Introduction
Оборудование для определения структуры с помощью рентгеновской кристаллографии внес фундаментальный вклад в каждой области современной биологии; обеспечивая атомный вид макромолекул, которые поддерживают жизнь и как они взаимодействуют друг с другом в различных контекстах; что позволяет нам понять механизмы, которые вызывают болезни, и предоставляя возможность рационально разработать препараты для лечения болезни. Кристаллографии уже давно доминирующая экспериментальная методика определения макромолекулярной структуры, и в настоящее время составляет 89,3% от структурной базы данных (www.rcsb.org). Этот метод имеет много преимуществ, в том числе потенциал очень высокой разрешающей способности, способность визуализировать макромолекулы с широким диапазоном размеров, относительно легкого сбора данных, а также возможность представить, как макромолекула взаимодействует с растворителем, а в качестве лигандов.
Несмотря на многочисленные технологические улучшения в экспрессии рекомбинантного белка 1,2, PURфикация 3, и молекулярной биологии используются для создания этих систем 4, самым большим препятствием в процессе кристаллографической остается возможность выращивать кристаллы качества дифракции. Это особенно верно для белков, которые содержат большие домены биспиральных. Было подсчитано , что почти 5% всех аминокислот найдены в пределах намотанных катушек 5,6, что делает это очень распространенная структурная особенность 7, но эти белки часто более трудно очистить и кристаллизуются , чем глобулярных белков 8-10 , Это дополнительно усугубляется тем, что биспиральных домены часто встречаются в контексте более крупного белка, поэтому правильно предсказывать границы этих областей имеет решающее значение, чтобы избежать включения неструктурированной или гибкой последовательности, которая часто вредно для кристаллизации.
Здесь мы представляем концептуальную основу объединения веб-вычислительный анализ с experimentaл данные со скамейки, чтобы помочь пользователям через направляющие на начальных этапах кристаллографической процесса, включая: как выбрать фрагмент белка (ов) для структурных исследований, а также как подготовить и охарактеризовать образцы белка до попыток кристаллизации. Мы фокусируем наш анализ на двух белков, содержащих большие домены биспиральных, Shroom (ШРМ) и Rho-киназы (Rock). Эти белки были выбраны , поскольку они оба содержат домены биспиральных и , как известно, образуют биологически активные сложные 11-16. Shroom и Rho-киназы (Rock), по прогнозам, содержат ~ 200 и 680 остатков биспиральных соответственно, многие части которых были охарактеризованы структурно 17-20. Описанный здесь способ обеспечивает рационализировать рабочий процесс, чтобы быстро идентифицировать фрагменты биспиральных, содержащие белок, которые будут пригодны для кристаллизации, тем не менее, способы, описанные могут быть легко адаптированы для большинства белков или белковых комплексов или модифицированы включением высокой пропускной способностью approaчес как доступный. И, наконец, эти методы, как правило, недороги и могут быть выполнены пользователями практически на всех уровнях опыта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Схема концептуальной основы или рабочий процесс описан на рисунке 1 для справки. Протокол может быть разбит на четыре этапа: вычислительные или последовательности предсказаний, основанных, экспрессии белка и очистки, биохимических характеристик и кристаллизации. Примеры, показанные домены анализа Shroom SD2 и / или Shroom-Рок комплексы, но могут быть использованы с любым белком.
1. С помощью установления веб-инструментов для генерации Численные предсказания границ доменов биспиральных
- Соберите эволюционно разнообразный набор Последовательности гомологов.
- Перейти к www.uniprot.org и введите в Shroom в верхней строке поиска.
- Выбор последовательности для загрузки, установив флажок рядом с их номером. Последовательности со звездой показывают последовательности с помощью UniProt рассмотрены и, как правило, более надежны. Позаботьтесь, чтобы убедиться, что все последовательности являются полными и точными.
- Сохранение выбранных Sequences, нажав кнопку Загрузить.
- Совместите коллекцию Shroom последовательностей с использованием Clustal-Omega 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Нажмите на кнопку "Обзор", чтобы выбрать файл с последовательностями Shroom, а затем нажмите кнопку Отправить.
- После завершения юстировки, нажмите кнопку "Загрузить файл" Выравнивание.
- Откройте выравнивание множественный последовательность, генерируемая в 1.1.5 с помощью Jalview (Файл | Input Alignment | Из файла). В новом окне выравнивания, цвет по идентичности (Цвет | процент идентичности).
