Introduction
Détermination de la structure par cristallographie aux rayons X a apporté des contributions fondamentales à tous les domaines de la biologie moderne; fournissant une vue atomique des macromolécules qui soutiennent la vie et comment ils interagissent les uns avec les autres dans une variété de contextes; ce qui nous permet de comprendre les mécanismes qui causent les possibilités de maladies et de fournir à la conception rationnelle des médicaments pour traiter la maladie. Cristallographie a longtemps été la technique expérimentale dominante pour déterminer la structure macromoléculaire, et représente actuellement 89,3% de la base de données structurelle (www.rcsb.org). Cette technique présente de nombreux avantages, y compris le potentiel de très haute résolution, la possibilité de visualiser des macromolécules avec un large éventail de tailles, la collecte de données relativement facile, et la possibilité de visualiser comment la macromolécule interagit avec le solvant ainsi que des ligands.
Malgré de nombreuses améliorations technologiques dans l' expression de protéines recombinantes 1,2, purification 3, et la biologie moléculaire utilisé pour générer ces systèmes 4, le principal obstacle dans le processus cristallographique reste la capacité à produire des cristaux de qualité de diffraction. Cela a été particulièrement vrai pour les protéines qui contiennent de grands domaines coiled-coil. Il a été estimé que jusqu'à 5% de tous les acides aminés se trouvent dans les bobines enroulées 5,6, ce qui en fait une caractéristique structurelle très commun 7, mais ces protéines sont souvent plus difficiles à purifier et cristalliser que les protéines globulaires 8-10 . Ceci est encore aggravé par le fait que les domaines bispiralés sont souvent trouvées dans le contexte d'une protéine plus grande, par conséquent prédire correctement les limites de ces domaines est essentielle pour éviter l'inclusion d'une séquence non structurée ou flexible qui est souvent préjudiciable pour la cristallisation.
Ici, nous présentons un cadre conceptuel combinant calcul basé sur le Web avec des analyses experimental données sur le banc, pour aider les utilisateurs de guidage à travers les étapes initiales du processus cristallographique, notamment: comment sélectionner fragment (s) de protéines pour des études structurales, et la façon de préparer et de caractériser des échantillons de protéines avant les tentatives de cristallisation. Nous concentrons notre analyse sur deux protéines contenant de grands domaines coiled-coil, Shroom (SHRM) et Rho-kinase (Rock). Ces protéines ont été choisis car ils contiennent tous les deux des domaines bispiralés et sont connues pour former un complexe biologiquement pertinente 11-16. Shroom et Rho-kinase (Rock) sont prévus pour contenir ~ 200 et 680 résidus de superhélice respectivement, de nombreuses portions qui ont été caractérisés structurellement 17-20. La méthode décrite ici fournit un flux de travail simplifié pour identifier rapidement des fragments de superhélice contenant des protéines qui se prêter à la cristallisation, cependant, les techniques décrites peuvent être facilement adaptés pour la plupart des protéines ou complexes protéiques ou modifiés pour incorporer à haut débit approChes comme disponible. Enfin, ces méthodes sont généralement peu coûteux et peuvent être effectuées par les utilisateurs à presque tous les niveaux d'expérience.
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Protocol
NOTE: Un diagramme du cadre conceptuel ou flux de travail est décrit dans la figure 1 pour référence. Le protocole peut être décomposé en quatre étapes: calcul des prédictions basées ou séquence, expression de protéines et de purification, caractérisation biochimique, et de cristallisation. Les exemples ci analysent les domaines Shroom SD2 et / ou complexes Shroom-Rock, mais ils peuvent être utilisés avec toute protéine.
1. Utilisez Établi outils Web pour générer des prédictions de calcul des limites du domaine superhélice
- Collecter un Set Evolutionarily Diverse des séquences homologues.
- Allez à www.uniprot.org et tapez Shroom dans la barre de recherche supérieure.
- Sélectionnez les séquences à télécharger en cochant la case à côté de leur numéro d'accession. Sequences avec une étoile indiquent les séquences examinées par Uniprot et sont généralement plus fiables. Prenez soin de veiller à ce que toutes les séquences sont complètes et exactes.
- Enregistrer les s sélectionnésequences en cliquant sur le bouton Télécharger.
- Alignez la collection de séquences Shroom utilisant Clustal-Omega 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Cliquez sur le bouton "Parcourir" pour sélectionner le fichier avec les séquences Shroom puis appuyez sur Soumettre.
