Introduction
Determinación de la estructura a través de la cristalografía de rayos X ha hecho contribuciones fundamentales a todos los campos de la biología moderna; proporcionar una visión atómica de las macromoléculas que sostienen la vida y la forma en que interactúan unos con otros en una variedad de contextos; lo que nos permite comprender los mecanismos que causan la enfermedad y proporcionar oportunidades para el diseño racional de fármacos para tratar la enfermedad. Cristalografía ha sido durante mucho tiempo la técnica experimental dominante para la determinación de la estructura macromolecular, y en la actualidad representa el 89,3% de la base de datos estructurales (www.rcsb.org). Esta técnica tiene muchas ventajas, incluyendo el potencial de muy alta resolución, la capacidad de visualizar macromoléculas con una amplia gama de tamaños, la recopilación de datos relativamente fácil, y la oportunidad de visualizar cómo la macromolécula interactúa con disolvente, así como ligandos.
A pesar de numerosas mejoras tecnológicas en la expresión de la proteína recombinante 1,2, purification 3, y la biología molecular utilizado para generar estos sistemas 4, el mayor obstáculo en el proceso de cristalográfica sigue siendo la capacidad de crecer cristales de calidad de difracción. Esto ha sido especialmente cierto para las proteínas que contienen grandes dominios de doble arrollamiento. Se ha estimado que hasta un 5% de todos los aminoácidos se encuentran dentro de enrollado de las bobinas 5,6, haciendo de esta una característica estructural muy común 7, sin embargo, estas proteínas son a menudo más difíciles de purificar y cristalizar que las proteínas globulares 8-10 . Esto se complica aún más por el hecho de que los dominios de enrollado de la bobina se encuentran a menudo en el contexto de una proteína más grande, por lo tanto, predecir correctamente los límites de estos dominios es crítico para evitar la inclusión de la secuencia no estructurada o flexible que es a menudo perjudicial para la cristalización.
Aquí presentamos un marco conceptual basado en la web que combina computacional analiza con experil datos de la banca, para ayudar a guiar a los usuarios a través de las etapas iniciales del proceso cristalográfica incluyendo: cómo seleccionar fragmento (s) de proteínas para estudios estructurales, y la forma de preparar y caracterizar muestras de proteínas antes de los intentos de cristalización. Nos centramos nuestro análisis en dos proteínas que contienen grandes dominios de doble arrollamiento, Shroom (SHRM) y Rho-quinasa (Rock). Se eligieron estas proteínas, ya que ambos contienen dominios de doble espiral y son conocidos para formar un complejo biológicamente relevante 11-16. Hongo y Rho-quinasa (Rock) se prevé que contienen ~ 200 y 680 residuos de espiral de la bobina, respectivamente, muchas porciones de las cuales se han caracterizado estructuralmente 17-20. El método aquí descrito proporciona un flujo de trabajo optimizado para identificar rápidamente fragmentos de proteína que contiene espiral de la bobina que va a ser susceptibles para la cristalización, sin embargo, las técnicas descritas pueden ser fácilmente adaptados para la mayoría de la proteína o proteína-complejos o modificados para incorporar approa de alto rendimientoches como disponibles. Por último, estos métodos son generalmente de bajo costo y puede ser realizada por los usuarios en casi todos los niveles de experiencia.
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Protocol
NOTA: Un diagrama del marco conceptual o flujo de trabajo se describe en la Figura 1 como referencia. El protocolo se puede dividir en cuatro etapas: predicciones basadas computacionales o de secuencia, expresión y purificación de proteínas, caracterización bioquímica, y cristalización. Los ejemplos mostrados analizan dominios Shroom SD2 y / o complejos Shroom-Rock, pero se pueden utilizar con cualquier proteína.
1. Uso Establecido herramientas basadas en web para generar predicciones computacionales de los límites del dominio de doble arrollamiento
- Recoge un conjunto de Evolutivamente diverso de homólogos secuencia.
- Ir a www.uniprot.org y el tipo de Shroom en la barra de búsqueda superior.
- Seleccione secuencias de descarga marcando la casilla junto a su número de acceso. Las secuencias con una estrella indican secuencias revisados por Uniprot y son generalmente más fiable. Tener cuidado de asegurarse de que todas las secuencias son completos y exactos.
- Save the s seleccionadosequences haciendo clic en el botón Descargar.
- Alinear la colección de secuencias de Shroom utilizando Clustal-Omega 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Haga clic en el botón "Examinar" para seleccionar el archivo con las secuencias de Shroom y luego haga clic en Enviar.
