Summary
Ett protokoll för direkt mätning av partikelstorleksfördelning i koncentrerade lösningar med dynamisk ljusspridning mikroskopi presenteras.
Protocol
1. Provframställning
- Rening av temperaturkänsliga monomerer
- Lös upp 20 g N -isopropylacrylamide (NIPA) i 100 ml toluen.
- Filtrera lösningen under sug för att ta bort damm.
- Blanda filtratet med 500 ml petroleumeter.
- Placera reaktionskärlet i ett is-vattenbad.
- Rör om lösningen tills monomererna utfälles (typiskt 30 min).
- Filtrera lösningen under sug för att erhålla de utfällda monomerer.
- Torka monomererna under reducerat tryck (100 Pa) över natten.
- Framställningen av den temperaturkänsliga polymerlösningen
- Degas 20 ml avjoniserat vatten under 1,0 min med användning av en membranpump.
- Upplös 780.8 mg av det renade NIPA i 9,5 ml avgasad och avjoniserat vatten.
- Placera reaktionskärlet i ett is-vattenbad.
- Skydda reaktionen frånljus genom att täcka anordningen med aluminiumfolie.
- Rör om lösningen försiktigt under 10 min samtidigt som ett måttligt flöde av Ar-gas försiktigt via en pipettspets fäst gascylindern med ett rör.
- Lägga 11,9 mikroliter av N, N, N ', N' tetrametyletylendiamin till lösningen via en mikropipett.
- Rör om lösningen under 1,0 minuter medan införa Ar gas, som nämns i steg 1.2.5.
- Under omröring av provet, lös upp 4,0 mg ammoniumpersulfat i 0,5 ml avgasad och avjoniserat vatten.
- Blanda provet lösningen (från steg 1.2.7) och ammoniumpersulfat-lösning (från steg 1.2.8).
- Rör om lösningen under 30 sekunder samtidigt införa Ar gas, som nämns i steg 1.2.5.
- Täck lösningen med aluminiumfolie och förvara den i kylskåp (4 ° C) över natten.
- Beredning av provmonteringar
- Placera 60 mikroliter av provlösningen (frånsteg 1.2.11) i en hålighet bild.
- Täck av lösningen med ett cirkulärt täckglas. Var noga med att inte fälla luftbubblor.
- Ta bort överflödig lösning med hjälp av en mikropipett och laboratorie våtservetter.
- Täta provet med lim. Låt limmet torka vid rumstemperatur (typiskt 6 h).
- Förbered en annan bild fylld med 0,1 vikt% polystyrenlatex (100 nm partikeldiameter) suspension genom att följa stegen 1.3.1-1.3.4. Detta objektglas används som en standard.
2. Partikelstorleksmätning med en Dynamic Light Scattering mikroskop
- Optimering av instrumentet
- Placera polystyrenlatex upphängnings slide (från steg 1.3.5) på scenen i inverterat mikroskop. Täckglaset sidan ska vara vänd nedåt.
- Placera en balk spjäll i framför detektorn (en lavinfotodiod och en autokorrelator).
- Applicera en laserstråle (solid-state laser, λ = 488 nm, 30 mW, kontinuerligvåg) till provet genom en objektiv (10 ×). En del av det reflekterade ljuset går genom en lansering spegel av mikroskopet och observeras av en CCD-kamera monterad vid sidoingången av mikroskop (Figur 1).
- Justera höjden på objektivet för att ställa in fokus på prov suspensionen genom att flytta höjden av objektiv från lägsta till högsta läge. Under detta förfarande är den reflekterade bilden fokuseras tre gånger: vid ytan av täckglaset, vid gränsytan mellan täckglaset och provet, och vid gränsytan mellan provet och hålet-objektglas. Ställa in brännpunkten mellan den andra och tredje punkter.
- Dämpa spridda ljusintensiteten genom att ändra lasereffekt.
- Införa det spridda ljuset in i detektorn genom att ta bort balken spjället framför detektorn. Denna enhet mäter tiden korrelation av ljusintensiteten.
