Introduction
Strukturbestämning via röntgenkristallografi har gjort fundamentala bidrag till alla områden av modern biologi, tillhandahålla ett atom vy av makromolekylerna som stöder livet och hur de samverkar med varandra i en mängd olika sammanhang; tillåter oss att förstå de mekanismer som orsakar sjukdom och ger möjligheter att rationellt utforma läkemedel mot sjukdomen. Kristallografi har länge varit den dominerande experimentell teknik för att bestämma makromolekylära struktur, och står för närvarande för 89,3% av den strukturella databasen (www.rcsb.org). Denna teknik har många fördelar, inklusive möjligheten till mycket hög upplösning, förmågan att visualisera makromolekyler med ett brett intervall av storlekar, relativt lätt för datainsamling, och möjlighet att visualisera hur makromolekylen interagerar med lösningsmedel samt ligander.
Trots ett stort antal tekniska förbättringar i rekombinant proteinuttryck 1,2, purförgasning 3 och molekylärbiologi används för att generera dessa system 4, den enskilt största hindret i den kristallografiska processen fortfarande förmågan att växa diffraktion kvalitet kristaller. Detta har varit särskilt sant för proteiner som innehåller stora coiled-coil-domäner. Det har uppskattats att så mycket som 5% av alla aminosyror finns inom lindade-spolar 5,6, vilket gör detta ett mycket vanligt strukturellt drag 7, men dessa proteiner är ofta svårare att rena och kristallisera än globulära proteiner 8-10 . Detta förvärras ytterligare av det faktum att coiled-coil-domäner finns ofta inom ramen för ett större protein, därför korrekt förutsäga gränserna för dessa domäner är avgörande för att undvika införandet av ostrukturerad eller flexibel sekvens som ofta är skadlig för kristallisation.
Här presenterar vi en konceptuell ram som kombinerar webbaserad beräkningsanalyser med Experimental data från bänken, som hjälper användarna genom de inledande skedena av den kristallografiska processen inklusive: Hur man väljer proteinfragment (s) för strukturstudier, och hur man förbereder och karakterisera proteinprover före kristallisa försök. Vi fokuserar vår analys på två proteiner som innehåller stora ringlad-spiraldomäner, Shroom (SHRM) och Rho-kinas (Rock). Dessa proteiner valdes eftersom de båda innehåller coiled-coil-domäner och är kända för att bilda en biologiskt relevant komplex 11-16. Shroom och Rho-kinas (Rock) förutsägs innehålla ~ 200 och 680 rester av coiled-coil respektive många delar som har präglats strukturellt 17-20. Den metod som beskrivs här ger en strömlinjeformad arbetsflöde för att snabbt identifiera fragment av coiled-coil innehållande protein som kommer att vara mottaglig för kristallisation är emellertid den teknik som beskrivs kan lätt anpassas för de flesta protein eller proteinkomplex eller modifierad för att införliva hög genomströmning approaches som finns. Slutligen dessa metoder är i allmänhet billigt och kan utföras av användare på nästan alla erfarenheter nivåer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Ett diagram av den konceptuella ramen eller arbetsflöde beskrivs i figur 1 som referens. Protokollet kan delas upp i fyra steg: computational eller sekvensbaserade förutsägelser, proteinuttryck och rening, biokemisk karakterisering, och kristallisation. Exemplen analysera Shroom SD2 domäner och / eller Shroom-Rock-komplex, men kan användas med något protein.
1. Använd Etablerad webbaserade verktyg för att generera Beräknings Förutsägelser om coiled-coil domängränser
- Samla ett evolutionärt uppsättning olika sekvenshomologer.
- Gå till www.uniprot.org och skriv in Shroom i övre sökfältet.
- Välj sekvenser för att hämta genom att markera rutan bredvid deras antal anslutningen. Sekvenser med en stjärna indikerar sekvenser granskas av UniProt och är i allmänhet mer tillförlitliga. Var noga med att se till att alla sekvenser är fullständig och korrekt.
- Spara valda sequences genom att klicka på knappen Hämta.
- Rikta insamling av Shroom sekvenser med hjälp av Clustal-Omega 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Klicka på "Bläddra" -knappen för att välja den fil med Shroom sekvenserna och tryck sedan på Skicka.
- Efter justeringen är klar, klicka på "Download Alignment File" -knappen.
- Öppna flera sekvensinpassning som genereras i 1.1.5 med användning av Jalview (Arkiv | Input Justering | Från fil). I den nya inriktningen fönster, färg genom identitet (färg | Procent Identity).