- Después de la alineación se ha completado, haga clic en el botón "Descargar archivo de alineación".
- Abra la alineación de secuencias múltiples generada en 1.1.5 usando Jalview (Archivo | Entrada de alineación | Desde archivo). Dentro de la nueva ventana de alineación, color de identidad (color | Porcentaje de Identidad).
- Calcular predicciones de estructura secundaria, las predicciones de la secuencia flexible o desordenada, y predijo regiones de doble arrollamiento dentro de la proteína (s) de interés.
- Ir a http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, para calcular las predicciones de doble arrollamiento. Copiar y pegar la secuencia en el cuadro de secuencia y haga clic en Enviar.
NOTA: Este análisis puede tardar un par de horas a complete. Como las secuencias Shroom son bastante grandes, las secuencias pueden tener que ser dividido en bloques de menos de 1.000 aminoácidos para encajar dentro de la restricción de tamaño del servidor web. Al analizar Shrm2, se recomienda que el C-terminal de 1.000 aminoácidos se utilizan como esta sección contiene el dominio SHRM SD2 que se sabe que contienen regiones de doble espiral. Al repetir este análisis con otras proteínas, se recomienda utilizar las secuencias de la proteína de longitud completa que sea posible. Si eso no es una opción, utilice el fragmento más grande posible o diseccionar la secuencia basado en datos bioquímicos o funcionales conocidos. - Ir a http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, para calcular las predicciones de doble arrollamiento. Copiar y pegar la secuencia en el cuadro de secuencia y haga clic en Enviar.
- Ir a http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, para calcular las predicciones de doble arrollamiento. Copiar y pegar la secuencia en el cuadro de secuencia y haga clic en Enviar.
- Combinar los resultados de los pasos 1.1 a 1.2.2 en una sola anotación completa de la secuencia de Shroom.
NOTA: es muy aconsejable incluir también cualquier y todo lo relevantenformación que se puede extraer de la literatura o de otras fuentes acerca de la función de proteínas o purificación en esta etapa. - Usando esta secuencia anotada completa, predecir los límites de dominio (o una serie de posibles límites) para la proteína, tratando de maximizar la conservación y pronosticado características estructurales y reducir al mínimo la cantidad de secuencia desordenada o flexible. Si se conoce, la proteína resultante debe conservar las propiedades funcionales de interés.
2. expresar y purificar proteínas con los límites de los dominios identificados en la Sección 1
NOTA: El objetivo de esta sección es el uso de una serie de ensayos rápidos y fácilmente cuantificables para detectar los límites de dominio hipotéticos generados en la Sección 1.
- El uso de técnicas de biología molecular convencionales, generar un plásmido de expresión con la secuencia de codificación deseada en marco dentro del Su-10 plásmido -mRuby2-XH2 (Ver Figura 3 para el mapa vectorial de unand detalles adicionales).
- Los niveles de expresión de ensayo para cada plásmido de expresión usando BL21 (DE3) de E. coli u otra cepa de expresión adecuado en los medios de autoinducción 1 a temperatura ambiente durante 18 a 24 hr.
- Transformar los plásmidos de expresión, así como un control plásmido vacío en BL21 (DE3) siguiendo las instrucciones que vienen con las células o utilizando robusto protocolo de transformación, tales como la de aquí (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial -transformación/).
- A partir de la placa recién transformado, elegir una sola colonia y hacer crecer un cultivo iniciador 5 ml a 37 ° C durante la noche en caldo Lisogenia (LB) los medios de comunicación con 34 mg / ml de kanamicina.
- Al día siguiente, sedimentar la cultura y lavar el precipitado con LB. fresca
- Añadir el cultivo iniciador a 50 ml de medio de autoinducción con 34 g / ml de kanamicina. Deje que el cultivo crezca hasta saturación a temperatura ambiente oa 37 ° C. Típicamente, crecer durante ~ 18 a 24 hr.
- pellet celulars y congelar los sedimentos celulares resultantes a -80 ° C indefinidamente antes de la purificación.
- Comparación de extractos de células enteras a partir de cada cepa de expresión y el control de vector vacío por SDS-PAGE para determinar la cepa que produce la mayor parte de manera eficiente la proteína de fusión deseada. Para Sus 10 proteínas de fusión -mRuby2-Shroom SD2, ejecute el 10% en geles de SDS-PAGE a 180 V durante ~ 50 min o hasta que el frente del colorante llega a la parte inferior del gel 22.