- Ställ ett litet hål (φ = 50 pm) between mikroskopet och detektorn för att uppnå den konfokala verkan. Justera positionen av den nålhål för att maximera ljusintensiteten vid detektorn.
- Mät tiden korrelationsfunktion av spridda ljusintensiteten under 30 s genom att initiera driften av korrelatorn via en dator. Den uppmätta korrelationsfunktionen uttrycks ofta som g (2) (t) - 1 där t är korrelationstiden 4 och
. Här, är I (t) det spridda ljusintensiteten vid tiden t och (•••) T är tidsmedelvärdesbildning. Avklingningstiden kommer att vara cirka 0,1 ms. - Ställa in brännpunkten för att erhålla ett brett område för den initiala amplituden för tidskorrelationsfunktion (g (2) (t = 0) - 1).
OBS: Den initiala amplitud påverkas starkt av mängden reflekterat ljus. Genom att flytta fokus bogseraard gränssnittet mellan täckglaset och provet, mängden reflekterat ljus ökar. För starka ljusspridare, såsom polystyrenlatex, kan den initiala amplituden ändras från 0 till 1. Det är emellertid svårt att inställa den initiala amplitud nära ett för mer vanliga polymerlösningar eftersom intensiteten hos det reflekterade ljuset är mycket högre än den hos det spridda ljuset. - Applicera invers Laplace transformation (med hjälp av den begränsade legaliseringsprogram CONTIN 13,14) till den erhållna tidskorrelationsfunktionen att förvärva funktion storleksfördelning. I de fall där den initiala amplituden är inställd på mindre än 0,2, kommer fördelningen funktion av den hydrodynamiska radien visar en skarp topp runt 100 nm, som är två gånger den faktiska radien (se diskussionen för detaljer).
- provmätning
- Ställ scenen temperaturen till 25 ° C.
- Placera en bild framställd med poly-NIPA (PNIPA) solutjon (steg 1.3.4) på scenen av mikroskopet.
- Mät tiden korrelationsfunktionen för den spridda ljusintensiteten genom att följa steg 2.1.4-2.1.8. Om den initiala amplituden är större än 0,2, justera brännpunkten för att göra den initiala amplituden av tiden korrelationsfunktion mindre än 0,2 genom att följa steg 2.1.9. En liten initial amplitud förenklar analysen.
- Uppsättningen som arrangera temperaturen till 35 ° C och vänta tills lösningen blir grumlig. Den lägre kritiska lösningstemperaturen (LCST) av PNIPA lösning är 32 ° C 15.
- Mät tiden korrelationsfunktionen genom att följa steg 2.1.4-2.1.8. Om möjligt, justera läget för brännpunkten för att göra den initiala amplituden av tiden korrelationsfunktion mindre än 0,2. För grumliga lösningar, deras ursprungliga amplituder tenderar att öka, eftersom intensiteten av det spridda ljuset ökar medan den hos det reflekterade ljuset förblir konstant.
- Applicera den inversa Laplace transformatipå de erhållna tidskorrelationsfunktioner för att erhålla storleksfördelningen funktioner. Notera att den faktiska storleken är halv det erhållna värdet i de fall där den initiala amplituden är mindre än 0,2.