- Beräkna förutsägelser av sekundär struktur, förutsägelser av flexibelt eller oordnad sekvensen och förutsagd coiled-coil-regioner i protein (er) av intresse.
- Gå till http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi att beräkna coiled-coil förutsägelser. Kopiera och klistra sekvensen i sekvens Box och klicka på Skicka.
OBS: Denna analys kan ta ett par timmar att complete. Eftersom Shroom sekvenser är ganska stora, kan sekvenserna måste delas upp i block av mindre än 1000 aminosyror för att passa i storlek begränsning av webbservern. När man analyserar Shrm2, rekommenderas att de C-terminala 1000 aminosyror används som detta avsnitt innehåller SHRM SD2 domän som är känd för att innehålla coiled-coil regioner. När upprepa denna analys med andra proteiner, är det rekommenderat att använda fullängdsproteinsekvenser när det är möjligt. Om detta inte är ett alternativ, använd det största fragmentet möjligt eller dissekera sekvens baserad på kända biokemiska och funktionella uppgifter. - Gå till http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi att beräkna coiled-coil förutsägelser. Kopiera och klistra sekvensen i sekvens Box och klicka på Skicka.
- Gå till http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi att beräkna coiled-coil förutsägelser. Kopiera och klistra sekvensen i sekvens Box och klicka på Skicka.
- Kombinera resultaten av steg 1.1 till 1.2.2 i en enda övergripande anteckning av Shroom sekvensen.
OBS: Det är mycket uppmuntras till att även omfatta all relevant information som kan härledas från litteratur eller andra källor om proteiners funktion eller rening i detta skede. - Med hjälp av denna omfattande kommenterad sekvens, förutsäga domängränser (eller en rad möjliga gränser) för proteinet, försöker maximera bevarande och förutspådde strukturella egenskaper och samtidigt minimera mängden störda eller flexibel sekvens. Om det är känt, bör det resulterande proteinet bibehåller de funktionella egenskaperna av intresse.
2. Express och rena proteiner med domängränser som anges i avsnitt 1
OBS: Målet med detta avsnitt är att använda en serie av snabba och lätt kvantifierbara analyser för att screena hypotetiska domängränser som genereras i avsnitt 1.
- Med användning av standardmässiga molekylärbiologiska tekniker, generera en expressionsplasmid med den önskade kodande sekvensen i ram inuti His 10 -mRuby2-XH2 plasmiden (Se Figur 3 för vektorkartan ennd ytterligare detaljer).
- Test expressionsnivåer för varje expressionsplasmid med användning av BL21 (DE3) E. coli eller annan lämplig expressionsstam i autoinduktion media 1 vid rumstemperatur under 18 till 24 h.
- Omvandla expressionsplasmider samt en tom plasmid kontroll i BL21 (DE3) enligt instruktionerna som följde med cellerna eller använda robusta transformationsprotokoll, såsom en här (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial -omvandling/).
- Från nyligen transformerade plattan, plocka en enda koloni och odla en 5 ml startkultur vid 37 ° C över natten i lysogeni Broth (LB) medium med 34 pg / ml kanamycin.
- Följande dag, pellets kulturen och tvätta pelleten med färsk LB.
- Lägg startkulturen till 50 ml av autoinduktion media med 34 | j, g / ml kanamycin. Göra det möjligt för kulturen att växa till mättnad vid antingen rumstemperatur eller 37 ° C. Typiskt växa under ~ 18-24 timmar.
- pellet cells och frysa de resulterande cellpelletarna vid -80 ° C på obestämd tid före rening.
- Jämföra helcellextrakt från varje expressionsstam och den tomma vektorkontrollen genom SDS-PAGE för att bestämma den stam som mest effektivt ger den önskade fusionsproteinet. För sina 10 -mRuby2-Shroom SD2 fusionsproteiner, springa 10% SDS-PAGE-geler vid 180 V under ~ 50 min eller tills färgen når botten av gelén 22.
- Stain gel med Coomassie Blue för att synliggöra de totala cellulära proteiner inom varje stam 23.
- Gör en inledande affinitetskromatografi steg på varje stam som uttrycktes framgångsrikt mRuby2-fusionsprotein. Typiskt utför reningssteg 2.3.2-2.3.7 vid rumstemperatur, om inte proteinet kommer att gynnas av förändrade förhållanden såsom rening vid 4 ° C.
- Tina cellpelletar från steg 2.2.5.
