Introduction
קביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן תרם תרומות היסוד לכל תחום הביולוגיה המודרנית; מתן נוף אטומי של מקרומולקולות תומכי חיים וכיצד הם פועלים אחד עם השני במגוון קשרים; מה שמאפשר לנו להבין את המנגנונים שגורמים הזדמנויות מחלה ומתן לתכנן תרופות לטיפול במחלות באופן רציונלי. קריסטלוגרפיה כבר זמן רב בטכניקה הניסויית הדומיננטית לקביעת מבנה macromolecular, וכיום מהווה 89.3% של מסד הנתונים המבניים (www.rcsb.org). טכניקה זו יש יתרונות רבים, לרבות הסכנה האפשרית ברזולוציה גבוהה מאוד, את היכולת לדמיין מקרומולקולות עם מגוון רחב של גדלים, איסוף נתונים קל יחסית, ואת ההזדמנות כדי להמחיש כיצד מקרומולקולה אינטראקציה עם ממס וכן הליגנדים.
למרות שיפורים טכנולוגיים רבים בביטוי חלבון רקומביננטי 1,2, PURification 3, וביולוגיה מולקולרית המשמשת לייצור מערכות אלה 4, המכשול הגדול ביותר בתהליך crystallographic נשאר היכולת לצמוח גבישים באיכות עקיפה. זה היה נכון במיוחד עבור חלבונים אשר מכילים תחומים מפותל-סליל גדול. הערכה הוא כי ככל 5% מכלל חומצות אמינו נמצאים בתוך מפותל, סליליים 5,6, כך שתכונה זו יישאר 7 מבנית מאוד נפוצה, עדיין חלבונים אלה הם בדרך כלל יותר קשים לטהר להתגבש מאשר חלבונים כדוריים 8-10 . זה מורכב עוד יותר בשל העובדה כי תחומים סליל מפותל נמצאים לעתים קרובות בהקשר של חלבון גדול יותר, ולכן כראוי מנבאים את גבולות תחומים אלה היא קריטית כדי למנוע הכללת רצף מובנה או גמיש כי הוא לעתים קרובות מזיק לתהליך גיבושו.
כאן אנו מציגים מסגרת מושגית שילוב חישובית מבוסס אינטרנט מנתח עם experimentaנתוני l מהספסל, כדי לסייע למשתמשי מדריך דרך בשלבים הראשונים של תהליך crystallographic כוללים: כיצד לבחור מקטעי חלבון (ים) ללימודים מבניים, וכיצד להכין ולאפיין דגימות חלבון לפני ניסיונות התגבשות. המחקר הנוכחי על שני חלבונים המכילים תחומים מפותל-סליל גדול, Shroom (SHRM) ו Rho-kinase (רוק). חלבונים אלה נבחרו שניהם מכילים תחומי סליל מפותל וידועים לגבש 11-16 מורכבים רלוונטיים מבחינה ביולוגית. Shroom ו Rho-kinase (רוק) הם חזו מכילים ~ 200 ו 680 שאריות של סליל מפותל בהתאמה, רבי חלקים אשר מתאפיינים מבני 17-20. השיטה המתוארת כאן מספקת זרימת עבודה יעילה לזהות שברים במהירות של חלבון המכיל סליל מפותל כי יהיו מוכנים לשתף פעולה עבור התגבשות, אולם, הטכניקות המתוארות ניתן להתאים בקלות עבור רוב החלבון או חלבון מתחמים או שונות לשלב approa תפוקה גבוההצ 'ס כזמין. לבסוף, שיטות אלה הן זולות בדרך כלל יכולות להתבצע על ידי משתמש כמעט בכל רמות הניסיון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: תרשים של המסגרת המושגית או העבודה מתוארת באיור 1 לעיון. הפרוטוקול יכול להיות בחלוקה לארבעה שלבים: תחזיות מבוססות חישובית או רצף, ביטוי חלבון וטיהור, אפיון ביוכימי, וגיבוש. הדוגמות הראו לנתח תחומי Shroom SD2 ו / או מתחמי Shroom-רוק, אבל יכולות להיות מנוצלות עם חלבון כלשהו.
1. השתמש הוקם כלים מבוססי אינטרנט ליצירת חיזויים חישובית של גבולות דומיין סלילי-סליל
- אסוף למערך אבולוציונית מגוון של הרצף homologs.
- עבור אל www.uniprot.org באמצעות הקלדת Shroom בשורת החיפוש העליון.
- רצפים בחרו להוריד על ידי סימון התיבה לצד מספר הצטרפותן. רצפים עם כוכב עולים רצפים נסקרו על ידי Uniprot והם בדרך כלל אמינים יותר. תשמור על מנת להבטיח שכל הרצפים הם מלאים ומדויקים.
- שמור את הים שנבחרequences ידי לחיצה על לחצן הורד.
- יישר את אוסף של רצפים Shroom באמצעות Clustal-אומגה 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). לחצו על כפתור "עיון" כדי לבחור את הקובץ עם רצפים Shroom ולאחר מכן דחף שלח.
- לאחר היישור הושלם, לחץ על כפתור "הורד יישור קובץ".
