characterization of supramolecular polymers. Chem. Soc. Rev. 41, 5922-5932 (2012).
- Berne, B. J., Pecora, R. Dynamic Light Scattering with Applications to Chemistry, Biology and Physics. , Dover Publications, Inc. (2000).
- Phillies, G. D. J. Experimental demonstration of ruultiple-scattering suppression in quasielastic-light-scattering spectroscopy by homodyne coincidence techniques. Phys. Rev. A. 24, 1939-1943 (1981).
- Phillies, G. D. J. Suppression of multiple scattering effects in quasielastic light scattering by homodyne crosscorrelation techniques. J. Chem. Phys. 74, 260-262 (1981).
- Ishii, K., Yoshida, R., Iwai, T. Single-scattering spectroscopy for extremely dense colloidal suspensions by use of a low-coherence interferometer. Opt. Lett. 30, 555-557 (2005).
- Xia, H., Ishi, K., Iwai, T. Hydrodynamic Radius Sizing of Nanoparticles in Dense Polydisperse Media by Low-Coherence Dynamic Light Scattering. Jpn. J. Appl. Phys. 44, 6261-6264 (2005).
- Maret, G., Wolf, P. E. Multiple light scattering from disordered media. The effect of brownian motion of scatterers. Z. Phys. B. 65, 409-413 (1987).
- Pine, D. J., Weitz, D. A., Chaikin, P. M., Herbolzheimer, E. Diffusing wave spectroscopy. Phys. Rev. Lett. 60, 1134-1137 (1988).
- Cerbino, R., Trappe, V. Differential Dynamic Microscopy: ProbingWave Vector Dependent Dynamics with a Microscope. Phys. Rev. Lett. 108, 188102 (2012).
- Lu, P. J., et al. Characterizing Concentrated, Multiply Scattering, and Actively Driven Fluorescent Systems with Confocal Differential Dynamic Microscopy. Phys. Rev. Lett. 108, 218103 (2012).
- Provencher, S. W. A constrained regularization method for investing data represented by linear algebraic or integral equations. Comp. Phys. Comm. 27, 213-227 (1982).
- Provencher, S. W., Stepanek, P. Global analysis of dynamic light scattering autocorrelation functions. Part. Part. Syst. Charact. 13, 291 (1996).
- Takata, S., Norisuye, T., Shibayama, M. Small-angle Neutron Scattering Study on Preparation Temperature Dependence of Thermosensitive Gels. Macromolecules. 35, 4779-4784 (2002).
- Pusey, P. N., van Megen, W. Dynamic Light Scattering by Non-Ergodic Media. Physica A. 157, 705-741 (1989).
- Chu, B. Laser Light Scattering. 2nd Ed. , Academic Press. (1991).
- Shibayama, M., Tanaka, T., Han, C. C. Small-Angle Neutron-Scattering Study on Poly(N-Isopropyl Acrylamide) Gels near Their Volume-Phase Transition-Temperature. J. Chem. Phys. 97, 6829-6841 (1992).
- Tanaka, T., Sato, E., Hirokawa, Y., Hirotsu, S., Peetermans, J. Critical Kinetics of Volume Phase Transition of Gels. Phys. Rev. Lett. 55, 2455-2458 (1985).
- Hiroi, T., Ata, S., Shibayama, M. Transitions of Aggregation States for Concentrated Carbon Nanotube Dispersion. J. Phys. Chem. C. 120, 5776-5782 (2016).