- Resuspendera varje cellpelleten i 1,5 ml lyseringsbuffert (10% glycerol, 500 mM NaCl, 40mM imidazol, 20 mM Tris pH 8,0, 1 mM beta-merkaptoetanol). Komplettera lysbuffert med proteashämmare som är lämpligt.
- Tillsätt 30 | il av 10 mg / ml lysozym och inkubera vid rumstemperatur i 20 min. Sonikera följa instruktionerna för instrumentet som används.
- Överför till ett 1,5 ml rör och centrifugera i en bordscentrifug under 30 minuter vid 14.000 xg för att pelletera olösligt material eller olyserade celler. Spara både supernatanten och pelleten för efterföljande analys via SDS-PAGE.
- Utföra nickelaffinitetsrening, inkubering av den lösliga fraktionen med 100 pl av Ni-NTA-pärlor. Inkubera pärlorna med lösligt lysat under 5-10 min, inverterande flera gånger för att blanda pärlor.
- Centrifugera vid 800 x g under 30 sek i en bordscentrifug för att pelletera pärlorna. Följ denna genom att tvätta pelleten 3-5 gånger med lysbuffert att rensa bort icke-specifika föroreningar.
- Eluera Ruby fusionsproteinet från pärlorna med lysbuffert kompletterad med enM imidazol.
- Använd SDS-PAGE för att jämföra beteendet hos Hans-mRuby2-Shroom proteiner i "quick and dirty" rening ovan.
3. Karakterisera Protein prov för att identifiera dem med fördelaktiga egenskaper
- Använda en spektrofotometer inställd på 280 nm för att mäta koncentrationen av Ruby-fusionsproteinet, och sedan bedöma homogenitet hos provet genom att ladda 1-5 pg av fusionsproteinet på en nativ PAGE-gel 24. Kör 10% Native PAGE-gel vid 4 ° C under 140 min vid 175 V.
- Bild den nativa PAGE med hjälp av en avbildnings utrustad för att visualisera fluorescens, observera där mRuby-märkta fusions vandrar i denna analys.
OBS: Var noga med att följa fusionsprotein som har fastnat i brunnen som detta protein sannolikt samman. Om en fluorescenskameran inte är tillgänglig, kan man ofta visualisera och bild koncentrerade prover av Ruby taggade protein under en svart ljus eller med en UV-ljuslåda.
- Bild den nativa PAGE med hjälp av en avbildnings utrustad för att visualisera fluorescens, observera där mRuby-märkta fusions vandrar i denna analys.
- Utför begränsad proteolys för att identifiera stabilt vikta domäner. Inkubera 95 | il av Ruby-SHRM SD2 fusion vid ~ 1 mg / ml med 5 pl av 0,025% subtilisin A.
- Sampla reaktionen vid tidpunkterna 0, 0,5, 2, 5, 15, 60, och 120 min, avlägsnande av 10 | il från reaktionen för varje tidpunkt och visualisera reaktionens framskridande via SDS-PAGE med användning av en akrylamidgel 15% .
- Stain med Coomassie Blue som i steg 2.2.7 och utvärdera huruvida ett proteas resistenta arter kan identifieras.
- Integrera data från reningseffektiviteten, beteende i naturlig PAGE, och begränsad proteolys på de delvis renade mRuby2-Shroom fusionsproteiner i en omfattande utvärdering av den totala beteendet hos dessa proteiner i lösning.
- (Valfritt) Om en lämplig funktionell analys är tillgänglig, kontrollera aktivitet vid denna tidpunkt.
4. producera högkvalitativa kristaller av coiled-coil SD2Domänen från Shroom
NOTERA: Alla steg inom kategorin 4,1 utförs vid rumstemperatur om proteinet skulle gynnas av rening vid en annan temperatur, vanligen 4 ° C.
- Med hjälp av 50 ml utväxter som en grov uppskattning av uttryck och rening potential, utföra storskaliga uttryck för mRuby2-Shroom SD2 med målet att uppnå 5-20 mg helt renade provet. Typiskt 2 L kultur ger tillräcklig utgångsmaterial. Efter odling Pelletera celler genom centrifugering vid 8000 xg i 10 min.
- Suspendera pelleten från 2 L tillväxten i lysbuffert som tidigare, med hjälp av ~ 2 ml lys per gram fryst cellpellet om du använder lysozym för lys. Alternativt resuspendera på ~ 8 ml / g pellet om du använder en homogenisator eller fransk press. Pellets cellrester genom centrifugering vid 30.000 xg under 30 minuter.