- Après l'alignement est terminé, cliquez sur le bouton "Télécharger alignement File".
- Ouvrez l'alignement de séquences multiples généré en 1.1.5 en utilisant Jalview (Fichier | Alignement d'entrée | À partir du fichier). Dans la nouvelle fenêtre d'alignement, la couleur par l'identité (couleur | Pourcentage d'identité).
- Calculer des prédictions de la structure secondaire, les prédictions de séquences souples ou désordonnée, et prédit les régions de superhélice dans la protéine (s) d'intérêt.
- Allez à http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, pour calculer les prévisions superhélice. Copiez et collez la séquence dans la boîte de séquence et cliquez sur Envoyer.
NOTE: Cette analyse peut prendre quelques heures pour complete. Depuis séquences champis sont assez grandes, peuvent avoir besoin d'être divisé en blocs de moins de 1000 acides aminés pour tenir dans la contrainte de taille de la webserver les séquences. Lors de l'analyse Shrm2, il est recommandé que les C-terminaux de 1000 acides aminés sont utilisés comme cette section contient le domaine SHRM SD2 qui est connu pour contenir des régions bispirales. Lors de la répétition de cette analyse avec d'autres protéines, il est recommandé d'utiliser les séquences de protéines de pleine longueur, si possible. Si cela ne constitue pas une option, utilisez le plus grand fragment possible ou disséquer la séquence en fonction des données biochimiques ou fonctionnelles connues. - Allez à http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, pour calculer les prévisions superhélice. Copiez et collez la séquence dans la boîte de séquence et cliquez sur Envoyer.
- Allez à http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, pour calculer les prévisions superhélice. Copiez et collez la séquence dans la boîte de séquence et cliquez sur Envoyer.
- Combiner les résultats des étapes 1.1 à 1.2.2 en une seule annotation complète de la séquence Shroom.
NOTE: Il est fortement encouragé à inclure également toute i pertinentenformation qui peuvent être tirées de la littérature ou d'autres sources au sujet de la fonction des protéines ou la purification à ce stade. - En utilisant cette séquence annotée complète, prédire les limites du domaine (ou une série de limites possibles) pour la protéine, en essayant d'optimiser la conservation et prédit les caractéristiques structurelles, tout en minimisant la quantité de séquence désordonnée ou flexible. Si elle est connue, la protéine résultante devrait conserver les propriétés fonctionnelles d'intérêt.
2. Express et purifier des protéines avec les limites du domaine identifiés dans la section 1
NOTE: Le but de cette section est d'utiliser une série de tests rapides et facilement quantifiables pour dépister les limites du domaine hypothétiques générés dans la section 1.
- En utilisant des techniques classiques de biologie moléculaire, de générer un plasmide d'expression avec la séquence codante désirée dans le cadre à l' intérieur His 10 -mRuby2-XH2 plasmide (voir la Figure 3 pour la carte d' un vecteure plus de détails).
- Les niveaux d'expression de test pour chaque plasmide d'expression en utilisant BL21 (DE3) de E. coli ou d'une autre souche d'expression appropriée dans les médias autoinduction 1 à la température ambiante pendant 18-24 h.
- Transformer des plasmides d'expression, ainsi que d'un contrôle plasmidique vide dans BL21 (DE3) en suivant les instructions fournies avec les cellules ou en utilisant le protocole de transformation robuste, comme celle ici (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial -transformation/).
- De la plaque fraîchement transformé, choisissez une seule colonie et développer une culture de départ de 5 ml à 37 ° C pendant la nuit dans Lysogénie Broth (LB) médias avec 34 pg / ml de kanamycine.
- Le lendemain, sédimenter la culture et laver le culot avec LB. frais
- Ajouter la culture starter à 50 ml de milieu de autoinduction avec 34 pg / ml de kanamycine. Permettre à la culture de se développer à la saturation soit à la température ambiante ou 37 ° C. En règle générale, pour croître ~ 18-24 h.
- cellule Pellets et congeler les culots cellulaires résultants à -80 ° C avant la purification indéfiniment.
- Comparer les extraits de cellules entières de chaque souche d'expression et le contrôle de vecteur vide par SDS-PAGE pour déterminer la souche qui produit le plus efficacement la protéine de fusion souhaitée. Pour ses 10 protéines de fusion -mRuby2-Shroom SD2, exécutez 10% de gels de SDS-PAGE à 180 V pour ~ 50 min ou jusqu'à ce que le front de colorant atteigne le fond du gel 22.