- פתח את יישור הרצף הנפוץ שנוצר 1.1.5 באמצעות Jalview (קובץ | קלט מערך | מקובץ). בתוך חלון היישור החדש, הצבע על ידי זהות (צבע | אחוז הזהות).
- חישוב תחזיות של מבנה משני, תחזיות של רצף גמיש או לא תקין וחזה אזורים-סליל מפותל בתוך החלבון (ים) של עניין.
- עבור אל http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, לחשב תחזיות המתקפלים-Coil. העתק והדבק את הרצף לתוך תיבת הרצף ולחץ על שלח.
הערה: ניתוח זה יכול לקחת כמה שעות כדי complete. מאז רצפים Shroom הם גדולים למדי, רצפים ייתכן שיהיה צורך לפצל לגושים של פחות מ -1,000 חומצות אמינו כדי להתאים בתוך מגבלת הגודל של האינטרנט. כשמנתחים Shrm2, מומלץ כי בטרמינל C-1000 חומצות אמינו משמשות סעיף זה כולל את תחום SHRM SD2 אשר ידוע מכילים אזורים סליל מפותל. כאשר חוזר ניתוח זה עם חלבונים אחרים, מומלץ להשתמש רצפי חלבונים באורך מלא במידת האפשר. אם כי היא לא אופציה, השתמש שהבר הגדול ככל האפשר או לנתח את הרצף מבוסס על נתונים ביוכימיים או תפקודיים ידועים. - עבור אל http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, לחשב תחזיות המתקפלים-Coil. העתק והדבק את הרצף לתוך תיבת הרצף ולחץ על שלח.
- עבור אל http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, לחשב תחזיות המתקפלים-Coil. העתק והדבק את הרצף לתוך תיבת הרצף ולחץ על שלח.
- מערבבים את התוצאות של צעדים 1.1 ל 1.2.2 לתוך ביאור מקיף יחיד של רצף Shroom.
הערה: אנו מעודדים מאוד כדי לכלול גם את וכל מה שאני הרלוונטייםnformation כי ניתן ללמוד מן הספרות או ממקורות אחרים על תפקוד החלבון או טיהור בשלב זה. - באמצעות רצף מבואר מקיף זה, לחזות גבולות תחום (או סדרה של גבולות האפשר) של החלבון, מנסה למקסם שימור וחזה תכונות מבניות תוך מזעור כמות רצף סדר או גמיש. אם ידוע, החלבון וכתוצאה מכך צריך לשמור על תכונות פעילות של עניין.
2. אקספרס וחלבונים לטהר עם גבולות הדומיין שזוהו בסעיף 1
הערה: מטרת סעיף זה היא להשתמש שורה של מבחנים מהירים לכימות בקלות להקרין גבולות תחום היפותטי שנוצרו בסעיף 1.
- שימוש בטכניקות ביולוגיה מולקולריות רגילות, ליצור פלסמיד ביטוי עם רצף הקידוד הרצוי מסגרת בתוך פלסמיד 10 -mRuby2-XH2 שלו (ראה איור 3 עבור מפת הווקטורnd לפרטים נוספים).
- רמות הביטוי מבחן עבור כל פלסמיד ביטוי באמצעות BL21 (DE3) E. coli או זן ביטוי מתאים אחר במדיה autoinduction 1 בטמפרטורת החדר למשך 18-24 שעות.
- Transform פלסמידים ביטוי וכן פקד פלסמיד ריק לתוך BL21 (DE3) בעקבות ההוראות מצורפות התאים או באמצעות פרוטוקול טרנספורמציה חזק, כמו זה כאן (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial -transformation /).
- מהצלחת טרי טרנספורמציה, פיק מושבה אחת ולגדול תרבות המתנע 5 מ"ל ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ב Lysogeny מרק (LB) בתקשורת עם 34 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin.
- למחרת, גלול התרבות לשטוף את הכדור עם LB. הטרי
- מוסיפים את תרבות המתנע 50 מ"ל של התקשורת autoinduction עם 34 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin. אפשר התרבות לגדול ל רוויה או בטמפרטורת חדר או 37 מעלות צלזיוס. בדרך כלל, לגדול במשך ~ 18-24 שעות.
- תא גלולים ולהקפיא את כדורי תא וכתוצאה מכך ב -80 ° C ללא הגבלת זמן לפני טיהור.
- השוואת תמציות תא כולו מכל זן ביטוי לבין בקרת הווקטור הריקה על ידי SDS-PAGE כדי לקבוע את המתח בצורה המועילה ביותר, מייצר את חלבון ההיתוך הרצוי. עבור שלו 10 -mRuby2-Shroom חלבונים היתוך SD2, לרוץ 10% ג'ל SDS-PAGE ב 180 V עבור ~ 50 דקות או עד בחזית לצבוע מגיע לתחתית הג'ל 22.
- ג'ל הכתם עם Coomassie כחול לדמיין חלבונים תאיים הכולל בתוך כל זן 23.
- בצע צעד כרומטוגרפיה זיקה ראשוני על כל זן שבטא בהצלחת חלבון mRuby2-פיוז'ן. בדרך כלל, לבצע טיהור שלבים 2.3.2-2.3.7 בטמפרטורת החדר, אלא אם כן חלבון יהנה בנסיבות משתנות כגון טיהור על 4 מעלות צלזיוס.