- Подсчитайте предсказания вторичной структуры, предсказания гибкой или неупорядоченной последовательности, и предсказаны областей биспиральных в белка (белков), представляющих интерес.
- Перейти к http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi~~pobj, для расчета прогнозов биспиральных. Скопируйте и вставьте последовательность в последовательность Box и нажмите кнопку Отправить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Данный анализ может занять несколько часов, чтобы компLete. Так как Shroom последовательности достаточно велики, последовательности, возможно, должны быть разделены на блоки менее чем 1000 аминокислот, чтобы соответствовать размеру ограничения на веб-сервере. При анализе Shrm2, рекомендуется, что С-концевые аминокислоты 1000 используются в качестве В этом разделе содержит домен SHRM SD2, который, как известно, содержат области биспиральных. При повторении этого анализа с другими белками, рекомендуется использовать белковые последовательности полной длины, когда это возможно. Если это не вариант, использовать самый большой фрагмент можно или рассекать последовательность, основанную на известных биохимических или функциональных данных. - Перейти к http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi~~pobj, для расчета прогнозов биспиральных. Скопируйте и вставьте последовательность в последовательность Box и нажмите кнопку Отправить.
- Перейти к http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi~~pobj, для расчета прогнозов биспиральных. Скопируйте и вставьте последовательность в последовательность Box и нажмите кнопку Отправить.
- Объединить результаты шагов 1.1 до версии 1.2.2 в единый всеобъемлющий аннотирования последовательности Shroom.
Примечание: Настоятельно рекомендуется также включать в себя любые и все соответствующие Iнформация, что можно почерпнуть из литературы или других источников о функции белка или очистки на этой стадии. - Используя эту всеобъемлющую аннотированный последовательность, предсказать границы домена (или ряд возможных границ) для белка, пытаясь максимизировать сохранение и предсказал структурные особенности при минимизации количества неупорядоченных или гибкой последовательности. Если известно, в результате чего белок должен сохранить функциональные свойства, представляющие интерес.
2. Экспресс и очисти Белки с границами домена намеченными в разделе 1
Примечание: Целью данного раздела является использование серии быстрых и легко поддающихся количественной оценке анализов для выявления границ гипотетические доменов, сгенерированные в разделе 1.
- Используя стандартные методы молекулярной биологии, генерируют плазмиду экспрессии с требуемой кодирующей последовательностью в кадре внутри Его 10 -mRuby2-ХН2 плазмиды (смотри рисунок 3 для векторного отображения ай дополнительные детали).
- Уровни экспрессии испытаний для каждой плазмиды экспрессии с использованием BL21 (DE3) E.coli или другого подходящего штамма экспрессии в autoinduction сред 1 при комнатной температуре в течение 18-24 ч.
- Transform плазмид экспрессии, а также пустой контроль плазмиды в BL21 (DE3), следуя инструкциям, которые пришли с клетками или с использованием надежного протокола преобразования, например, один здесь (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial~~HEAD=pobj -преобразованием /).
- Из свеже преобразованного пластины, выбрать одну колонию и вырастить закваски 5 мл при 37 ° С в течение ночи в лизогении бульоне (LB) средств массовой информации с 34 мкг / мл канамицина.
- На следующий день, гранулы культуры и мыть осадок со свежей LB.
- Добавьте закваску в 50 мл autoinduction среды с 34 мкг / мл канамицина. Дайте культуре расти до насыщения при любой комнатной температуре или 37 ° С. Как правило, растут в течение ~ 18-24 ч.
- Пелле клетокs и замораживать в результате гранулы клеток при -80 ° С до бесконечности до очистки.
- Сравните целые экстракты клеток из каждого штамма экспрессии и пустого векторного управления с помощью SDS-PAGE для определения штамма, который наиболее эффективно продуцирует желаемый слитый белок. Для его 10 -mRuby2-Shroom SD2 слитых белков, запустить 10% SDS-PAGE гели при 180 В в течение ~ 50 мин или пока фронт красителя достигает нижней части геля 22.
- Пятно гель с Кумасси синим , чтобы визуализировать суммарные клеточные белки , в пределах каждого штамма 23.
- Выполните начальную стадию аффинной хроматографии на каждого штамма, который успешно экспрессированы mRuby2-слитого белка. Как правило, выполняют очистку шаги 2.3.2-2.3.7 при комнатной температуре, если белок не будет извлечь выгоду из изменившихся условий, таких как очистка при 4 ° С.
- Оттепель гранулы клеток из стадии 2.2.5.