- Gel Stain au bleu de Coomassie pour visualiser les protéines cellulaires totales dans chaque souche 23.
- Effectuer une étape de chromatographie d'affinité initiale sur chaque souche qui a exprimé avec succès la protéine mRuby2-fusion. En règle générale, effectuer les étapes de purification 2.3.2-2.3.7 à la température ambiante, à moins que la protéine bénéficiera de conditions modifiées telles que l'épuration à 4 ° C.
- culots cellulaires Décongeler de l'étape 2.2.5.
- Remettre en suspension chaque culot cellulaire dans 1,5 ml de tampon de lyse (10% de glycerol, 500 mM de NaCl, 40mM d'imidazole, 20 mM de Tris pH 8,0, 1 mM de bêta-mercaptoéthanol). Compléter le tampon de lyse avec des inhibiteurs de la protéase, le cas échéant.
- Ajouter 30 ul de 10 mg / ml de lysozyme et on incube à température ambiante pendant 20 min. Soniquez suivant les instructions de l'instrument utilisé.
- Transférer dans un tube de 1,5 ml et centrifuger dans une centrifugeuse de table pendant 30 minutes à 14.000 xg pour sédimenter les matières insolubles ou des cellules non lysées. Enregistrer la fois surnageant et le culot pour une analyse ultérieure par SDS-PAGE.
- Réaliser une purification par affinité au nickel, l'incubation de la fraction soluble avec 100 ul de billes de Ni-NTA. Incuber les perles avec lysat soluble pendant 5-10 minutes, retournant plusieurs fois pour mélanger des billes.
- Centrifuger à 800 g pendant 30 secondes dans une centrifugeuse de table pour pastiller les billes. Laver ensuite le culot 3-5 fois avec du tampon de lyse pour nettoyer des contaminants non spécifiques.
- Éluer Ruby protéine de fusion des billes avec du tampon de lyse supplémenté avec 1M d'imidazole.
- Utilisez SDS-PAGE pour comparer le comportement de ses-mRuby2-Shroom protéines dans la purification "rapide et sale" ci-dessus.
3. Caractériser Protein échantillon pour identifier ceux avec des propriétés avantageuses
- Utilisez un ensemble de spectrophotomètre à 280 nm pour mesurer la concentration de la protéine de fusion Ruby, puis évaluer l'homogénéité de l'échantillon en chargeant 1-5 pg de protéine de fusion sur un gel PAGE natif 24. Exécutez le gel à 10% PAGE native à 4 ° C pendant 140 min à 175 V.
- Imager la PAGE native en utilisant un imageur équipé pour visualiser la fluorescence, l'observation où la fusion étiquetée mRuby migre dans cet essai.
REMARQUE: Veillez à respecter la protéine de fusion qui est coincé dans le puits de cette protéine est probablement agrégées. Si un imageur de fluorescence ne sont pas disponibles, on peut souvent visualiser et image concentrée échantillons de Ruby tagged protéines sous une lumière noire ou avec une boîte de lumière UV.
- Imager la PAGE native en utilisant un imageur équipé pour visualiser la fluorescence, l'observation où la fusion étiquetée mRuby migre dans cet essai.
- Effectuer une protéolyse limitée pour identifier les domaines de manière stable pliées. Incuber 95 pi de Ruby-SHRM SD2 fusion à ~ 1 mg / ml avec 5 pi de 0,025% subtilisine A.
- Échantillonner la réaction à des points de temps de 0, 0,5, 2, 5, 15, 60 et 120 minutes, en enlevant 10 ul de la réaction pour chaque point de temps et de visualiser la progression de la réaction par SDS-PAGE en utilisant un gel d'acrylamide à 15% .
- Se colorent en bleu de Coomassie comme à l'étape 2.2.7 et à évaluer si une espèce résistant à la protéase peuvent être identifiés.
- Intégrer les données de l'efficacité de la purification, le comportement en PAGE natif, et la protéolyse limitée sur les protéines de fusion mRuby2-Shroom partiellement purifiés à une évaluation globale du comportement global de ces protéines en solution.
- (Facultatif) Si un test fonctionnel approprié est disponible, vérifier l'activité à ce stade.
4. Produire des cristaux de haute qualité de la Coiled-coil SD2Domaine de Shroom
NOTE: Toutes les étapes dans la section 4.1 sont réalisées à température ambiante, sauf la protéine bénéficierait d'une purification à une température différente, habituellement de 4 ° C.