- Gel de mancha con azul de Coomassie para visualizar las proteínas celulares totales dentro de cada cepa 23.
- Realizar un paso inicial cromatografía de afinidad en cada cepa que expresa la proteína éxito mRuby2-fusión. Por lo general, realice los pasos de purificación 2.3.2-2.3.7 a temperatura ambiente, a no ser que la proteína se beneficiará de las condiciones alteradas tales como la purificación a 4 ° C.
- Descongelar los sedimentos celulares procedentes de la etapa 2.2.5.
- Resuspender cada sedimento de células en 1,5 ml de tampón de lisis (10% de glicerol, NaCl 500 mM, 40imidazol mM, 20 mM Tris pH 8,0, 1 mM beta-mercaptoetanol). Suplemento el tampón de lisis con inhibidores de proteasa, según proceda.
- Añadir 30 l de 10 mg de lisozima / ml y se incuba a temperatura ambiente durante 20 min. Someter a ultrasonidos siguiendo las instrucciones para el instrumento que se utiliza.
- Transferir a un tubo de 1,5 ml y se centrifuga en una centrífuga de mesa durante 30 minutos a 14.000 xg para sedimentar el material insoluble o las células no lisadas. Ahorrar sobrenadante y el sedimento para su posterior análisis mediante SDS-PAGE.
- Realizar la purificación de afinidad de níquel, la incubación de la fracción soluble con 100 l de perlas de Ni-NTA. Se incuban las perlas con lisado soluble durante 5-10 min, invirtiendo varias veces para mezclar los granos.
- Centrifugar a 800 xg durante 30 seg en una centrífuga de mesa para sedimentar las perlas. Siga este por lavado del pellet 3-5 veces con tampón de lisis para limpiar los contaminantes no específicos.
- Eluir la proteína de fusión de rubíes de las perlas con tampón de lisis suplementado con 1imidazol M.
- Utilice SDS-PAGE para comparar el comportamiento de Sus-mRuby2-Shroom proteínas en la purificación "rápida y sucia" por encima.
3. Caracterizar proteína de la muestra para identificar a aquellos con propiedades ventajosas
- Utilice un conjunto espectrofotómetro a 280 nm para medir la concentración de la proteína de fusión Ruby, y luego evaluar la homogeneidad de la muestra mediante la carga de 1-5 g de proteína de fusión en un gel de PAGE nativa 24. Dejar correr el gel nativo PÁGINA 10% a 4 ° C durante 140 min a 175 V.
- Image la PAGE nativa usando un reproductor de imágenes equipado para visualizar la fluorescencia, observando donde la fusión de etiquetado mRuby migra en este ensayo.
NOTA: Tenga cuidado de observar proteína de fusión que se ha quedado atascado en el pozo ya que esta proteína es probable agregada. Si un generador de imágenes de fluorescencia no está disponible, a menudo se puede visualizar y muestras de imagen concentrada de Ruby proteína marcada con una luz de color negro o con una caja de luz UV.
- Image la PAGE nativa usando un reproductor de imágenes equipado para visualizar la fluorescencia, observando donde la fusión de etiquetado mRuby migra en este ensayo.
- Realizar la proteólisis limitada para identificar dominios de forma estable cruzados. Incubar 95 l de Rubí-SHRM SD2 fusión a ~ 1 mg / ml con 5 l de 0,025% Subtilisina A.
- Ejemplo de la reacción a los puntos de tiempo de 0, 0,5, 2, 5, 15, 60, y 120 min, la eliminación de 10 l de la reacción para cada punto de tiempo y la visualización del progreso de la reacción por medio de SDS-PAGE usando un gel de acrilamida al 15% .
- Se tiñen con azul de Coomassie como en el paso 2.2.7 y evaluar si una especie resistente de la proteasa pueden ser identificados.
- Integrar los datos de la eficacia de la purificación, el comportamiento en PAGE nativa, y proteólisis limitada de las proteínas de fusión mRuby2-Shroom parcialmente purificadas en una evaluación exhaustiva del comportamiento global de estas proteínas en solución.
- (Opcional) Si un ensayo funcional adecuado disponible, comprobar si hay actividad en este punto.
4. La producción de cristales de alta calidad de la espiral de la bobina SD2Dominio de Shroom
NOTA: Todos los pasos dentro de la sección 4.1 se realizan a temperatura ambiente a menos que la proteína se beneficiaría de la purificación a una temperatura diferente, por lo general de 4 ° C.