- Ресуспендируют каждый осадок клеток в 1,5 мл буфера для лизиса (10% глицерина, 500 мМ NaCl, 40мМ имидазола, 20 мМ Трис рН 8,0, 1 мМ бета-меркаптоэтанола). Дополнение лизиса буфер с ингибиторами протеазы в зависимости от обстоятельств.
- Добавить 30 мкл 10 мг / мл лизоцима и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин. Разрушать ультразвуком, следуя инструкциям для инструмента используются.
- Перенести в 1,5 мл пробирку и центрифугируют в настольную центрифугу в течение 30 мин при 14000 х г в гранулах нерастворимого материала или unlysed клетки. Сохранить как супернатанта и осадка для последующего анализа с помощью SDS-PAGE.
- Выполните очистку никеля сродства, инкубирование растворимую фракцию со 100 мкл Ni-NTA бусинок. Инкубируйте бусины с растворимой лизата в течение 5-10 мин, переворачивая несколько раз, чтобы смешать шарики.
- Центрифуга при 800 мкг в течение 30 секунд в настольной центрифуге для осаждения шариков. Следуйте этим путем промывки Осадок 3-5 раз буфером для лизиса для очистки от неспецифических примесей.
- Элюировать рубин слитый белок из гранул с буфером для лизиса с добавлением 1M имидазола.
- С помощью SDS-PAGE, чтобы сравнить поведение Его-mRuby2-Shroom белков в "быстрой и грязной" очистки выше.
3. Охарактеризуйте белка Образец для выявления тех, с преимущественными свойствами
- С помощью набора спектрофотометре при длине волны 280 нм для определения концентрации белка слияния рубинового, а затем оценить однородность образца путем загрузки 1-5 мкг слитого белка на нативного PAGE гель 24. Выполнить гель на 10% нативный PAGE при 4 ° С в течение 140 мин при 175 В.
- Изображение родной СТР с помощью тепловизора оборудованный для визуализации флуоресценции, наблюдая, где mRuby-меченый слитый мигрирует в этом анализе.
Примечание: Будьте осторожны, чтобы наблюдать за слитый белок, который застрял в скважине, как этот белок, вероятно, агрегируются. Если флуоресцентный тепловизор не доступен, часто можно визуализировать и изображения сосредоточены образцы Руби меченый белок под черным светом или с коробкой ультрафиолетового света.
- Изображение родной СТР с помощью тепловизора оборудованный для визуализации флуоресценции, наблюдая, где mRuby-меченый слитый мигрирует в этом анализе.
- Выполните ограниченный протеолиз, чтобы идентифицировать стабильно сложенных домены. Выдержите 95 мкл Рубин-ШРМ SD2 плавления при ~ 1 мг / мл с 5 мкл 0,025% субтилизина А.
- Пример реакции при временных точках 0, 0,5, 2, 5, 15, 60, и 120 мин, удаление 10 мкл из реакционной смеси для каждой временной точки и визуализации хода реакции с помощью SDS-PAGE с использованием акриламидный гель 15% ,
- Пятно с Кумасси синим, как на этапе 2.2.7 и оценить, могут ли быть идентифицированы протеаза видов устойчивые.
- Интеграция данных из эффективности очистки, поведения в родной страницы, а также ограниченного протеолиза на частично очищенных слитых белков mRuby2-Shroom в комплексную оценку общего поведения этих белков в растворе.
- (Необязательно) Если подходящий функциональный анализ доступен, проверки активности в этой точке.
4. выпускать продукцию высокого качества кристаллов биспиральных SD2Домен от Shroom
Примечание: Все шаги в разделе 4.1 выполняются при комнатной температуре, если белок не выиграют от очистки при различной температуре, обычно от 4 ° C.
- Используя 50 мл наросты в качестве грубой оценки экспрессии и очистки потенциала, выполнять крупномасштабные выражения mRuby2-Shroom SD2 с целью достижения 5-20 мг полностью очищенного образца. Как правило 2 л культуры обеспечивает адекватный исходный материал. После гранул роста клеток центрифугированием при 8000 х г в течение 10 мин.
- Ресуспендируют осадок от роста 2 л в буфере для лизиса, как и раньше, с помощью файлов ~ 2 мл лизис на грамм замороженного осадка клеток при использовании лизоцима для лизиса. В качестве альтернативы, ресуспендируют в ~ 8 мл / г окатышей, если с помощью гомогенизатора или французская пресса. Гранул клеточного дебриса путем центрифугирования при 30000 х г в течение 30 мин.