- En utilisant les 50 ml excroissances comme une estimation approximative de l'expression et le potentiel de purification, effectuer de grandes expressions à l'échelle de mRuby2-Shroom SD2 dans le but de parvenir à 5-20 mg d'échantillon complètement purifié. Typiquement 2 L de la culture fournit du matériel de départ adéquat. Après que les cellules de granules de croissance par centrifugation à 8000 xg pendant 10 min.
- Reprendre le culot de la croissance de 2 L dans un tampon de lyse comme avant, en utilisant ~ 2 ml de lyse par gramme de culot cellulaire congelé en cas d'utilisation du lysozyme pour la lyse. Alternativement, resuspendre à ~ 8 ml / g de granulés en cas d'utilisation d'un homogénéisateur ou presse française. Pellet débris cellulaires par centrifugation à 30.000 xg pendant 30 min.
- Lier par lots à partir de la fraction soluble 4.1.1 en utilisant 10 ml de résine Ni-NTA. Verser dans la colonne de gravité appropriéeet permettent les protéines non liées à écouler.
- Résine de lavage 3-5 fois avec 40 ml de tampon de lyse, suivis d'un lavage avec du tampon de lyse additionné de 1 M de NaCl.
- Résine lavage avec 40 ml de tampon de lyse supplémenté avec 80 mM d'imidazole.
- Éluer la protéine de fusion rubis Shroom avec 40 ml de tampon de lyse additionné de 1 M d'imidazole. fractionner manuellement la protéine éluée dans 4-10 ml fractions.
- Confirmer les fractions contenant rubis Shroom protéine de fusion en utilisant 10% de SDS-PAGE.
- Dialyser fractions appropriées (fractions typiquement 2-4) dans 8% de glycérol, 250 mM de NaCl, mM imidazole 15, 20 mM Tris pH 8,0, 1 mM β-ME, en utilisant 6-8 tube de dialyse MWCO kDa. Ajouter 1 mg de protéase TEV 25-50 pour chaque mg de protéine de fusion. Dialyser nuit à température ambiante sous agitation lente.
- Répéter la purification d'affinité de nickel étapes 4.1.2. à 4.1.6. Le domaine Shroom SD2 devrait maintenant rester dans la fraction non liée tandis que le son 10 -mRuby2 restera lié àla résine et se trouvent dans les fractions d'élution. Confirmez cela en utilisant 12% de SDS-PAGE coloration au bleu de Coomassie.
- Dialyser les fractions contenant Shroom SD2 dans le domaine de 8% de glycerol, 100 mM de NaCl, 20 mM de Tris pH 8,0, tampon de bêta-mercaptoéthanol 5 mM pendant une nuit.
- Effectuer une chromatographie d'échange d'anions en utilisant un 25 FPLC, et en éluant avec un gradient de NaCl 0,1 à 1,0 M de NaCl. Analyser les fractions en utilisant 12% de SDS-PAGE.
- En utilisant un concentrateur de filage (MWCO de 10 kDa ou plus en fonction de la protéine à l'étude), on concentre les fractions pics à ~ 0 mg / ml, puis effectuer une chromatographie d' exclusion de taille 26, l' analyse des fractions de pic par 12% de SDS-PAGE.
- Piscine fractions de pic et dialyser dans 20 mM de Tris pH 8,0, NaCl 50 mM, 2% de glycerol, 1 mM β-ME et concentrées à 10 mg / ml avant la cristallisation.
Facultatif: Au cours de cette étape, enlever des échantillons de 5 ul à des concentrations de 1, 2, 5 et 10 mg / ml au cours de la concentration de l'échantillon.Exécuter un natif PAGE loading 2-5 pi de chaque échantillon à examiner le comportement de l'échantillon au cours de cette étape.
- Screen un petit tableau de 12 conditions pour identifier une concentration optimale en protéines pour les essais de cristallisation. La composition de ces conditions est décrit dans la figure 7.
- À l'aide de 24 puits assis déposer des plateaux de cristallisation, effectuer des essais de cristallisation selon la méthode de diffusion de la vapeur, le pipetage de 500 ul de chacun des 12 conditions dans des puits séparés, suivie par les gouttes contenant initialement 1 pi de solution bien et 1 pi d'échantillon de protéine sur les lamelles couvre- . S'il vous plaît voir 27 pour plus d' informations sur cette technique.
- sceller rapidement le plateau avec du ruban adhésif transparent et déplacer le plateau dans un environnement contrôlé de température appropriée qui est exempt de vibrations. La température utilisée peut varier, mais 4 ° C, 16 ° C et 20 ° C sont très fréquentes.