- Utilizando los 50 ml crecimientos como una estimación aproximada de la expresión y el potencial de la purificación, realizar expresiones a gran escala de mRuby2-Shroom SD2 con el objetivo de lograr 5-20 mg de muestra completamente purificado. Típicamente 2 l de cultivo proporciona material de partida adecuado. Después las células de pellets de crecimiento por centrifugación a 8000 xg durante 10 min.
- Resuspender el precipitado del crecimiento 2 L en tampón de lisis como antes, utilizando ~ 2 ml de lisis por gramo de sedimento celular congelado si el uso de lisozima para la lisis. Como alternativa, se vuelve a suspender en ~ 8 ml / g de sedimento si se utiliza un homogeneizador o prensa francesa. Se precipitan los desechos celulares mediante centrifugación a 30.000 xg durante 30 min.
- Lotes une la fracción soluble a partir de 4.1.1 usando 10 ml de resina Ni-NTA. Verter en la columna apropiada gravedady permitir que las proteínas no unidas drenen.
- Lavar la resina 3-5 veces con 40 ml de tampón de lisis, seguido por un lavado con tampón de lisis suplementado con 1 M NaCl.
- resina de lavado con 40 ml de tampón de lisis suplementado con imidazol 80 mM.
- Eluir la proteína de fusión Rubí-Shroom con 40 ml de tampón de lisis suplementado con 1 M imidazol. fraccionar manualmente la proteína eluida en 4-10 ml de fracciones.
- Confirmar fracciones que contienen proteína de fusión Rubí-Shroom utilizando 10% de SDS-PAGE.
- Dializar las fracciones apropiadas (por lo general las fracciones 2-4) en 8% de glicerol, NaCl 250 mM, imidazol 15 mM, 20 mM Tris pH 8,0, β-ME 1 mM, utilizando tubos de diálisis 6-8 kDa MWCO. Se añade 1 mg de proteasa TEV por cada 25-50 mg de proteína de fusión. Se dializa durante la noche a temperatura ambiente con agitación lenta.
- purificación por afinidad de níquel repita los pasos 4.1.2. a 4.1.6. El dominio de Shroom SD2 ahora debe permanecer en la fracción no unida, mientras que el 10 -mRuby2 Su permanecerá unido ala resina y se encuentran en las fracciones de elución. Confirmar esto utilizando 12% de tinción de SDS-PAGE con azul de Coomassie.
- Dializar fracciones que contienen dominio Shroom SD2 en 8% de glicerol, NaCl 100 mM, 20 mM Tris pH 8,0, mM de tampón 5 beta-mercaptoetanol durante la noche.
- Se realiza una cromatografía de intercambio aniónico 25 usando un FPLC, y eluyendo con un gradiente de NaCl 0,1 a 1,0 M NaCl. Analizar fracciones usando 12% de SDS-PAGE.
- El uso de un concentrador de giro (MWCO de 10 kDa o mayor dependiendo de la proteína en estudio), concentrar las fracciones pico a ~ 0 mg / ml, y luego realizar la cromatografía de exclusión de tamaño 26, el análisis de las fracciones pico a través de 12% SDS-PAGE.
- Piscina fracciones de los picos y se dializan en 20 mM Tris pH 8,0, NaCl 50 mM, 2% de glicerol, 1 β-ME mM, y se concentran a 10 mg / ml antes de la cristalización.
Opcional: Durante este paso, eliminar 5 muestras mu l a concentraciones de 1, 2, 5, y 10 mg / ml durante el curso de la concentración de la muestra.Ejecutar un nativo de carga de la página 2-5 l de cada muestra para mirar el comportamiento de la muestra durante este paso.
- Detectar un pequeño conjunto de 12 condiciones para identificar una concentración de proteína óptima para los ensayos de cristalización. La composición de estas condiciones se describe en la Figura 7.
- El uso de 24 pocillos que se sientan bandejas de cristalización de gota, realizar ensayos de cristalización utilizando el método de difusión de vapor, de pipeteado 500 l de cada una de las 12 condiciones en pocillos separados seguido de gotas que contienen inicialmente 1 l de solución bien y 1 l de muestra de proteína en los cubreobjetos . Por favor, vea 27 para obtener información adicional sobre esta técnica.