- Sats binda lösliga fraktionen från 4.1.1 med användning av 10 ml Ni-NTA harts. Häll i lämplig allvar kolonnoch låta obundna proteiner rinna av.
- Tvätta harts 3-5 gånger med 40 ml lyseringsbuffert, följt av en tvätt med lysbuffert kompletterad till 1 M NaCl.
- Tvätta hartset med 40 ml lyseringsbuffert som kompletterats med 80 mM imidazol.
- Eluera Ruby-Shroom fusionsprotein med 40 ml lysbuffert kompletteras till en M imidazol. Manuellt fraktionera eluerade proteinet i 4-10 ml fraktioner.
- Bekräfta fraktioner innehållande Ruby-Shroom fusionsprotein med användning av 10% SDS-PAGE.
- Dialysera lämpliga fraktioner (typiskt fraktionerna 2-4) i 8% glycerol, 250 mM NaCl, 15 mM imidazol, 20 mM Tris pH 8,0, 1 mM β-ME, med 6-8 kDa MWCO dialysrör. Tillsätt 1 mg av TEV-proteas för varje 25-50 mg av fusionsprotein. Dialysera över natten vid rumstemperatur under långsam omröring.
- Upprepa nickel affinitetsreningssteg 4.1.2. till 4.1.6. Den Shroom SD2 domänen ska nu stanna kvar i den obundna fraktionen medan hans 10 -mRuby2 förblir bundet tillhartset och kommer att finnas i elueringsfraktionerna. Bekräfta detta med hjälp av 12% SDS-PAGE-färgning med Coomassie Blue.
- Dialysera fraktioner innehållande Shroom SD2 domän till 8% glycerol, 100 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, 5 mM beta-merkaptoetanol-buffert över natten.
- Utföra anjonbyteskromatografi 25 med användning av en FPLC, och eluering med en NaCl-gradient från 0,1 till 1,0 M NaCl. Analysera fraktioner med användning av 12% SDS-PAGE.
- Med användning av en spin-koncentrator (MWCO 10 kDa eller större beroende på det protein som studeras), koncentrera toppfraktionerna till ~ 0 mg / ml, och sedan utföra gelkromatografi 26, analysera toppfraktioner via 12% SDS-PAGE.
- Pool toppfraktioner och dialysera in i 20 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 2% glycerol, 1 mM β-ME, och koncentrera till 10 mg / ml före kristallisation.
Valfritt: Under detta steg, ta bort 5 ul prover vid koncentrationer av 1, 2, 5, och 10 mg / ml under loppet av koncentrering av provet.Köra en nativ PAGE-laddnings 2-5 | il av varje prov för att titta på beteendet hos provet under detta steg.
- Screen en liten samling av 12 förutsättningar för att identifiera en optimal proteinkoncentration för kristallisering prövningar. Sammansättningen av dessa tillstånd beskrivs i fig 7.
- Med hjälp av 24-väl sitter droppe kristallise brickor, utföra kristallisering prövningar med hjälp av ångdiffusion metoden, pipettering 500 pl av vart och ett av de 12 villkoren i separata brunnar följt av droppar som initialt innehåller 1 pl väl lösning och ett pl av proteinprovet på täck . Se 27 för ytterligare information om denna teknik.
- Snabbt täta facket med genomskinlig tejp och förflytta brickan till en lämplig temperatur kontrollerad miljö som är vibrationsfri. Den som används kan variera temperaturen, men 4 ° C, 16 ° C, och 20 ° C är ganska vanligt.
- Undersök dropparna i magasinen under de närmaste tre days med användning av ett mikroskop vid upp till 100 gångers förstoring. Vid slutet av den 3-dagars period, poäng varje droppe som innehållande ingen fällning (klar), lätt utfällning, kraftig nederbörd (brun), eller kristaller. En lämplig proteinkoncentration bör innehålla mer än 6 tunga utfällningar.
- Med användning av proteinkoncentrationen som identifieras i 4,2, screena ett brett område av kommersiellt tillgängliga kristallisationsskärmar. Användningen av en vätskehanterande eller kristallisa robot snabbar i hög grad upp denna process och samtidigt minimerar fel i dropparna. Det kräver mycket mindre protein också, så att användaren kan screena fler villkor med ett enda prov.