- Examiner les gouttes dans les bacs au cours de la 3 suivante days à l'aide d'un microscope à grossissement jusqu'à 100x. A la fin de la période de 3 jours, marquer chaque goutte comme contenant pas de précipitation (clair), de faibles précipitations, de fortes précipitations (brun), ou de cristaux. Une concentration de protéine appropriée ne doit pas contenir plus de 6 fortes précipitations.
- En utilisant la concentration de la protéine identifiée dans 4.2, cribler une large gamme d'écrans de cristallisation disponibles dans le commerce. L'utilisation d'un robot de manipulation ou d'une cristallisation du liquide accélère grandement le processus, tout en minimisant les erreurs dans les gouttes. Elle exige beaucoup moins de protéines aussi bien, permettant à l'utilisateur de l'écran plusieurs conditions avec un seul échantillon.
- Améliorer les conditions initiales identifiées à partir de larges écrans en faisant varier systématiquement chacune des variables à l'intérieur de la goutte de cristallisation en utilisant les 24 puits des plateaux de criblage comme précédemment.
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Representative Results
Un diagramme illustrant le flux utilisé dans ce système est représenté sur la figure 1 et comprend trois étapes principales. analyse computationnelle de la séquence est utilisée pour formuler des hypothèses sur les limites du domaine de la protéine superhélice d'intérêt. Un exemple d'une analyse annotée du domaine Shrm2 SD2 est représenté sur la figure 2. Dans ce schéma, l'objectif était d'identifier les limites possibles de domaine pour un domaine conservé à l'extrémité C-terminale du régulateur du cytosquelette Shroom appelé SD2. De cette analyse était de trois ensembles distincts de limites de domaine hypothétiques ont été générés contenant des fragments bispirales qui couvrent l'ensemble du SD2 conservé ou fragments minimes près de l'extrémité C-terminale qui a fini comme les meilleurs candidats pour la cristallisation. Les candidats identifiés à partir de l'analyse de la séquence sont ensuite rapidement testées à petite échelle en utilisant une protéine de fusion avec mRuby2 (Figure 3) for une analyse efficace. Petite échelle représentant (50 ml de culture) de purifications de deux Ses 10 protéines -mRuby2-marquées sont présentées dans la figure 4. Sur cette figure, le comportement d'une protéine insoluble est facilement apparent par rapport à son homologue soluble. Ou médiocrement exprimant des fusions de protéines insolubles sont facilement et rapidement identifiés de cette manière. Les analyses biochimiques des fragments de protéine par protéolyse limitée sont présentés sur la figure 5 pour une variété de fragments en utilisant le système flétrir Ruby décrit ou avec des domaines de Shroom SD2 isolés et purifiés. Sur la figure 5A, deux variantes de souris GSRH SD2 correspondant aux limites du domaine hypothétiques # 2 et # 1 sur la figure 3 ont été digérés à l' aide d' un gradient de concentration de la protéase à partir de (0 à 1,0%) pendant 30 min à température ambiante. Ces deux ont été effectivement dégradé en une multitude de petits produits à des concentrations d'enzymes modérées. La figure 5B montre le same expérience réalisée en utilisant la limite hypothétique # 3 de Drosophila SHRM SD2. Cette protéine ne cristallise et sa structure a été décrite 19. analyse protéolytique peut également être utile lors de l'examen Ruby-fusions générées à partir du protocole ci-dessus. Comme on le voit sur la figure 5C, une protéine de fusion avec Ruby Shrm2 humaine SD2 (1427-1610) a été digéré avec une concentration élevée (0,025%) , de la protéase Subtilisine non spécifique à la température ambiante pour les points temporels indiqués. Voici l'éditeur de liens entre Ruby et SHRM a été immédiatement clivée comme on pouvait s'y attendre. En outre, les produits secondaires ont été formés indiquant cette protéine a deux autres régions sensibles à la protéase, cependant, les produits de dégradation qui ont été produites dans les 2 minutes sont restées largement intactes tout au long du reste de l'expérience indique que la protéine est en fait tout à fait stable.