- Пакетный связать растворимой фракции от изложенных в разделах 4.1.1, используя 10 мл Ni-NTA смолы. Разлить в соответствующую колонку тяжестии позволяют несвязанные белки стечь.
- Промыть смолу 3-5 раз с 40 мл буфера для лизиса, с последующей промывкой буфером для лизиса, дополненной до 1 М NaCl.
- Промыть смолу с 40 мл буфера для лизиса, дополненного 80 мМ имидазола.
- Элюции слитого белка рубин-Shroom с 40 мл буфера для лизиса, дополненных до 1 М имидазолом. Вручную фракционирования элюированного белка в 4-10 мл фракции.
- Confirm фракции, содержащие рубин-Shroom слитого белка с использованием 10% SDS-PAGE.
- Диализировать соответствующие фракции (обычно 2-4 фракций) в 8% глицерина, 250 мМ NaCl, 15 мМ имидазола, 20 мМ Трис рН 8,0, 1 мМ β-ME, используя 6-8 кДа MWCO диализной трубки. Добавляют 1 мг TEV протеазы для каждого 25-50 мг слитого белка. Диализировать в течение ночи при комнатной температуре при медленном перемешивании.
- Очистка Повторите никелевого сродства шаги 4.1.2. в разделе 4.1.6. Домен Shroom СД2 должен теперь оставаться в несвязанной фракции в то время как его 10 -mRuby2 будет оставаться связанным ссмолу и будет найден в элюированных фракций. Повторите это с помощью 12% SDS-PAGE окрашивания кумасси синим.
- Диализировать фракций, содержащих домен Shroom SD2 в 8% глицерина, 100 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 8,0, 5 мМ бета-меркаптоэтанола буфера в течение ночи.
- Выполнение обменной хроматографии 25 аниона с использованием FPLC и элюируя градиентом NaCl от 0,1-1,0 М NaCl. Анализ фракций с помощью 12% SDS-PAGE.
- Используя спиновый концентраторы (MWCO 10 кДа или более в зависимости от белка исследуемой), концентрат Пиковые фракции до ~ 0 мг / мл, а затем выполнить вытеснительной хроматографии 26, анализируя пиковые фракции с помощью 12% SDS-PAGE.
- Бассейн пиковые фракции и диализ в 20 мМ Трис рН 8,0, 50 мМ NaCl, 2% глицерина, 1 мМ β-ME и концентрируют до 10 мг / мл перед кристаллизацией.
Дополнительно: Во время этого этапа удаления 5 мкл образцов при концентрации 1, 2, 5, и 10 мг / мл в течение концентрирования пробы.Запуск родной загрузки страницы 2-5 мкл каждого образца, чтобы посмотреть на поведение образца во время этого шага.
- Экран небольшой массив из 12 условий, чтобы определить оптимальную концентрацию белка для кристаллизации испытаний. Состав этих условий описана на рисунке 7.
- Использование 24-луночного сидя падение кристаллизации подносы, выполняют кристаллизации испытаний с использованием метода диффузии в паровой фазе, пипетирования 500 мкл каждого из 12 условий в отдельные лунки с последующим каплями, которые изначально содержат по 1 мкл скважины раствора и 1 мкл образца белка на покровных стеклах , Пожалуйста , см 27 для получения дополнительной информации по этой методике.
- Быстро запечатать поднос с лентой и ясном переместить лоток в контролируемой среде подходящей температуры, свободной вибрации. Температура, используемая может варьироваться, но 4 ° С, 16 ° С, и 20 ° C весьма распространены.
- Осмотрите капли в лотках в течение следующих 3 днейAYS с помощью микроскопа со скоростью до 100х. В конце 3-дневный срок, оценка каждую каплю, как не содержащий осадков (сброс), небольшие осадки, сильные осадки (коричневый), или кристаллы. Подходящая концентрация белка должна содержать не более 6 тяжелых осадков.
- Использование концентрации белка идентифицированного в разделе 4.2, экран широкий диапазон коммерчески доступных экранов кристаллизации. Использование жидкой обработки или кристаллизации робота значительно ускоряет этот процесс, в то же время сводя к минимуму ошибки в каплях. Это требует гораздо меньшего количества белка, а также, что позволяет пользователю экран больше условий с помощью одного образца.