- Förbättra den grundläggande villkor som anges från breda skärmar genom att systematiskt variera varje variablerna i kristallisa släppa med hjälp av 24 brunnar screening brickor som tidigare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett diagram som visar arbetsflödet som används i detta system visas i Figur 1 och omfattar tre huvudsteg. Computational analys av sekvensen utnyttjas för att utveckla hypoteser om domängränser av coiled-coil proteinet av intresse. Ett exempel på en kommenterad analys av Shrm2 SD2-domänen visas i figur 2. I detta diagram var målet att identifiera möjliga domängränser för en konserverad domän vid C-terminalen av cytoskelettala regulatorn Shroom kallas SD2. Från denna analys var tre olika uppsättningar av hypotetiska gränser domän genererades innehållande coiled-coil-fragment som spänner över hela konserverade SD2 eller minimala fragment nära C-terminalen som slutade som de bästa kandidaterna för kristallisation. Kandidater som identifierats från sekvensanalys därefter snabbt testas i liten skala med hjälp av en proteinfusion med mRuby2 (Figur 3) for effektiv analys. Representativ liten skala (50 ml kultur) reningar från två Hans 10 -mRuby2-märkta proteiner är visade i figur 4. I denna figur, är beteendet hos ett olösligt protein lätt uppenbara jämfört med dess lösliga motsvarighet. Dåligt som uttrycker eller olösliga proteinfusioner kan lätt och snabbt identifieras på detta sätt. Biokemiska analyser av proteinfragment genom begränsad proteolys är visade i fig 5 för en mängd olika fragment med användning av vissna Ruby beskrivna systemet eller med isolerade och renade Shroom SD2 domäner. I figur 5A, två varianter av mus SHRM SD2 motsvarande hypotetiska domängränser # 2 och # 1 i fig 3 digererades med användning av en gradient av proteas koncentration från (0-1,0%) i 30 min vid rumstemperatur. Båda dessa var effektivt degraderas till en mängd mindre produkter vid måttliga enzymkoncentrationer. Figur 5B visar same experiment utfört med användning av hypotetisk gräns # 3 från Drosophila SHRM SD2. Detta protein kristalliserade och dess struktur har beskrivits 19. Proteolytisk analys kan också vara användbart när man undersöker Ruby-fusioner som genereras från protokollet ovan. Såsom visas i fig 5C, en Ruby fusionsprotein med humant Shrm2 SD2 (1427-1610) digererades med en hög koncentration (0,025%) av den icke-specifika proteas Subtilisin vid rumstemperatur under de angivna tidpunkterna. Här länken mellan Ruby och SHRM omedelbart klyvs som kan förväntas. Dessutom har mindre produkter bildas som indikerar detta protein har två andra proteashämmare känsliga områden, men i stort sett intakt under resten av experimentet indikerar proteinet är faktiskt ganska stabil de nedbrytningsprodukter som producerats inom två minuter.
En kompletterande strategi visas med hjälp av naturlig PAGE analysär i figur 6. I Figur 6A, Ruby-tagged human SHRM SD2 (1427-1610) såväl som proteininnehållande de angivna punktmutationer inom SHRM analyseras med naturlig PAGE. I detta experiment, av vildtyp-proteinet (som bildar kristaller) körs som två distinkta band, medan de tre mutanterna, som inte kristalliserar har dramatiskt annorlunda beteende. För att visa att systemet också kan vara användbart på proteinkomplex, var en variation av Shroom-Rock-komplex analyserades genom nativ PAGE i fig 6B. I detta fall var det samma fragment av humant Shrm2 SD2 (1427-1610) som används för att förtydliga analysen medan olika fragment av humant Rock användes. Detta tillvägagångssätt föreslog att komplex bildas med hjälp av Rock 700-906 och 746-906 hade flera arter, var smetig, och mindre homogen. Komplex använder 788-906 förbättrades, om än inte dramatiskt, och denna art kunde kristallisera, även om kristaller tog många veckor för att bilda och konhållas degraderas Rock-protein. Komplex som genereras med hjälp av Rock 834-913 bildade en enda och mer enhetliga arter på gelén och lätt kristalliseras över natten. Figur 7 visar en uppsättning gemensamma kristallisationsbetingelser som används för att informera om beteendet hos proteinprovet i kristallisering prövningar, och kan användas generellt med något protein. Helst ska en blandning av tydliga och fällningsförhållanden erhållas. Proteiner som inte bildar fällningar kräver höga koncentrationer eller strängare buffrande förhållanden medan de som fälls ut i många förhållanden bör användas vid en lägre proteinkoncentration eller med buffrande förhållanden som främjar protein löslighet.