Une approche complémentaire est affiché en utilisant analys PAGE natifest la figure 6. Sur la figure 6A, Ruby-tagged humaine SHRM SD2 (1427-1610) ainsi que des protéines contenant les mutations ponctuelles indiquées au sein de SHRM sont analysés par PAGE native. Dans cette expérience, la protéine de type sauvage (qui forme des cristaux) fonctionne comme deux bandes distinctes, alors que les trois mutants qui ne cristallisent pas un comportement très différent. Pour démontrer que le système peut également être utile sur des complexes de protéines, une variété de complexes Shroom-Rock ont été analysées par PAGE native à la figure 6B. Dans ce cas, le même fragment de Shrm2 humaine SD2 (1427-1610) a été utilisé pour aider à clarifier l'analyse, tandis que différents fragments de roche humaine ont été utilisés. Cette approche suggère que les complexes formés en utilisant rock 700-906 et 746-906 avaient de multiples espèces, étaient smeary, et moins homogène. Complexes utilisant 788-906 ont été améliorés, mais pas de façon spectaculaire, et cette espèce a pu cristalliser, bien que les cristaux ont pris plusieurs semaines pour former et concontenue dégradée protéine Rock. Complexes générés en utilisant rock 834-913 formé une espèce unique et plus uniformes sur le gel et facilement cristallisé pendant la nuit. La figure 7 représente un ensemble de conditions de cristallisation communes qui sont utilisées pour informer sur le comportement de l'échantillon de protéines dans des essais de cristallisation, et peut être utilisé en général avec une protéine quelconque. Idéalement, une combinaison de conditions claires et de précipitation est obtenue. Les protéines qui ne forment pas de précipités nécessitent des concentrations plus élevées ou à des conditions plus strictes de mise en mémoire tampon, tandis que ceux qui précipitent dans de nombreuses conditions doivent être utilisés à une concentration protéique inférieure ou dans des conditions de tampon qui favorisent la solubilité de la protéine.
Figure 1: Diagramme des processus. Un schéma généralisé illustrant l'intégration de l'analyse de la séquence de calcul et biochimiques etd'autres techniques de laboratoire humide dans une stratégie globale pour la délimitation des frontières du domaine et l'identification des fragments de protéines pour la cristallisation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: annotée analyse de la séquence pour la superhélice SD2 domaine de Shroom. Une superposition de calcul pour le domaine des analyses Shroom SD2, comprenant un alignement de séquences multiples CLUSTAL générée par oméga et colorée par une identité de séquence au sein Jalview (étape 1.1). Sont également inclus prédit la structure secondaire, les prédictions de séquences désordonnées, et les prédictions bispirales du domaine Shroom SD2 (étape 1.2). les limites du domaine Hypothétique (étape 1.3) sont indiqués comme le sont les limites observées et la structure secondaireéléments tels que révélés par l' analyse cristallographique ultérieure 19. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Schéma du Son système 10 -mRuby2-expression. (A) Représentation schématique du vecteur d'expression de son 10 -mRuby2-XH2 vecteur utilisé dans cette étude. (B) Schéma du multisite de clonage de ce vecteur. Protein séquences codantes sont généralement insérés dans ce vecteur par l'intermédiaire des sites de clonage BamHI et EcoRI. L'extrémité C-terminale de la protéine mRuby2 est indiquée en rouge, le site de clivage de protéase TEV est indiquée avec des crochets et avec le site de clivage présentée comme un triangle rouge. Une séquence de liaison entre le mRuby2 et le site TEV est représenté dans le cyan.S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Représentant petites purifications échelle de deux mRuby2 tagged protéines de fusion. (A) Une image d'échantillons d'expression de la culture bactérienne Ruby SHRM SD2 ou Ruby protéine de fusion sans rapport connu pour être insolubles sont en photo. Une culture distincte exprimant une protéine sans Ruby-tag est affichée à titre de comparaison. (B) La fraction soluble à partir des cultures ci - dessus ont été imagés après la lyse et centrifugation à 30 000 xg pendant 30 minutes, ce qui démontre la visualisation de rubis soluble dans GSRH SD2. (C) l' image des billes Ni-NTA après la liaison et les étapes de lavage ultérieures indiquant que Ruby-SHRM SD2 est immobilisé surles billes. (D) Les échantillons de lavage et d' élution étapes telles que décrites dans les étapes 2.3.6 et 2.3.7 montrent que la fusion rubis GSRH SD2 reste lié à la résine tandis que , en présence de jusqu'à 80 mM d' imidazole et est efficacement éluée de la colonne avec un tampon d'élution à 1 M d'imidazole. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: protéolyse limitée des candidats SD2 domaines de différentes protéines Shroom. Une comparaison des quatre domaines SD2 de diverses protéines Shroom. (A et B) Les fragments GSRH SD2 indiqués ont été mises en incubation avec un gradient de concentration de la protease trypsine 0 à 1,0% , et les résultats ont été analysés par SDS-PAGE. La relation de ce fragment de protéine d'esprith les limites hypothétiques sont indiquées. (C) Analyse SDS-PAGE de la digestion protéolytique limitée de sa protéine de fusion 10 -mRuby2-Shroom SD2 selon la méthode du cours du temps décrit dans le protocole. La réaction a eu lieu avec 0,025% de trypsine à la température ambiante. Digestion du lieur entre Ruby et Shroom SD2 est rapide et sert de contrôle interne. Un produit de dégradation présumé que le co-purifie avec His-10 -mRuby2 Shroom SD2 protéine de fusion est indiquée (*). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Observer les changements de comportement des protéines en utilisant un gel natif. (A) 10% PAGE native démontrant l'effet d'un mutant qui modifie les propriétés de mRuby2-Shroom SD2. Dans ces conditions, la SHRM SD2 fonctionne comme deux bandes distinctes, tandis que des mutants ponctuels indiqués dans le SD2 afficher une gamme de modèles de migration aberrants. (B) Une comparaison des complexes Shroom SD2-Rock formé en utilisant différentes versions du Rock et analysées par PAGE native. Complexes entre Shroom SD2 et les fragments indiqués du Rock kinase (les deux protéines bispirales) ont été résolus par PAGE native. Les cristaux ont été obtenus pour le complexe contenant rock 788-906 après de nombreuses semaines, mais complexe contenant rock 834-913 cristallisées rapidement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7: écran primaire rapide pour la cristallisation. (A) Un écran rapide de co cristallisation communenditions est utilisé pour évaluer le comportement de l'échantillon de protéines dans des essais de cristallisation. (B) Des exemples de la matrice de notation simple pour évaluer les gouttes de cristallisation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le protocole décrit ici est conçu pour aider l'utilisateur à identifier les limites du domaine au sein de grandes protéines superhélice pour faciliter leur cristallisation. Le protocole repose sur une intégration globale d'une série de données à partir des prédictions de calcul et d'autres sources pour générer une série de limites des domaines potentiels. Ils sont suivis par une série d'expériences biochimiques qui sont rapides et peu coûteux, et qui sont utilisés pour affiner ces premières hypothèses. En utilisant cette approche, l'utilisateur peut rapidement éliminer les fragments protéiques potentiels qui sont indésirables, et se concentrer davantage sur de meilleurs candidats, ce qui améliore les chances d'obtenir des cristaux.
Il y a de nombreuses étapes importantes au sein de cette technique, cependant, aucun comme critique pour la production de cristaux que le développement de l'ensemble initial des limites de domaine hypothétiques. Cette étape comprend une variété d'approches de calcul, ainsi que des informations obcontenues dans la littérature ou des données fonctionnelles lorsqu'elles sont disponibles. Il faut prendre soin d'éviter d'utiliser la stratégie de parfaire immédiatement vers le bas pour le single "meilleure" solution car il n'y a actuellement aucune méthode en place pour fixer une valeur de confiance quantifiable à l'une des prédictions. Au lieu de cela, il est préférable d'utiliser comme une méthode pour identifier rapidement un petit ensemble de limites possibles de domaine qui doivent être vérifiées expérimentalement.
Les propriétés des protéines bispirales qui peuvent être analysés avec ce protocole sont assez larges. Du point de vue de calcul, la force de prédictions superhélice est limitée au-dessous de 20 acides aminés, et comme mentionné dans l'étape 1.2.1, les régions de superhélice supérieure à 1000 acides aminés devrait être divisé en plusieurs sections pour une analyse par DISOPRED. Nous considérons que cette limitation plus tard comme temporaire car elle est imposée par le serveur Web et peut changer à mesure que le procédé est mis à niveau à l'avenir. L'analyse biochimique subséquente peut cependant souffrirde diverses manières. Tout d'abord, des boucles ou des régions hypersensibles aux protéases peuvent rendre l'échantillon internes semblent être moins stable qu'elle ne l'est en réalité. protéines stables qui ont clivés boucles ou sont autrement entaillés par la protéase doivent encore donner une apparence stable sur PAGE native, ce qui explique pourquoi il est recommandé que l'utilisateur d'explorer les deux stratégies. PAGE native peut être difficile pour certaines protéines, cependant, que ce soit parce qu'ils sont très longues et migrent lentement dans le gel ou parce que leur charge particulière peut faire courir la direction opposée du gel entièrement. Dans ce cas, il peut être utile d'explorer les différentes conditions de mise en mémoire tampon pour le système de gel PAGE natif.