- כדורי תא הפשרה משלבים 2.2.5.
- Resuspend כל גלולה תא ב 1.5 מ"ל של חיץ תמוגה (גליצרול 10%, 500 מ"מ NaCl, 40imidazole מ"מ, 20 מ"מ טריס pH8.0, 1 מ"מ בטא mercaptoethanol). מוסף למאגר תמוגה עם מעכבי פרוטאז על פי הצורך.
- הוסף 30 μl של 10 מ"ג / מ"ל ליזוזים ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. Sonicate ביצוע ההוראות עבור המכשיר בשימוש.
- העבר לתוך צינור 1.5 מ"ל ו צנטריפוגות בצנטריפוגה בראש הטבלה במשך 30 דקות ב 14,000 XG כדי גלולה חומר מסיס או תאים unlysed. שמור הן supernatant ו גלולה לניתוח שלאחר מכן באמצעות SDS-PAGE.
- בצע טיהור זיקת ניקל, דוגרי השבר המסיס עם 100 μl של חרוזי Ni-נת"ע. דגירה חרוזה עם lysate המסיס למשך 5-10 דקות, היפוך מספר פעמים כדי לערבב חרוזים.
- צנטריפוגה ב 800 XG במשך 30 שניות בצנטריפוגה השולחן כדי גלולה את החרוזים. בצע את זה על ידי שטיפה הגלולה 3-5 פעמים עם חיץ תמוגה לנקות מזהמים שאינם ספציפיים.
- Elute רובי היתוך חלבון מן החרוזים עם חיץ תמוגה בתוספת 1imidazole M.
- השתמש SDS-PAGE כדי להשוות את ההתנהגות של חלבונים-mRuby2-Shroom שלו בתחום הטיהור "מהיר ומלוכלך" לעיל.
3. מדגם חלבון לאפיין לזהות את אלה עם מאפייני יתרון
- להשתמש במערך ספקטרופוטומטר ב 280 ננומטר למדוד את הריכוז של חלבון היתוך רובי, ולאחר מכן להעריך את ההומוגניות של המדגם על ידי טעינת 1-5 מיקרוגרם של חלבון היתוך על ג'ל עמוד יליד 24. הרץ את הג'ל עמוד Native 10% ב 4 מעלות צלזיוס במשך 140 דקות ב 175 V.
- תמונת מקשי PAGE הילידים באמצעות תרמי המצויד לדמיין קרינה, התבוננות שבו ההיתוך מתויג mRuby נודד assay זה.
הערה: היזהר להתבונן חלבון היתוך כי תקוע גם חלבון זה נאסף סביר. אם תרמי קרינה אינו זמין, ניתן לעתים קרובות לדמיין דגימות מרוכזות תמונה של רובה מתויגות חלבון תחת אור שחור או עם תיבת אור UV.
- תמונת מקשי PAGE הילידים באמצעות תרמי המצויד לדמיין קרינה, התבוננות שבו ההיתוך מתויג mRuby נודד assay זה.
- בצע proteolysis מוגבלת לזהות תחומים מקופל ביציבות. דגירה 95 μl של היתוך SD2 רובי-SHRM ב ~ 1 מ"ג / מ"ל עם 5 μl של א סבטיליזין 0.025%
- בואו לטעום את התגובה בנקודות זמן של 0, 0.5, 2, 5, 15, 60, ו -120 דקות, הסרת 10 μl מן התגובה לכל נקודת זמן לדמיין את התקדמות התגובה באמצעות SDS-PAGE באמצעות ג'ל acrylamide 15% .
- הכתם עם Coomassie כחול כמו בשלב 2.2.7 ולהעריך אם זן עמיד פרוטאז ניתן לזהות.
- שלב נתוני יעילות הטיהור, התנהגות עמוד מקומי, proteolysis המוגבלת על חלבוני ההיתוך mRuby2-Shroom מטוהר חלקית לתוך הערכה מקיפה של כל התופעות הכוללות של החלבונים האלה פתרון.
- (אופציונלי) אם assay פונקציונלי מתאים זמין, בדוק אם בוצעה פעילות בשלב זה.
4. הפקת גבישים באיכות גבוהה של סלילי-סליל SD2דומיין מ Shroom
הערה: כל השלבים שונים בסעיף 4.1 מבוצעים בטמפרטורת חדר אלא אם החלבון ירוויח טיהור בטמפרטורה שונה, בדרך כלל 4 מעלות צלזיוס.
- באמצעות 50 מ"ל גידולים כמו הערכה גסה הביטוי ופוטנציאל טיהור, לבצע ביטויים בקנה מידה גדול של SD2 mRuby2-Shroom עם המטרה של השגת 5-20 מ"ג של המדגם מטוהרים לחלוטין. בדרך כלל 2 L של התרבות מספק חומר-מוצא נאות. לאחר תאים גלולי צמיחה על ידי צנטריפוגה ב 8000 XG במשך 10 דקות.