. Här, är I (t) det spridda ljusintensiteten vid tiden t och (•••) T är tidsmedelvärdesbildning. Avklingningstiden kommer att vara cirka 0,1 ms. Representative Results
Tidskorrelationsfunktionerna för spridda ljusintensiteten för en polystyren-latexsuspension (partikel radie: 50 nm) mättes vid olika brännpunkter, såsom visas i figur 2 (a). Dessa korrelationsfunktioner konverterades till de fördelningsfunktioner för den hydrodynamiska radien av den inversa Laplace-transformation (se Figur 2 (b) och (c)). Med användning av samma förfarande framställdes de tidskorrelationsfunktioner och fördelningsfunktioner för den hydrodynamiska radien för den PNIPA lösning erhölls vid 25 ° C och 35 ° C, respektive. Figurerna 3 (a) och (b) visar de tidskorrelationsfunktionerna för den spridda ljusintensiteten och de motsvarande storleksfördelningsfunktioner PNIPA lösning nedan (25 ° C) eller högre (35 ° C) LCST. De storleksfördelningsfunktioner erhölls genom den inversa Laplace transformation följt avkorrigering av den partiella heterodyn. Den genomsnittliga hydrodynamiska radien under LCST är flera tiotals nanometer, vilket är typiskt för polymerlösningar. I motsats, den hydrodynamiska radien ovanför LCST är ca 1,0 ^ m. Detta resultat är i linje med det faktum att lösningen är grumlig över LCST. De röda och blå linjer i figur 3 representerar storleksfördelningen av PNIPA erhållna lösningarna omedelbart efter och 20 minuter efter att lösningen blev grumlig, respektive. Figur 3 (b) visar tydligt tillväxten av aggregering.
Figur 1. Schema för dynamisk ljusspridning mikroskop. Pinhole (PH), stråldelare (BS), polarisationsfilter (Pol) och lavinfotodiod (APD). Klicka här för att seen större version av denna siffra.
Figur 2. Representativa resultat för en polystyrenlatex suspension. (A) Tid korrelationsfunktionerna för den spridda ljusintensiteten för polystyrenlatex suspensionen. Den nominella radien är 50 nm och koncentrationen är 0,1 vikt%. Två datamängder erhölls från olika spridningspunkter. (B), (c) Motsvarande storleksfördelningsfunktioner för polystyrenlatex suspensionen erhållen genom den inversa Laplace transformation av (a). Den röda linjen motsvarar tidskorrelationsfunktion vars initiala amplitud är ungefär 1,0, och den blå linjen motsvarar den med en initial amplitud som är ungefär 0,2. Den horisontella axeln beräknades utan (b) och (c) med tanke på effekten av partiell överlagring (PHD) när A << ; 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representativa resultat för en PNIPA lösning. (A) Tid korrelationsfunktionerna för spridda ljusintensiteten för PNIPA lösning. (B) Motsvarande storleksfördelningsfunktioner för PNIPA lösning som erhålls genom den inversa Laplace transformation av (a). Den horisontella axeln beräknades med tanke på effekten av partiell överlagring för varje datamängd. Den svarta linjen representerar de data som erhölls vid 25 ° C. Den röda linjen representerar de data som erhölls strax efter det att lösningen blev grumlig (35 ° C). Den blå linjen representerar de data som erhållits efter en 20-min mätning av den röda linjen./54885/54885fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Den initiala amplituden för tidskorrelationsfunktion beror i hög grad på den brännpunkt, såsom visas i fig 2 (a). Detta motsäger till synes det faktum att lösningen är homogen (med undantag för det tunna skiktet vid gränsytan) 8. Denna variation i den initiala amplituden skrivs en variation i mängden av reflekterat ljus. Partiell heterodyn teori 16 förutsäger att den initiala amplitud, A, det spridda ljuset Intensitet, I s, och det reflekterade ljusets intensitet, Ir, uppfylla följande ekvation 1
Denna ekvation visar att den större Ir blir, blir den mindre A. Därför är ett minskas genom att ställa in fokalpositionen nära gränsytan. Den skenbara diffusion konstant D A can erhållas genom att anpassa tidskorrelationsfunktion i fallet med monodispersa lösningar:
var 
. Här, n är brytningsindex för lösningsmedlet (vatten, 1,33), är θ det spridda vinkeln (180 °), och λ är våglängden för ljus (514,5 nm). Eftersom vi tillämpade bakåtspridning geometri, är värdet på q fast. Emellertid är denna punkt löses genom användning av olika ljusvåglängder. Observera att någon form av kontinuerlig våg laserkälla finns att konstruera DLS mikroskop. Tack vare den lilla bestrålad volym, samstämmighet faktor 17 uppskattas till mer än 0,99 och är försumbar. För polydispersa lösningar, är fördelningsfunktionen för D A erhålls genom den inversa Laplace transformation. Partiella heterodyn theory förutspår också att D A inte är densamma som den faktiska diffusionskonstanten D. Dessa två diffusionskonstanter uppfyller följande ekvation:
Diffusionskonstanten D omvandlas till den hydrodynamiska radien R h med hjälp av Einstein-Stokes ekvation 4. När A = 1, blir detta förhållande D A = D. I detta fall är dataomvandlingsprocessen densamma som för den gemensamma dynamisk ljusspridning. Den röda linjen som visas i figur 2 (b) motsvarar detta fall. I motsats härtill blir detta förhållande D A = 0,5 D på gränsen för A → 0. Därför är storleken uppskattas vara dubbelt så stor som den verkliga storleken när A är liten (i praktiken mindre än 0,2), såsom visas med den blå linje i figur 2 (b) A är signifikant liten, kan den horisontella axeln förskjutas, såsom visas i fig 2 (c). I princip kan vi omvandla D A in D för godtyckligt värde på A. I praktiken är det dock bättre att ställa den initiala amplituden är mindre än 0,2, eftersom enkel approximation D A ~ 0,5 D håller streck.