Figur 1: arbetsflödesdiagrammet. En generaliserad diagram som visar integrering av beräkningssekvensanalys och biokemiska ochandra våt laboratorietekniker i en övergripande strategi för att avgränsa domängränser och identifiera proteinfragment för kristallisation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: kommenterad sekvensanalys för upprullad spiral SD2 domän från Shroom. En överlagring av beräkningsanalyser för Shroom SD2 domän, inklusive en multipel sekvensinpassning som genereras av CLUSTAL omega och färgat av sekvensidentitet inom Jalview (steg 1,1). Dessutom ingår förutses sekundärstruktur, oordnade sekvens förutsägelser, och coiled-coil förutsägelser om Shroom SD2 domänen (Steg 1,2). Hypotetiskt domängränser (steg 1,3) indikeras som är observerade gränser och sekundär strukturelement som avslöjats genom efterföljande kristallografisk analys 19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Diagram över His 10 -mRuby2-expressionssystem. (A) Schematisk bild av expressionsvektom His 10 -mRuby2-XH2 vektor som användes i denna studie. (B) Diagram av det multipla kloningsstället från denna vektor. Proteinkodande sekvenserna typiskt infogas i denna vektor via BamHI- och EcoRI-kloningsställen. Den extrema C-terminalen av den mRuby2 proteinet visas i rött, är TEV-proteas klyvningsstället markeras med parentes och med klyvningsstället visas som en röd triangel. En linker-sekvens mellan mRuby2 och TEV platsen visas i cyan.Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa småskaliga reningar av två mRuby2 taggade fusionsproteiner. (A) En bild av prover av bakteriekulturen uttryck Ruby SHRM SD2 eller en obesläktad Ruby fusionsprotein känt för att vara olösliga är avbildade. En separat kultur som uttrycker ett protein utan en Ruby-tagg visas för jämförelse. (B) Den lösliga fraktionen från kulturerna ovan avbildades efter lys och centrifugering vid 30.000 xg under 30 min, vilket visar visualisering av lösligt Ruby-SHRM SD2. (C) Bild av Ni-NTA-pärlor efter bindning och efterföljande tvättsteg indikerar att Ruby-SHRM SD2 är immobiliserat påpärlorna. (D) Prover av tvätt- och elueringssteg såsom beskrivs i steg 2.3.6 och 2.3.7 visar att Ruby-SHRM SD2 fusion förblir bunden till hartset medan i närvaro av upp till 80 mM imidazol och i praktiken eluerades från kolonnen med 1 M imidazol elueringsbuffert. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Begränsad proteolys av kandidat SD2 domäner från olika Shroom proteiner. En jämförelse av fyra SD2 domäner från olika Shroom proteiner. (A och B) De angivna SHRM SD2 fragment inkuberades med en koncentrationsgradient av proteaset trypsin 0-1,0%, och resultaten analyserades med SDS-PAGE. Förhållandet i nämnda proteinfragment with de hypotetiska gränser indikeras. (C) SDS-PAGE-analys av begränsad proteolytisk nedbrytning av hans 10 -mRuby2-Shroom SD2 fusionsprotein med hjälp av tidsförloppet metod som beskrivs i protokollet. Reaktionen inträffade med 0,025% trypsin vid rumstemperatur. Digerering av linkern mellan Ruby och Shroom SD2 är snabb och tjänar som en inre kontroll. En förmodad nedbrytningsprodukt som co-renar med His 10 -mRuby2-Shroom SD2 fusionsprotein anges (*). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Observation förändringar i protein beteende med hjälp av nativ gel. (A) 10% Native PAGE som visar effekten av en mutant som förändrar egenskaperna för mRuby2-Shroom SD2. Under dessa förhållanden SHRM SD2 körs som två separata band, medan angivna punkt mutanter inom SD2 visa ett urval av avvikande migrationsmönster. (B) En jämförelse av Shroom SD2-Rock-komplex bildas med användning av olika versioner av Rock och analyserades med naturlig PAGE. Komplex mellan Shroom SD2 och de angivna fragment av Rock-kinas (både coiled-coil proteiner) löstes med naturlig PAGE. Kristaller erhölls för komplex innehållande Rock 788-906 efter många veckor, men komplex innehållande Rock 834-913 kristallise snabbt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Snabb primär screening för kristallisering. (A) En snabb skärm gemensamma kristallisa conditions används för att bedöma beteendet hos proteinprovet i kristallisering prövningar. (B) Exempel på den enkla poäng matrisen att bedöma kristallisa droppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här är utformad för att hjälpa användaren att identifiera domängränser inom stora coiled-coil-proteiner för att underlätta deras kristallisering. Protokollet bygger på en helhets införlivande av en mängd data från beräknings förutsägelser och andra källor för att generera en rad potentiella domängränser. Dessa följs av en uppsättning biokemiska experiment som är snabb och billig, och som används för att ytterligare förfina dessa initiala hypoteser. Med hjälp av denna metod kan användaren snabbt eliminera potentiella proteinfragment som inte är önskvärda, och fokusera mer uppmärksamhet på bättre kandidater och därmed förbättra förutsättningarna för att erhålla kristaller.