- Resuspend גלולה מהגידול 2 L במאגר תמוגה כמו קודם, באמצעות ~ 2 מ"ל של תמוגה לגרם של התא גלולה קפוא אם באמצעות ליזוזים עבור תמוגה. לחלופין, גלולה ב ~ 8 מ"ל / g של גלולה אם באמצעות homogenizer או בעיתונות הצרפתית. גלולת פסולת הסלולר באמצעות צנטריפוגה ב 30,000 XG במשך 30 דקות.
- אצווה לאגד את השבר מסיס מ 4.1.1 באמצעות 10 מ"ל של שרף Ni-נת"ע. יוצק לתוך עמודת הכבידה מתאימהולאפשר חלבונים מאוגדים כדי לנקז.
- לשטוף שרף 3-5 פעמים עם 40 מ"ל של חיץ תמוגה, ואחריו לשטוף עם חיץ תמוגה שיושלם עד 1 M NaCl.
- שרף לשטוף עם 40 מ"ל של חיץ תמוגה בתוספת 80 imidazole מ"מ.
- Elute החלבון היתוך רובי-Shroom עם 40 מ"ל של חיץ תמוגה שיושלם עד 1 M imidazole. ידני fractionate החלבון eluted לתוך 4-10 מ"ל שברים.
- אשר שברים המכילים חלבון היתוך רובי-Shroom באמצעות 10% SDS-PAGE.
- Dialyze שברים המתאים (בדרך כלל שברים 2-4) לתוך גליצרול 8%, 250 מ"מ NaCl, 15 imidazole מ"מ, 20 מ"מ טריס pH8.0, 1 מ"מ β-ME, באמצעות 6-8 צינורות דיאליזה kDa MWCO. הוסף 1 מ"ג של פרוטאז TEV לכל 25-50 מ"ג של חלבון היתוך. Dialyze לילה בטמפרטורת החדר עם ערבוב איטי.
- טיהור זיקת ניקל חוזר על שלבי 4.1.2. כדי 4.1.6. תחום Shroom SD2 צריך עכשיו להישאר החלק המאוגד בעוד 10 -mRuby2 שלו יישאר כבולהשרף יימצא שברי elution. אשר זה מכתים באמצעות 12% SDS-PAGE עם Coomassie כחול.
- Dialyze שברים המכיל תחום Shroom SD2 ל -8 גליצרול%, 100 מ"מ NaCl, 20 מ"מ טריס pH 8.0, 5 חיץ בטא mercaptoethanol מ"מ לילה.
- בצע כרומטוגרפיה אניוני 25 באמצעות FPLC, משחררים עם שיפוע NaCl מן 0.1-1.0 M NaCl. לנתח שברים באמצעות 12% SDS-PAGE.
- באמצעות concentrator ספין (MWCO של 10 kDa או יותר תלוי החלבון נלמד), להתרכז שברי שיא ~ 0 מ"ג / מיליליטר, ולאחר מכן לבצע כרומטוגרפיה הדרת גודל 26, וניתוח שברי שיא באמצעות 12% SDS-PAGE.
- בריכת שברים שיא dialyze לתוך 20 מ"מ טריס pH 8.0, 50 mM NaCl, 2% גליצרול, 1 מ"מ β-ME, ולהתרכז ל -10 מ"ג / מ"ל לפני התגבשות.
אופציונלי: במהלך שלב זה, להסיר 5 דגימות μl בריכוזים של 1, 2, 5, ו -10 מ"ג / מ"ל במהלך להתרכז המדגם.הפעל μl עמוד טעינה 2-5 יליד מדגם להסתכל על התנהגות של המדגם במהלך שלב זה.
- מסך מערך קטן של 12 תנאים לזהות ריכוז חלבון אופטימלי לניסויי התגבשות. הרכב בתנאים אלה מתואר באיור 7.
- באמצעות מגשי התגבשות ירידה 24 גם יושבים, לבצע ניסויי התגבשות בשיטת דיפוזיה אדי, pipetting 500 μl של כל אחד מ -12 התנאים לתוך בארות נפרדות ואחריו טיפות כי בתחילה להכיל 1 μl של פתרון היטב 1 μl של מדגם חלבון על coverslips . אנא ראה 27 לפרטים נוספים על הטכניקה הזו.
- במהירות לאטום את המגש עם קלטת ברורה להזיז את המגש בסביבה מבוקרת טמפרטורה מתאימה כי היא רטט חופשי. הטמפרטורה בשימוש יכול להשתנות, אבל 4 ° C, 16 ° C, 20 ° C הם נפוצים למדי.
- בדוק את טיפות במגשים במהלך 3 ד הבאays באמצעות מיקרוסקופ במהירות של עד בהגדלה 100X. בסוף תקופת 3 הימים, להבקיע כל טיפה כמכילה לא ממטרים (ברור), משקעי אור, ממטרים כבדים (חום), או גבישים. ריכוז חלבון מתאים אמור להכיל לא יותר מ -6 משקעים כבדים.
- באמצעות ריכוז החלבון מזוהה 4.2, מסך מגוון רחב של מסכי התגבשות זמינים מסחרי. השימוש רובוט טיפול או התגבשות נוזלי מאוד במהירויות את התהליך הזה תוך צמצום שגיאות הטיפות. זה דורש הרבה פחות חלבון, כמו גם, המאפשר למשתמש להקרין תנאים נוספים עם מדגם יחיד.