- Улучшение исходных условий, определенных с широких экранов путем систематического изменения каждой из переменных внутри капли кристаллизации с использованием 24-луночного скрининге лотков, как и раньше.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Диаграмма , изображающая рабочего процесса , используемого в данной системе показана на фиг.1 , и включает в себя три основных этапа. Компьютерный анализ последовательности используется для разработки гипотезы о границах домена белка биспиральных интереса. Примером аннотированный анализа домена Shrm2 SD2 показан на рисунке 2. На этой диаграмме, цель состояла в том, чтобы определить возможные границы домена для консервативном домене на С-конце регулятора цитоскелета Shroom называется СД2. Из этого анализа было генерировались три различных набора границ гипотетических доменов, содержащих фрагменты биспиральных, которые охватывающих всю консервативную SD2 или минимальные фрагменты вблизи С-конца, который в конечном итоге в качестве лучших кандидатов для кристаллизации. Кандидаты , определенные из анализа последовательностей затем быстро проверены в малом масштабе с использованием слитого белка с mRuby2 (рис 3) FOг эффективный анализ. Представитель малого масштаба (50 мл культуры) очищений из двух его 10 -mRuby2-меченые белки показаны на рисунке 4. На этом чертеже поведение нерастворимого белка легко просматривается по сравнению с его растворимой аналог. Плохо выражающий или нерастворимый белок слитые легко и быстро идентифицированы этим способом. Биохимические анализы фрагментов белка путем ограниченного протеолиза, показаны на рисунке 5 для множества фрагментов с использованием засыхают системы Ruby , описанной или изолированным и очищенным доменами Shroom SD2. На рисунке 5А, два варианта мыши SHRM SD2 , соответствующих границам гипотетических доменов # 2 и # 1 на рисунке 3, расщепляли с использованием градиента концентрации протеазы (0-1,0%) в течение 30 мин при комнатной температуре. Оба они были эффективно разлагаются на множество более мелких продуктов при умеренных концентрациях фермента. Рисунок 5B показывает Сэмуе эксперимент , проведенный с использованием гипотетическую граничную # 3 из Drosophila ШРМ SD2. Этот белок сделал кристаллизоваться и его структура была описана 19. Протеолитические анализ также может быть полезен при изучении рубиново-фьюжн, как генерируется из протокола выше. Как показано на рисунке 5С, слитый белок рубиновый с человеческим Shrm2 SD2 (1427-1610) расщепляют с высокой концентрацией (0,025%) от неспецифической субтилизина протеазы при комнатной температуре в указанные временные точки. Здесь линкер между Рубином и ШРМ сразу же расщепляется, как можно было бы ожидать. Кроме того, мелкие продукты были сформированы с указанием этот белок имеет два других чувствительных к протеазе областей, тем не менее, продукты деградации, которые были произведены в течение 2 мин, оставались в основном без изменений в течение всего остального эксперимента, указывающей белка на самом деле достаточно стабильным.
Дополнительный подход показан с использованием собственных Analys PAGEнаходится на рисунке 6. На рисунке 6A, Ruby-меченый человек ШРМ СД2 (1427-1610), а также белка , содержащих указанные точечные мутации в пределах ШРМ анализируют с помощью нативного PAGE. В этом эксперименте белок дикого типа (который образует кристаллы) проходит в виде двух отдельных полос, в то время как три мутанта, которые не кристаллизуются имеют резко различное поведение. Для того, чтобы продемонстрировать , что система также может быть полезным на белковых комплексов, разнообразие Shroom-Рок комплексов были проанализированы с помощью нативного PAGE на фиг.6В. В этом случае тот же фрагмент человеческого Shrm2 SD2 (1427-1610) был использован, чтобы помочь прояснить анализ, в то время как были использованы различные фрагменты человеческого Rock. Такой подход предположил, что комплексы, образованные с помощью Rock 700-906 и 746-906 было несколько видов, были вязкий, и менее однородным. Комплексы использующие 788-906 были улучшены, хотя и не резко, и этот вид был способен кристаллизоваться, хотя кристаллы потребовалось много недель, чтобы сформировать и противтойчивое деградировали Рок белка. Комплексы, генерируемые с помощью Rock 834-913 образовали единое и более однородные виды на геле и легко кристаллизуется в течение ночи. На рисунке 7 показан набор общих условий кристаллизации, которые используются для информирования о поведении образца белка в кристаллизационных испытаниях, и может быть использовано в целом с любым белком. В идеале, будет получена смесь четких и осаждающих условий. Белки, которые не образуют осадка требуют высоких концентраций или более жесткие условия на буферизацию в то время как те, которые выпадают в осадок во многих условиях следует использовать при более низкой концентрации белка или с условиями, буферные, которые способствуют растворимости белка.