Det finns många viktiga steg i denna teknik, men ingen som kritisk för framställning av kristaller som utvecklingen av den ursprungliga uppsättningen hypotetiska domängränser. Detta steg innehåller en mängd beräkningsmetoder, samt information obhålls från litteraturen eller funktionsdata när dessa blir tillgängliga. Försiktighet bör vidtas för att undvika att använda strategin för att finslipa omedelbart ner till den enda "bästa" lösning eftersom det för närvarande ingen metod på plats för att fästa ett kvantifierbart förtroende värde till någon av de förutsägelser. I stället är det bäst används som en metod för att snabbt identifiera en liten uppsättning av möjliga domängränser som måste verifierats experimentellt.
Egenskaperna hos coiled-coil proteiner som kan analyseras med detta protokoll är ganska bred. Ur ett beräknings perspektiv, är styrkan i hoprullade coil förutsägelser begränsad under 20 aminosyror, och som nämns i steg 1.2.1, coiled-coil regioner större än 1000 aminosyror skulle behöva delas upp i flera sektioner för analys av DISOPRED. Vi ser detta senare begränsning som tillfällig eftersom den tas ut av webbservern och kan ändras eftersom metoden uppgraderas i framtiden. Den efterföljande biokemisk analys kan emellertid lidapå olika sätt. Först interna slingor eller regioner som är överkänsliga mot proteaser kan göra provet verkar vara mindre stabil än den faktiskt är. Stabila proteiner som har kluvna slingor eller på annat sätt trasiga av proteaset bör ändå ge en stabil framträdande på naturlig PAGE, vilket är varför det rekommenderas att användaren utforska båda strategierna. Naturlig PAGE kan vara svårt för vissa proteiner, dock antingen för att de är mycket långa och migrera långsamt i gel eller eftersom deras särskilda laddning kan göra dem köra i motsatt riktning ut från gelén helt. I detta fall kan det vara till hjälp att utforska olika buffrande villkor för naturlig PAGE gelsystemet.
Medan fokus i arbetet som presenteras här har varit på stora coiled-coil innehåller proteiner, kan detta protokoll användas för nästan alla protein med mycket få anpassningar. Den primära tillägg för globulära proteiner skulle vara tillägg av domänen förutsägelse program som pDomTHREADER 28 </ sup> eller DomPred 29 för att leta efter domängränser, och tertiära struktur förutsägelser som Phyre2 30 för att förbättra den prediktiva kraften i sekvensanalys. Dessutom finns det många algoritmer tillgängliga för att utföra sekundär struktur förutsägelser och oordnade förutsägelser, och införandet av ytterligare algoritmer kan vara till hjälp. Globulära proteiner har ofta enzymatisk aktivitet eller andra funktionella avläsningar som skulle ge ytterligare viktig information under målval. Vidare kan måttlig eller hög genomströmning tekniker införlivas på lämpligt sätt. Till exempel, billiga system för 1-2 ml kulturer och metallaffinitets reningar i 96-brunnsformat är lätt tillgängliga 31. Slutligen är användningen av robotteknik för att sätta upp ett stort antal kristallisationsexperiment med användning av minimal prov blir rutin, men effektiv drift av robotsystem bygger på beteendet hos väl karaktäriserade proteinprover. Tilläggal ändringar i detta protokoll kan inkludera provtagning en mängd olika affinitetsmarkörer. Många olika fluorescerande taggar är tillgängliga, eller His-, GST, Thioredoxin-, Strep- och MBP- är bland dussintals tillgängliga alternativ om inte behövs eller hjälp en fluorescerande tagg.
När du utför den här proceduren, bör användaren vara uppmärksam på så sätt att mRuby2 taggen kan ha på användarnas proteinet av intresse. Anekdotiska bevis från att använda denna tagg på en mängd olika fusioner stödjer det faktum att mRuby2 ibland kommer att binda ganska hårt till proteinet av intresse, förblir bunden genom flera kromatografiska steg. Detta beteende är naturligtvis inte önskvärt, men oavsiktliga Ruby komplex kan vanligen separeras och avlägsnas kromatografiskt. Det är oklart om detta är ett förkläde liknande beteende har observerats för MBP 32.