- שפר תנאים ראשוניים המזוהים ממסכי רחבה על ידי שיטתי משתנה כל אחד מהמשתנים בתוך טיפת ההתגבשות באמצעות 24 גם מגשים הקרנה כמו קודם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תרשים המתאר את זרימת העבודה מנוצלת במערכת זו מוצג באיור 1 ו כולל שלושה שלבים עיקריים. ניתוח חישובית של הרצף מנוצל לפתח השערות לגבי גבולות התחום של החלבון-הסליל המפותל של עניין. דוגמא לניתוח מבואר של תחום Shrm2 SD2 מוצגת באיור 2. בתרשים זה, המטרה הייתה לזהות גבולות תחום אפשריים עבור תחום שימור בבית C- הסופי של רגולטור cytoskeletal Shroom שנקרא SD2. מניתוח זה היה שלוש סדרות שונות של גבולות תחום היפותטי נוצרו המכיל שברים-סליל מפותל כי פורש SD2 נשמר כולו או שברים מינימאליים ליד C- הסופי אשר בסופו של דבר כמו המועמדים הטובים ביותר עבור התגבשות. מועמדים המזוהים מניתוח הרצף אז נבדקים במהירות בקנה מידה קטנה באמצעות היתוך חלבון עם mRuby2 (איור 3) FOr ניתוח יעיל. בקנה מידה קטן נציג (50 מ"ל של התרבות) purifications משני שלו 10 חלבונים -mRuby2 מתוייגים מוצגים באיור 4. בנתון זה, את ההתנהגות של חלבון מסיס היא ברורה ממבט ראשון לעומת עמיתו מסיס שלה. גרוע להביע או בשילובי חלבון מסיסים מזוהים בקלות ובמהירות בצורה זו. ניתוחים ביוכימיים של שברי חלבונים ידי proteolysis המוגבלת מוצגים באיור 5 עבור מגוון רחב של שברים באמצעות לקמול מערכת הרובים מתוארים או עם תחומי Shroom SD2 מבודדים מטוהרים. באיור 5A, שתי גרסאות של העכבר SHRM SD2 המתאים גבולות תחום היפותטי # 2 ו # 1 באיור 3 היו מתעכל באמצעות שיפוע של ריכוז פרוטאז מ (0-1.0%) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שני אלה היו מפורקים ביעילות לתוך שורה של מוצרים קטנים בריכוזי אנזים מתונים. איור 5 מראה את סםניסוי דואר מבוצע באמצעות # גבול היפותטי 3 מ תסיסנית SHRM SD2. חלבון זה לא להתגבש ומבנו תואר 19. ניתוח פרוטאוליטים יכול להיות שימושי גם כאשר בוחנים רובי-התכה כפי שנוצר מן הפרוטוקול הנ"ל. כפי שניתן לראות בתרשים 5 ג, חלבון היתוך רובי עם אדם Shrm2 SD2 (1427-1610) היה מתעכל עם ריכוז גבוה (0.025%) של סבטיליזין פרוטאז הלא ספציפית בטמפרטורת החדר למשך נקודות הזמן המצוין. כאן מקשר בין רובי SHRM היה בקע מייד כפי שניתן היה לצפות. בנוסף, מוצרים קלים נוצרו המציין חלבון זה שני אזורים רגישים פרוטאז אחרים, לעומת זאת, את המוצרים של שפלה שיוצרו בתוך 2 דקות נותרו על כנן בעיקר בכל שאר הניסוי המציין את החלבון הוא בעצם די יציב.
גישת משלימה מוצגת באמצעות analys עמוד ילידיםהוא באיור 6. באיור 6 א, רובי-tagged אדם SHRM SD2 (1427-1610) וכן חלבון המכיל את מוטציות נקודתיות המצוין בתוך SHRM מנותחים על ידי עמוד הילידים. בניסוי זה, החלבון wild-type (המהווה גבישים) פועל כשני להקות שונות, תוך שלושה מוטנטים שאינם מתגבשים יש התנהגות שונה באופן דרמטי. על מנת להוכיח כי המערכת יכולה להיות שימושית גם על קומפלקסי חלבונים, מגוון מתחמי Shroom-רוק נותח על ידי עמוד יליד באיור 6B. במקרה זה, אותו שבר של האדם Shrm2 SD2 (1427-1610) שימש כדי לעזור להבהיר את הניתוח, בעוד שברי שונים של רוק האדם נוצלו. גישה זו הציעה מתחמים נוצרו באמצעות רוק 700-906 ו 746-906 היו מינים רבים, היו מרווחים, ופחות הומוגנית. מכלולים ניצול 788-906 שופרו, אם כי לא באופן דרמטי, מין זה הצליח להתגבש, אמנם לקח גבישים שבועות רבים כדי ליצור ונגדמזרקת מושפל חלבון רוק. קומפלקסים שנוצרו באמצעות רוק 834-913 יצרו מין יחיד ואחיד יותר על הג'ל והתגבשו בקלות לילה. איור 7 מציג סט של התגבשות תנאים נפוצים המשמשים להלשין על ההתנהגות של מדגם החלבון בניסויי התגבשות, ויכול לשמש בדרך כלל עם חלבון כלשהו. באופן אידיאלי, שילוב של תנאים ברורים מזרזים יושג. חלבונים כי לא יוצרים משקעים דורשים ריכוז גבוה או תנאי חציצה מחמירים יותר ואילו אלה לזרז בתנאים רבים יש להשתמש בריכוז חלבון נמוך או עם תנאי חציצה מקדמים מסיס חלבון.