Рисунок 1: Рабочий процесс Диаграмма. Обобщенная схема, изображающая интеграции анализа вычислительной последовательности и биохимических идругие методы мокрой лаборатории в комплексную стратегию для очерчивания границ доменов и идентификации фрагментов белков для кристаллизации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Аннотированный анализ последовательности для биспиральных SD2 области от Shroom. Наложение вычислительного анализа для домена Shroom SD2, в том числе множественного выравнивания последовательностей, порожденного CLUSTAL омега и окрасили идентичности последовательностей в пределах Jalview (шаг 1.1). Также прогнозируются вторичную структуру, неупорядоченные предсказания последовательности и биспиральных предсказания домена Shroom SD2 (шаг 1.2). Границы Гипотетический домена (этап 1.3) обозначены как и наблюдаемые границы и вторичная структураэлементы как показали последующего кристаллографического анализа 19. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Схема Его системы 10 -mRuby2-выражения. (А) Схематическое вектора экспрессии Его 10 -mRuby2-ХН2 вектор , используемый в данном исследовании. (В) Схема сайт множественного клонирования из этого вектора. Последовательностей, кодирующих белок, как правило, вставляется в этот вектор с помощью BamHI и EcoRI сайты клонирования. Крайнее С-конец белка mRuby2 показан красным цветом, сайт расщепления протеазы ТРВ указывается в скобках и с сайтом расщепления, показанного в виде красного треугольника. Последовательность линкера между mRuby2 и сайтом TEV показан в голубой цвет.Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Представительные мелкомасштабные очищений из двух mRuby2 помечено слитые белки. (А) Изображение образцов бактериальной экспрессии культуры рубинового SHRM SD2 или неродственного рубинового слитым белком , известным как нерастворимые сфотографированы. Отдельная культура экспрессии белка без рубиново-тега показан для сравнения. (В) Растворимая фракция из культур выше были обследованы следующие лизиса и центрифугировали при 30000 х г в течение 30 мин, демонстрируя визуализацию растворимого рубин-SHRM SD2. (С) Изображение гранул Ni-NTA после связывания и последующих стадий промывки , указывающие , что рубин-SHRM СД2 является иммобилизации набусы. (D) Образцы промывки и элюции шагов , как описано в пунктах 2.3.6 и 2.3.7 показывают , что слияние Рубин-ШРМ SD2 остается связанным со смолой , в то время как в присутствии до 80 мМ имидазола и эффективно элюируют с колонки с 1 М имидазольного буфера для элюции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Ограниченный протеолиз кандидата SD2 доменов из различных белков Shroom. Сравнение четырех доменов SD2 из различных белков Shroom. (А и В) указанные фрагменты SHRM SD2 инкубировали с градиентом концентрации трипсина протеазы от 0 до 1,0% , а результаты анализировали с помощью SDS-PAGE. Отношение этого фрагмента белка остроумияч обозначены гипотетические границы. (C) SDS-PAGE анализ ограниченного протеолитического расщепления Его слитого белка 10 -mRuby2-Shroom SD2 с использованием метода времени курса , описанного в протоколе. Реакция происходит с 0,025% трипсина при комнатной температуре. Расщепление линкера между Рубином и Shroom SD2 является быстрым и служит в качестве внутреннего контроля. Предположительного продукт разложения , что сотрудничество способствует очищению с Его 10 -mRuby2-Shroom SD2 слитого белка обозначен (*). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Наблюдение за изменениями в поведении белка с помощью родных гель. (A) 10% коренных СТР демонстрирует эффект мутанта , который изменяет свойства mRuby2-Shrooм СД2. В этих условиях ШРМ SD2 работает как две дискретные полосы, а указанные мутанты точка внутри SD2 показывают диапазон аберрантных моделей миграции. (B) Сравнение Shroom SD2-Рок комплексов формируются с использованием различных версий Rock и анализировали с помощью нативного PAGE. Комплексы между Shroom SD2 и указанных фрагментов Рок-киназы (оба биспиральных белки) были разрешены нативного ПААГ. Кристаллы были получены для комплекса, содержащего 788-906 Rock после многих недель, но комплекс, содержащий Rock 834-913 быстро кристаллизуется. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7: Быстрый первичный экран для кристаллизации. (A) Быстрый экран общей кристаллизации соnditions используется для оценки поведения образца белка при кристаллизации испытаний. (B) Примеры простой матрицы балльной оценки кристаллизации капель. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь, предназначен, чтобы помочь пользователю определить границы доменов в пределах больших белков биспиральных для облегчения их кристаллизации. Протокол основан на целостном включение разнообразных данных из вычислительных предсказаний и других источников, чтобы генерировать ряд возможных границ доменов. За ними следуют набор биохимических экспериментов, которые быстро и недорого, и используются для дальнейшего уточнения этих исходных гипотез. Используя этот подход, пользователь может быстро устранить потенциальные фрагменты белков, которые являются нежелательными, и уделять больше внимания на лучших кандидатов, тем самым улучшая перспективы получения кристаллов.