De framträdande dragen i dynamisk ljusspridning mikroskop teknik visades med hjälp av en PNIPA lösning. Konformation PNIPA under och över LCST har studerats med hjälp av små vinklar neutronspridning 15,18. Däremot har dynamisk ljusspridning inte utnyttjats för analys av PNIPA ovanför LCST på grund av dess turbiditet 19. Detta problem löses genom dynamisk ljusspridning mikroskop, såsom visas i figurerna 3 (a) och (b). Storleken på dessa aggregat är flera &# 181; m, som inte kan erhållas genom antingen liten vinkel X-ray / neutronspridning eller konventionella ljusspridningstekniker. Tidsupplösta mätningar med användning av detta system ger information om aggregering processen under temperaturändring.
Nackdelen med den dynamiska ljusspridningsmikroskop illustreras också i figur 3. För resultatet under LCST är tidskorrelationsfunktion påverkas starkt av den mycket lilla mängden av damm som finns (de svarta linjerna i fig 3). Till exempel ser tidskorrelationsfunktionen inte förfalla helt, även med korrelationstider i storleksordningen 1,0 s. Detta beror på att volymen bestrålas med denna apparat (approximativt 1,0 ^ m) är betydligt mindre än den bestrålade med den vanliga dynamisk ljusspridning apparat (cirka 100 ^ m). I de fall där intensiteten av spritt ljus är svag, signalen skymd av bruset, såsom det som orsakas av sköpcentret mängder damm i lösningen. Därför kan de tre topparna som visas i Figur 3 (b) inte har kvantitativ betydelse även om den allmänna ordningen i storlek är meningsfull. Notera att en sådan svag spridare kan mätas genom en konventionell dynamisk ljusspridning apparat.
Vi har visat att dynamisk ljusspridning mikroskop kan vi mäta både öppna och grumliga prover med samma inställningar. Eftersom den optiska väglängden i proven är kort, kan denna teknik användas till starka ljusabsorberande prover, såsom Nanorör suspensioner 20. Dessutom, på grund av dess höga rumsliga upplösning, denna teknik kan tillämpas på biologiska celler. För dess tillämpning till biologi, kan denna metod också kombineras med andra avbildningstekniker, såsom fluorescens och Raman avbildning. Således tror vi att den dynamiska ljusspridnings mikroskop är ett kraftfullt verktyg för ett brett spektrum av forskningsområden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-isopropylacrylamide, 98% | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | I0401 | |
| toluene, 99% | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 201-01876 | |
| petroleum ether, distillation temperature 30 ~ 60 °C | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-22565 | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine, 99% | Sigma | T9281 | |
| ammonium persulfate, 98% | Sigma | 248614 | |
| polystyrene latex suspension, 1 wt% | Duke Scientific Corporation | 3500A | |
| argon | Koike Sanso Kogyo Co., Ltd. | purity > 99.999 vol.% | |
| cavity slide | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | 83-0336 | |
| inverted microscope | Nikon Instech Co., Ltd. | ECLIPSE Ti-U | |
| Thermo Plate | Tokai Hit CO.,Ltd | TP-108R-C | |
| Solid-state laser | Coherent | OBIS 488LX | |
| avalanche photodiode | ALV-GmbH | ALV-High Q.E. Avalanche Photo Diode | |
| correlator | ALV-GmbH | ALV-5000/EPP |
References
- Hiroi, T., Shibayama, M. Dynamic Light Scattering Microscope: Accessing Opaque Samples with High Spatial Resolution. Opt. Express. 21, 20260-20267 (2013).