איור 1: Workflow תרשים. דיאגרמה כללית המתארת את האינטגרציה של ניתוח רצף חישובית ביוכימיותמעבדת טכניקות רטובה אחרות לתוך אסטרטגיה מקיפה התוויית גבולות תחום וזיהוי שברי חלבון להתגבשות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: מבואר ניתוח רצף עבור תחום SD2 המפותל, סליל מ Shroom. כיסוי של חישובית ניתוחי תחום Shroom SD2, כולל יישור רצף נפוץ שנוצר על ידי אומגת Clustal והצבעוני ידי זהות רצף בתוך Jalview (שלב 1.1). כמו כן נכללות ניבא מבנה משני, תחזיות רצף סדר, ותחזיות-סליל מפותל של תחום Shroom SD2 (שלב 1.2). גבולות תחום היפותטי (שלב 1.3) מסומנים ככאלה הם גבולות נצפו מבנה משניאלמנטים כפי שעולה ניתוח crystallographic עוקב 19. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: תרשים של מערכת 10 -mRuby2-הבעתו. (א) סכמטי של וקטור ביטוי 10 שלו -mRuby2-XH2 וקטור השתמשו במחקר זה. (ב) תרשים של אתר השיבוט המרובה וקטור זה. רצפי קידוד חלבון בדרך כלל מוכנסים לתוך וקטור זו באמצעות BamHI ו EcoRI אתרי שיבוט. C- הסופית הקיצונית של חלבון mRuby2 מוצג באדום, האתר מהחשוף פרוטאז TEV מסומן בסוגריים ועם המוסד בו מחשוף המוצג משולש אדום. רצף מקשר בין mRuby2 ואתר TEV מוצג ציאן.אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: purifications מידה נציג קטן של שני mRuby2 מתויג חלבונים היתוך. (א) תמונה של דגימות ביטוי תרבית חיידקים רובי SHRM SD2 או חלבון היתוך רובה קשור הידוע להיות מסיס הן בתמונה. תרבות נפרדת לבטא חלבון ללא תג-רובה מוצגת להשוואה. (ב) חלק המסיסים מן התרבויות מעל היו צלמו באי תמוגה צנטריפוגה ב 30,000 XG במשך 30 דקות, תוך הפגנה להדמיה של SD2 רובי-SHRM המסיס. תמונה (C) של חרוזי Ni-נ.ת.ע לאחר מחייב צעדי כביסה הבאים המציין כי רובי-SHRM SD2 מתבצעת משותק עלחרוזים. (ד) דוגמאות של צעדי כביסת elution כמתוארים בשלבי 2.3.6 ו 2.3.7 להוכיח כי ההיתוך רובי-SHRM SD2 נשאר קשור השרף תוך בנוכחות עד 80 imidazole מ"מ והוא eluted ביעילות את הטור עם חיץ elution 1 M imidazole. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: proteolysis המוגבל של תחומי SD2 מועמד מחלבוני Shroom שונים. מהשוואת תחומי ארבעה SD2 מחלבוני Shroom שונים. (A ו- B) שברי SHRM SD2 הצביעו הודגרו עם מפל ריכוזים של טריפסין פרוטאז מן 0 ל -1.0% והתוצאות נותחו על ידי SDS-PAGE. הקשר של זה שנינות מקטעי חלבוןh גבולות היפותטי מסומנים. (C) SDS-PAGE ניתוח של מערכת העיכול פרוטאוליטים מוגבל של 10 שלו -mRuby2-Shroom חלבון היתוך SD2 בשיטת כמובן זמן כמתואר בפרוטוקול. התגובה התרחשה עם 0.025% טריפסין בטמפרטורת החדר. עיכול של המקשר בין רובי Shroom SD2 הוא מהיר ומשמש בקרה פנימית. מוצר שפל להניח כי השיתוף מטהר עם חלבון ההיתוך 10 -mRuby2-Shroom SD2 שלו מצוין (*). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: התבוננות שינויים בהתנהגות חלבון באמצעות ג'ל הילידים. (א) 10% עמוד Native הוכחת השפעת מוטציה שמשנה את המאפיינים של mRuby2-Shrooמ SD2. בתנאים אלה SHRM SD2 פועל בשתי תזמורות דיסקרטיות, ואילו מוטציות נקודה המצוין בתוך SD2 להציג מגוון של דפוסי נדידה סוטים. (ב) השוואת מתחמי Shroom SD2-רוק נוצר באמצעות גרסאות שונות של רוק ונותחו על ידי עמוד הילידים. קומפלקסים בין Shroom SD2 ואת שברי המצוין של קינאז רוק (שני חלבונים-סליל מפותל) נפתרו על ידי עמוד הילידים. קריסטלים התקבלו עבור הקומפלקס המכיל רוק 788-906 לאחר שבועות רבים אבל מורכבות המכילות רוק 834-913 התגבשו במהירות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7: מסך ראשי מהיר להתגבשות. (א) מסך מהיר של שיתוף התגבשות משותףnditions משמש כדי להעריך את ההתנהגות של מדגם החלבון בניסויי התגבשות. (ב) דוגמאות של מטריקס הניקוד פשוט להעריך טיפות התגבשות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן נועד לעזור למשתמש לזהות גבולות התחום בתוך חלבונים מפותל-סליל גדול כדי להקל התגבשות שלהם. הפרוטוקול מסתמך על שילוב הוליסטי של מגוון נתונים מתחזיות חישובית ומקורות אחרים כדי ליצור סדרה של גבולות תחום פוטנציאליים. אלה ואחריו סט של ניסויים ביוכימיים שהן מהירים וזולים, והם משמשים להמשך צמצום השערות הראשוניות אלה. בגישה זו, המשתמש יכול לחסל שברי חלבון פוטנציאל במהירות כי הם רצויים, ולמקד את תשומת לב יותר על מועמדים טובים יותר, ובכך לשפר את סיכויי קבלת גבישים.