Там не много важных шагов в рамках этой методики, тем не менее, ни один жизненно важными для производства кристаллов, как развитие начального набора границ гипотетических доменов. Этот шаг включает в себя различные вычислительные подходы, а также информацию Obшись из литературы или функциональных данных при их наличии. Следует соблюдать осторожность, чтобы избежать использования стратегии немедленно заточить до единого "лучшего" решения, поскольку нет в настоящее время ни один метод на месте, чтобы прикрепить измеримое значение доверия к любому из предсказаний. Вместо этого, лучше всего использовать в качестве способа быстро определить небольшой набор возможных доменных границ, которые должны быть проверены экспериментально.
Свойства биспиральных белков, которые могут быть проанализированы с этим протоколом весьма широк. С точки зрения вычислительной, сила предсказаний биспиральных ограничена ниже 20 аминокислот, и, как упоминалось в пункте 1.2.1, регионы биспиральных больше, чем 1000 аминокислот, должны были бы быть разбита на несколько разделов для анализа с помощью DISOPRED. Мы считаем, что это позже ограничение, как временное, как это накладывается на веб-сервер и может меняться, так как метод модернизирована в будущем. Последующее биохимический анализ однако, может пострадатьразличными способами. Во-первых, внутренние петли или области с повышенной чувствительностью к действию протеаз может сделать образец, как представляется, менее стабильны, чем на самом деле. Стабильные белки, которые расщепляются петли или иным образом изрубленными протеазы должны еще дать стабильный вид на родной СТР, поэтому рекомендуется, чтобы пользователь изучить обе стратегии. Родной страница может быть трудным для некоторых белков, однако, либо потому, что они очень долго и медленно мигрируют в гель или потому, что их особый заряд может заставить их работать в противоположном направлении из геля полностью. В этом случае может оказаться полезным для изучения различных буферных условий для родной системы PAGE гель.
В то время как в центре внимания работы, представленные здесь, были на больших, содержащих белки биспиральных, этот протокол может быть использован практически для любого белка с очень мало приспособлений. Основным дополнением для глобулярных белков будет добавление программного обеспечения предсказания домена , таких как pDomTHREADER 28 </ SUP> или DomPred 29 искать доменных границ и третичной структуры предсказания , такие как Phyre2 30 для повышения предсказательной способности анализа последовательности. Кроме того, существует множество алгоритмов, доступных для выполнения вторичных предсказания структуры и неупорядоченные предсказания, и включение дополнительных алгоритмов может быть полезным. Глобулярные белки часто обладают ферментативной активностью или другими функциональными отсчеты, которые обеспечили бы важную дополнительную информацию при выборе мишени. Кроме того, с высокой или средней пропускной способности методы могут быть включены в зависимости от обстоятельств. Например, недорогие системы для 1-2 мл культур и металла сродства очисток в форматах 96-луночных легко доступны 31. И, наконец, использование робототехники для создания большого количества экспериментов кристаллизации с использованием минимального образца становится рутина, но эффективная работа роботизированных систем основана на поведении хорошо охарактеризованных образцов белка. прибавлениеаль модификации данного протокола может включать в себя выборку различные аффинные метки. Много различных метки люминесцентные доступны, или His-, GST-, Thioredoxin-, септический и MBP- Среди множества доступных вариантов, если флуоресцентная метка не требуется или полезно.
При выполнении этой процедуры пользователь должен помнить о том, что тег mRuby2 может иметь на белке пользователей, представляющих интерес. Неподтвержденная с помощью этого тега на множестве различных слитых поддерживает тот факт, что mRuby2 иногда связывать довольно плотно к интересующему белку, оставаясь связанным через несколько хроматографических стадий. Такое поведение, очевидно, нежелательно, но непреднамеренные Рубиновые комплексы могут, как правило, можно отделить и удалить хроматографическим путем. Пока неясно , является ли это шаперонная типа поведения , как наблюдалось для MBP 32.