Bien que l'accent du travail présenté ici a été sur de grandes protéines contenant superhélice, ce protocole peut être utilisé pour presque toutes les protéines avec très peu d'adaptations. L'addition primaire pour les protéines globulaires serait l'ajout d' un logiciel de prédiction de domaine tel que pDomTHREADER 28 </ sup> ou DomPred 29 à rechercher les limites du domaine, et les prédictions de structure tertiaires telles que Phyre2 30 pour améliorer le pouvoir prédictif de l'analyse de la séquence. En outre, il existe de nombreux algorithmes disponibles pour effectuer des prédictions de structure secondaire et les prévisions désordonnées, et l'inclusion des algorithmes supplémentaires pourraient être utiles. Les protéines globulaires possèdent souvent une activité enzymatique ou d'autres affichages fonctionnels qui fournirait des informations supplémentaires importantes lors de la sélection de cible. En outre, des techniques modérées ou à haut débit peuvent être incorporés, le cas échéant. Par exemple, des systèmes peu coûteux pour 1-2 ml de cultures et purifications d'affinité métallique dans un format à 96 puits sont facilement disponibles 31. Enfin, l'utilisation de la robotique pour mettre en place un grand nombre d'expériences de cristallisation en utilisant un minimum de l'échantillon est de plus en routine, mais un fonctionnement efficace des systèmes robotiques est basée sur le comportement des échantillons de protéines bien caractérisées. Une additionmodifications al à ce protocole pourraient inclure l'échantillonnage d'une variété de marqueurs d'affinité. Beaucoup de différentes étiquettes fluorescentes sont disponibles, ou His-, GST, thiorédoxine, Streptomyces et MBP sont parmi des dizaines d'options disponibles si un marqueur fluorescent est pas nécessaire ou utile.
Lors de l'exécution de cette procédure, l'utilisateur doit être conscient de l'effet que la balise mRuby2 pourrait avoir sur la protéine d'intérêt des utilisateurs. Des preuves anecdotiques d'utiliser cette balise sur une variété de différentes fusions soutient le fait que mRuby2 parfois se lier très étroitement à la protéine d'intérêt, restant lié par de multiples étapes chromatographiques. Ce comportement est évidemment indésirable, mais complexes Ruby involontaires peut généralement être séparé et retiré chromatographique. On ne sait pas si cela est un comportement de chaperon comme cela a été observé pour 32 MBP.
Après l'obtention de cristaux, il y a encore de nombreux défis qui sont souvent confrontés à des coiprotéines conduit-bobine qui ne sont pas abordés dans ce protocole. La plus courante est la mauvaise qualité de diffraction, soit en raison de imparfaitement formée treillages ou anisotrope diffraction. Il existe des outils en place pour aider à anisotrope diffraction 33, et ceux - ci ont joué un rôle crucial pour la résolution de certaines structures à enroulement en spirale 18,20. De nombreuses pathologies de cristal sont malheureusement difficiles à surmonter rapidement, donc il est souvent prudent de chercher des formes cristallines supplémentaires avec des propriétés améliorées de diffraction. Ceci est facilité par criblage robotisé de milliers de conditions. Sinon il existe de nombreuses techniques de post-cristallisation pour améliorer la qualité de diffraction tels que la déshydratation, ou semis 34.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BL21(DE3) Rosetta | Emd Millipore | 70954-3 | |
| BL21(DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | |
| BL21(DE3) Codon Plus | Agilent Technologies | 230245 | |
| Lysozyme | Spectrum Chemical Mfg Corp | L3008-5GM | |
| Ni-NTA resin | Life Technologies | 25216 | |
| SubtilisinA | Spectrum Chemical Mfg Corp | S1211-10ML | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-160 | |
| INTELLI-PLATE 96: | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
| PEG 3350 | Hampton research | HR2-591 | |
| PEG 8000 | Hampton research | HR2-515 | |
| PEG 400 | Hampton research | HR2-603 | |
| PEG 4000 | Hampton research | HR2-605 | |
| pcDNA3.1-Clover-mRuby2 | Addgene | 49089 | |
| Overnight Express Autoinduction System 1 | Emd Millipore | 71300 | |
| Lysogeny Broth powder | ThermoFisher Scientific | 12795027 |
References
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