ישנם צעדים רבים וחשובים בתוך טכניקה זו, לעומת זאת, אף אחד קריטי כמו לייצור גבישים כמו הפיתוח של הקבוצה הראשונית של גבולות תחום היפותטי. צעד זה משלב מגוון של גישות חישוביות, כמו גם אוב מידעמזרקה מהספרות או הנתונים תפקודיים כאשר זמינה. יש להקפיד להימנע משימוש האסטרטגיה לחדד מייד אל הפתרון "הטוב ביותר" אחת כמו אין כיום שיטה במקום לצרף ערך אמון לכימות לכל התחזיות. במקום זאת, עדיף להשתמש כשיטה לזהות קבוצה קטנה במהירות של גבולות תחום אפשריים אשר צריכים להיות אומה בניסוי.
את תכונות חלבונים מפותלים, סליל אשר ניתן לנתח עם פרוטוקול זה הן די רחבות. מנקודת מבט חישובית, כוחו של תחזיות מפותלת-סליל מוגבל מתחת ל -20 חומצות אמינו, וכאמור בשלב 1.2.1, אזורים מפותל-סליל גדול מ -1,000 חומצות אמינו יהיו צורך לפצל למקטעים מרובים לניתוח על ידי DISOPRED. אנו רואים מגבלה בהמשך כזמנית כמות שהוא נכפה על ידי השרת ועשוי להשתנות כשיטה תשודרג בעתיד. הניתוח ביוכימיים עוקב לעומת זאת, יכול לסבולבדרכים שונות. ראשית, לולאות פנימיות או אזורים רגישים יתר פרוטאזות עלול להפוך את המדגם להיראות פחות יציב יותר ממה שהיא באמת. חלבונים יציבים אשר בקעו לולאות או פגומות עכשיו אחרת על ידי פרוטאז עדיין צריכים לתת הופעה יציבה על עמוד ילידים, ולכן הוא מומלץ שהמשתמש לבחון אסטרטגיות הן. עמוד Native עשוי להיות קשה עבור חלבונים מסוימים, לעומת זאת, או בגלל שהם מאוד ארוכים ולהעביר לאט לתוך ג'ל או משום החיוב המסוים שלהם עלול לגרום להם לרוץ בכיוון ההפוך מן ג'ל לחלוטין. במקרים זה, זה עשוי להיות מועיל כדי לחקור תנאי חציצה שונים עבור מערכת ג'ל עמוד הילידים.
למרות ההתמקדות של העבודה המוצגת כאן כבר על חלבונים המכילים מפותל-סליל גדול, פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל כמעט לכל חלבון עם עיבודים מעט מאוד. התוספת העיקרית חלבונים כדוריים תהיה התוספת של תוכנת חיזוי מושלם כמו 28 pDomTHREADER </ sup> או DomPred 29 לחפש גבולות תחום, ותחזיות מבנה שלישוני כגון Phyre2 30 כדי לשפר את כוח הניבוי של ניתוח רצף. בנוסף, יש הרבה אלגוריתמים זמינים לביצוע תחזיות מבנה משניות ותחזיות סדר וההכללה של אלגוריתמים נוספים יכולה להיות לעזר. חלבונים כדוריים לעתים קרובות בעלי פעילות אנזימטית או readouts פונקציונליים אחרים שיספקו מידע חשוב נוסף במהלך בחירת היעד. יתר על כן, ניתן לשלב טכניקות מתונות או תפוקה גבוהה פי צורך. לדוגמא, מערכות זולות 1-2 מיליליטר תרבויות purifications זיקת מתכת בפורמטי 96-היטב זמינות 31. לבסוף, השימוש רובוטיקה להקמת מספר רב של ניסויי התגבשות באמצעות מדגם מינימאלי הופך לשגרה, אבל תפעול יעיל של מערכות רובוטיות מבוסס על ההתנהגות של דגימות חלבון מאופיינות היטב. בנוסףשינויים אל לפרוטוקול זה יכול לכלול דגימת מגוון של תגי זיקה. תגים שונים ניאון רבים זמינים, או היספני, GST-, Thioredoxin-, Strep-, ו MBP- נמנים עשרות אפשרויות זמינות אם תג פלורסנט אינו נחוץ או מועיל.