После получения кристаллов, Есть еще много проблем, которые обычно сталкиваются с ИСПLED-спиральные белки, которые не рассматриваются в данном протоколе. Наиболее распространенным является низкое качество дифракции, либо из-за несовершенной образуются решетки или анизотропной дифракции. Есть инструменты для оказания помощи при анизотропной дифракции 33, и они были важны для решения некоторых структур биспиральных 18,20. Многие кристаллические патологиями, к сожалению, трудно преодолеть быстро, поэтому часто целесообразно искать дополнительные кристаллических форм с улучшенными свойствами дифракции. Этому способствует роботизированной скрининга тысяч условий. В качестве альтернативы существует множество методик после кристаллизации для улучшения качества дифракции , такие как обезвоживание, или посевом 34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BL21(DE3) Rosetta | Emd Millipore | 70954-3 | |
| BL21(DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | |
| BL21(DE3) Codon Plus | Agilent Technologies | 230245 | |
| Lysozyme | Spectrum Chemical Mfg Corp | L3008-5GM | |
| Ni-NTA resin | Life Technologies | 25216 | |
| SubtilisinA | Spectrum Chemical Mfg Corp | S1211-10ML | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-160 | |
| INTELLI-PLATE 96: | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
| PEG 3350 | Hampton research | HR2-591 | |
| PEG 8000 | Hampton research | HR2-515 | |
| PEG 400 | Hampton research | HR2-603 | |
| PEG 4000 | Hampton research | HR2-605 | |
| pcDNA3.1-Clover-mRuby2 | Addgene | 49089 | |
| Overnight Express Autoinduction System 1 | Emd Millipore | 71300 | |
| Lysogeny Broth powder | ThermoFisher Scientific | 12795027 |
References
- Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
- Chapman, T. Protein purification: pure but not simple. Nature. 434 (7034), 795-798 (2005).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. Predicting coiled coils from protein sequences. Science. 252 (5009), 1162-1164 (1991).
- Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils. J Struct Biol. 137 (1-2), 41-53 (2002).
- Lupas, A. N., Gruber, M. The structure of alpha-helical coiled coils. Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).
- Hernandez Alvarez, B., et al. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Eng Des Sel. 21 (1), 11-18 (2008).
- Slabinski, L., et al. The challenge of protein structure determination--lessons from structural genomics. Protein Sci. 16 (11), 2472-2482 (2007).
- Slabinski, L., et al. XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
- Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure. Curr Biol. 13 (24), 2125-2137 (2003).
- Hildebrand, J. D. Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network. J Cell Sci. 118 (Pt 22), 5191-5203 (2005).
- Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins. J Biol Chem. 281 (29), 20542-20554 (2006).
- Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction. Dev Dyn. 239 (7), 2078-2093 (2010).
- Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis. Mol Biol Cell. 22 (6), 795-805 (2011).
- Das, D., et al. The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice. Biol Open. 3 (9), 850-860 (2014).
- Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA. J Biol Chem. 279 (8), 7098-7104 (2004).
- Mohan, S., et al. Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology. PLoS One. 8 (12), e81075 (2013).
- Mohan, S., et al. Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction. Mol Biol Cell. 23 (11), 2131-2142 (2012).
- Tu, D., et al. Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I. PLoS One. 6 (3), e18080 (2011).
- Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol. 7, 539 (2011).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue. Anal Biochem. 48 (2), 617-620 (1972).
- Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Jungbauer, A., Hahn, R. Ion-exchange chromatography. Methods Enzymol. 463, 349-371 (2009).
- Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography. J Chromatogr A. 1132 (1-2), 98-108 (2006).
- Giege, R. A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day. FEBS J. 280 (24), 6456-6497 (2013).
- Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination. Bioinformatics. 25 (14), 1761-1767 (2009).
- Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure. Protein Sci. 11 (12), 2814-2824 (2002).
- Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).
- Elsliger, M. A., et al. The JCSG high-throughput structural biology pipeline. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66 (Pt 10), 1137-1142 (2010).
- Bach, H., et al. Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies. J Mol Biol. 312 (1), 79-93 (2001).
- Strong, M., et al. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8060-8065 (2006).
- Heras, B., Martin, J. L. Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 9), 1173-1180 (2005).