- Barth, H. G., Flippen, R. B.
- Liu, Y., Wang, Z., Zhang, X.
- Berne, B. J., Pecora, R. Dynamic Light Scattering with Applications to Chemistry, Biology and Physics. , Dover Publications, Inc. (2000).
- Phillies, G. D. J. Experimental demonstration of ruultiple-scattering suppression in quasielastic-light-scattering spectroscopy by homodyne coincidence techniques. Phys. Rev. A. 24, 1939-1943 (1981).
- Phillies, G. D. J. Suppression of multiple scattering effects in quasielastic light scattering by homodyne crosscorrelation techniques. J. Chem. Phys. 74, 260-262 (1981).
- Ishii, K., Yoshida, R., Iwai, T. Single-scattering spectroscopy for extremely dense colloidal suspensions by use of a low-coherence interferometer. Opt. Lett. 30, 555-557 (2005).
- Xia, H., Ishi, K., Iwai, T. Hydrodynamic Radius Sizing of Nanoparticles in Dense Polydisperse Media by Low-Coherence Dynamic Light Scattering. Jpn. J. Appl. Phys. 44, 6261-6264 (2005).
- Maret, G., Wolf, P. E. Multiple light scattering from disordered media. The effect of brownian motion of scatterers. Z. Phys. B. 65, 409-413 (1987).
- Pine, D. J., Weitz, D. A., Chaikin, P. M., Herbolzheimer, E.
- Cerbino, R., Trappe, V. Differential Dynamic Microscopy: ProbingWave Vector Dependent Dynamics with a Microscope. Phys. Rev. Lett. 108, 188102 (2012).
- Lu, P. J., et al. Characterizing Concentrated, Multiply Scattering, and Actively Driven Fluorescent Systems with Confocal Differential Dynamic Microscopy. Phys. Rev. Lett. 108, 218103 (2012).
- Provencher, S. W. A constrained regularization method for investing data represented by linear algebraic or integral equations. Comp. Phys. Comm. 27, 213-227 (1982).
- Provencher, S. W., Stepanek, P. Global analysis of dynamic light scattering autocorrelation functions. Part. Part. Syst. Charact. 13, 291 (1996).
- Takata, S., Norisuye, T., Shibayama, M. Small-angle Neutron Scattering Study on Preparation Temperature Dependence of Thermosensitive Gels. Macromolecules. 35, 4779-4784 (2002).
- Pusey, P. N., van Megen, W. Dynamic Light Scattering by Non-Ergodic Media. Physica A. 157, 705-741 (1989).
- Chu, B. Laser Light Scattering. 2nd Ed. , Academic Press. (1991).
- Shibayama, M., Tanaka, T., Han, C. C. Small-Angle Neutron-Scattering Study on Poly(N-Isopropyl Acrylamide) Gels near Their Volume-Phase Transition-Temperature. J. Chem. Phys. 97, 6829-6841 (1992).
- Tanaka, T., Sato, E., Hirokawa, Y., Hirotsu, S., Peetermans, J. Critical Kinetics of Volume Phase Transition of Gels. Phys. Rev. Lett. 55, 2455-2458 (1985).
- Hiroi, T., Ata, S., Shibayama, M. Transitions of Aggregation States for Concentrated Carbon Nanotube Dispersion. J. Phys. Chem. C. 120, 5776-5782 (2016).