בעת ביצוע הליך זה, המשתמש צריך להיות זהיר של האפקט כי תג mRuby2 שאולי יש על 'חלבון המשתמשים של עניין. עדויות אנקדוטיות משימוש תג זה על מגוון רחב של תערובות שונות תומכות בעובדה mRuby2 לפעמים יהיה לאגד די בחוזקה לחלבון של עניין, נותר כבול באמצעות צעדי chromatographic מרובים. התנהגות זו היא ללא ספק בלתי רצויה, אבל מתחמי רובה לא מכוונים בדרך כלל ניתן להפריד והוציאו chromatographically. לא ברור אם זו היא התנהגות כמו-המלווה כמו נצפתה עבור MBP 32.
לאחר קבלת גבישים, ישנם עדיין אתגרים רבים מתמודדים בדרך כלל עם coiחלבונים-סליל הוביל שאינן מטופלות בפרוטוקול זה. הנפוץ ביותר היא איכות עקיפה עניה, בין אם בשל יצר חסימה מושלמת או עקיפת איזוטרופי. ישנם כלים במקום כדי לסייע עם עקיפת איזוטרופי 33, ואלה היו קריטיים לפתרון כמה מבנים מפותל-סליל 18,20. פתולוגיות קריסטל רבות לצערי קשות להתגבר במהירות, ולכן לעתים קרובות נבון לחפש צורות גבישיות נוספות עם מאפיינים עקיפים משופרים. זה הקל על ידי הקרנת רובוטית אלף תנאים. לחלופין ישנן טכניקות שלאחר התגבשות רבות כדי לשפר את האיכות עקיפה כגון התייבשות, או זריעת 34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BL21(DE3) Rosetta | Emd Millipore | 70954-3 | |
| BL21(DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | |
| BL21(DE3) Codon Plus | Agilent Technologies | 230245 | |
| Lysozyme | Spectrum Chemical Mfg Corp | L3008-5GM | |
| Ni-NTA resin | Life Technologies | 25216 | |
| SubtilisinA | Spectrum Chemical Mfg Corp | S1211-10ML | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-160 | |
| INTELLI-PLATE 96: | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
| PEG 3350 | Hampton research | HR2-591 | |
| PEG 8000 | Hampton research | HR2-515 | |
| PEG 400 | Hampton research | HR2-603 | |
| PEG 4000 | Hampton research | HR2-605 | |
| pcDNA3.1-Clover-mRuby2 | Addgene | 49089 | |
| Overnight Express Autoinduction System 1 | Emd Millipore | 71300 | |
| Lysogeny Broth powder | ThermoFisher Scientific | 12795027 |
References
- Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
- Chapman, T. Protein purification: pure but not simple. Nature. 434 (7034), 795-798 (2005).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. Predicting coiled coils from protein sequences. Science. 252 (5009), 1162-1164 (1991).
- Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils. J Struct Biol. 137 (1-2), 41-53 (2002).
- Lupas, A. N., Gruber, M. The structure of alpha-helical coiled coils. Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).
- Hernandez Alvarez, B., et al. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Eng Des Sel. 21 (1), 11-18 (2008).
- Slabinski, L., et al. The challenge of protein structure determination--lessons from structural genomics. Protein Sci. 16 (11), 2472-2482 (2007).
- Slabinski, L., et al. XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
- Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure. Curr Biol. 13 (24), 2125-2137 (2003).
- Hildebrand, J. D. Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network. J Cell Sci. 118 (Pt 22), 5191-5203 (2005).
- Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins. J Biol Chem. 281 (29), 20542-20554 (2006).
- Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction. Dev Dyn. 239 (7), 2078-2093 (2010).
- Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis. Mol Biol Cell. 22 (6), 795-805 (2011).
- Das, D., et al. The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice. Biol Open. 3 (9), 850-860 (2014).
- Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA. J Biol Chem. 279 (8), 7098-7104 (2004).
- Mohan, S., et al. Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology. PLoS One. 8 (12), e81075 (2013).
- Mohan, S., et al. Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction. Mol Biol Cell. 23 (11), 2131-2142 (2012).
- Tu, D., et al. Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I. PLoS One. 6 (3), e18080 (2011).
- Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol. 7, 539 (2011).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue. Anal Biochem. 48 (2), 617-620 (1972).
- Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Jungbauer, A., Hahn, R.
- Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography. J Chromatogr A. 1132 (1-2), 98-108 (2006).
- Giege, R. A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day. FEBS J. 280 (24), 6456-6497 (2013).
- Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination. Bioinformatics. 25 (14), 1761-1767 (2009).
- Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure. Protein Sci. 11 (12), 2814-2824 (2002).
- Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).
- Elsliger, M. A., et al. The JCSG high-throughput structural biology pipeline. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66 (Pt 10), 1137-1142 (2010).
- Bach, H., et al. Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies. J Mol Biol. 312 (1), 79-93 (2001).
- Strong, M., et al. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8060-8065 (2006).
- Heras, B., Martin, J. L. Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 9), 1173-1180 (2005).