Efter att ha fått kristaller, finns det fortfarande många utmaningar som vanligtvis står inför coiled-coil proteiner som inte tas upp i detta protokoll. Det vanligaste är dålig diffraktion kvalitet, antingen på grund av ofullständigt bildade gitter eller anisotropisk diffraktion. Det finns verktyg för att bistå med anisotropisk diffraktion 33, och dessa har varit avgörande för att lösa några coiled-coil strukturer 18,20. Många kristall patologier är tyvärr svåra att övervinna snabbt, därför är det ofta klokt att söka efter ytterligare kristallformer med förbättrade diffraktionsegenskaper. Detta underlättas av robot screening av tusentals betingelser. Alternativt finns det många efterkristallisationstekniker för att förbättra diffraktion kvalitet såsom uttorkning, eller sådd 34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BL21(DE3) Rosetta | Emd Millipore | 70954-3 | |
| BL21(DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | |
| BL21(DE3) Codon Plus | Agilent Technologies | 230245 | |
| Lysozyme | Spectrum Chemical Mfg Corp | L3008-5GM | |
| Ni-NTA resin | Life Technologies | 25216 | |
| SubtilisinA | Spectrum Chemical Mfg Corp | S1211-10ML | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-160 | |
| INTELLI-PLATE 96: | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
| PEG 3350 | Hampton research | HR2-591 | |
| PEG 8000 | Hampton research | HR2-515 | |
| PEG 400 | Hampton research | HR2-603 | |
| PEG 4000 | Hampton research | HR2-605 | |
| pcDNA3.1-Clover-mRuby2 | Addgene | 49089 | |
| Overnight Express Autoinduction System 1 | Emd Millipore | 71300 | |
| Lysogeny Broth powder | ThermoFisher Scientific | 12795027 |
References
- Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
- Chapman, T. Protein purification: pure but not simple. Nature. 434 (7034), 795-798 (2005).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. Predicting coiled coils from protein sequences. Science. 252 (5009), 1162-1164 (1991).
- Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils. J Struct Biol. 137 (1-2), 41-53 (2002).
- Lupas, A. N., Gruber, M. The structure of alpha-helical coiled coils. Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).
- Hernandez Alvarez, B., et al. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Eng Des Sel. 21 (1), 11-18 (2008).
- Slabinski, L., et al. The challenge of protein structure determination--lessons from structural genomics. Protein Sci. 16 (11), 2472-2482 (2007).
- Slabinski, L., et al. XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
- Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure. Curr Biol. 13 (24), 2125-2137 (2003).
- Hildebrand, J. D. Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network. J Cell Sci. 118 (Pt 22), 5191-5203 (2005).
- Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins. J Biol Chem. 281 (29), 20542-20554 (2006).
- Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction. Dev Dyn. 239 (7), 2078-2093 (2010).
- Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis. Mol Biol Cell. 22 (6), 795-805 (2011).
- Das, D., et al. The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice. Biol Open. 3 (9), 850-860 (2014).
- Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA. J Biol Chem. 279 (8), 7098-7104 (2004).
- Mohan, S., et al. Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology. PLoS One. 8 (12), e81075 (2013).
- Mohan, S., et al. Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction. Mol Biol Cell. 23 (11), 2131-2142 (2012).
- Tu, D., et al. Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I. PLoS One. 6 (3), e18080 (2011).
- Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol. 7, 539 (2011).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue. Anal Biochem. 48 (2), 617-620 (1972).
- Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Jungbauer, A., Hahn, R. Ion-exchange chromatography. Methods Enzymol. 463, 349-371 (2009).
- Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography. J Chromatogr A. 1132 (1-2), 98-108 (2006).
- Giege, R. A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day. FEBS J. 280 (24), 6456-6497 (2013).
- Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination. Bioinformatics. 25 (14), 1761-1767 (2009).
- Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure. Protein Sci. 11 (12), 2814-2824 (2002).
- Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).
- Elsliger, M. A., et al. The JCSG high-throughput structural biology pipeline. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66 (Pt 10), 1137-1142 (2010).
- Bach, H., et al. Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies. J Mol Biol. 312 (1), 79-93 (2001).
- Strong, M., et al. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8060-8065 (2006).
- Heras, B., Martin, J. L. Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 9), 1173-1180 (2005).