- sellar rápidamente la bandeja con cinta adhesiva transparente y coloque la bandeja en un ambiente controlado de temperatura adecuado que esté libre de vibraciones. La temperatura utilizada puede variar, pero 4 ° C, 16 ° C, y 20 ° C son bastante comunes.
- Examinar las gotas en las bandejas durante el próximo 3 days utilizando un microscopio de hasta 100 aumentos. Al final del período de 3 días, la puntuación de cada gota contiene ninguna precipitación (clara), la precipitación ligera, fuerte precipitación (marrón), o cristales. Una concentración de proteínas adecuada debe contener no más de 6 precipitaciones fuertes.
- El uso de la concentración de proteína identificada en 4.2, escrutar una amplia gama de pantallas de cristalización comercialmente disponibles. El uso de una manipulación o cristalización robot líquido acelera en gran medida este proceso y al mismo tiempo minimizar el error en las gotas. Se requiere mucho menos proteínas, así, que permite al usuario a la pantalla más condiciones con una sola muestra.
- Mejorar las condiciones iniciales identificados a partir de las pantallas amplias variando sistemáticamente cada una de las variables dentro de la gota de cristalización utilizando bandejas de 24 pocillos de detección como antes.
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Representative Results
Un diagrama que representa el flujo de trabajo utilizado en este sistema se muestra en la Figura 1 e incluye tres etapas principales. Análisis computacional de la secuencia se utiliza para desarrollar hipótesis acerca de los límites de los dominios de la proteína espiral de la bobina de interés. Un ejemplo de un análisis anotada del dominio Shrm2 SD2 se muestra en la Figura 2. En este diagrama, el objetivo fue identificar los posibles límites de dominio de un dominio conservado en el extremo C-terminal del regulador del citoesqueleto Shroom llama SD2. A partir de este análisis fue se generaron tres grupos distintos de los límites de dominio hipotéticos que contiene fragmentos de doble espiral que abarcan todo el SD2 conservado o fragmentos mínimos cerca del extremo C-terminal, que terminó como los mejores candidatos para la cristalización. Los candidatos identificados a partir del análisis de secuencia se ensayaron a continuación rápidamente en pequeña escala usando una proteína de fusión con mRuby2 (Figura 3) for análisis eficiente. Representante escala pequeña (50 ml de cultivo) purificaciones de dos proteínas Sus 10 -mRuby2-etiquetados se muestran en la Figura 4. En esta figura, el comportamiento de una proteína insoluble es fácilmente evidente en comparación con su homólogo soluble. Mal expresar o fusiones de proteínas insolubles se identifican fácilmente y rápidamente de esta manera. Los análisis bioquímicos de fragmentos de proteína por proteolisis limitada se muestran en la Figura 5 para una variedad de fragmentos usando el sistema marchitarse rubí descrito o con aislados y purificados dominios Shroom SD2. En la Figura 5A, dos variantes de ratón SHRM SD2 correspondiente a los límites de dominio hipotéticos # 2 y # 1 en la Figura 3 se digirieron usando un gradiente de concentración de proteasa a partir de (0 a 1,0%) durante 30 min a temperatura ambiente. Ambos fueron degradados eficazmente en una gran cantidad de productos más pequeños en las concentraciones de la enzima moderados. La Figura 5B muestra el same experimento realizado usando hipotética límite # 3 de Drosophila SHRM SD2. Esta proteína se cristalizó y su estructura se ha descrito 19. El análisis proteolítica también puede ser útil cuando se examinan las Rubí-fusiones a las generadas por el protocolo anterior. Como se muestra en la Figura 5C, una proteína de fusión rubí con Shrm2 SD2 humana (1427-1610) se digirió con una alta concentración (0,025%) de la proteasa subtilisina no específica a temperatura ambiente durante los puntos de tiempo indicados. Aquí, el enlazador entre Ruby y SHRM se escindió inmediatamente como sería de esperar. Además, se forman productos de menor importancia que indica que esta proteína tiene otras dos regiones sensibles de la proteasa, sin embargo, los productos de degradación que se produjeron dentro de 2 min se mantuvo en gran parte intacto durante todo el resto del experimento que indica que la proteína es en realidad bastante estable.
Un enfoque complementario se muestra mediante PAGE nativo analyses en la figura 6. En la Figura 6A, Ruby-etiquetados humano SHRM SD2 (1427-1610), así como proteínas que contienen las mutaciones puntuales indican dentro de SHRM se analizan por PAGE nativa. En este experimento, la proteína de tipo salvaje (que forma cristales) se ejecuta como dos bandas distintas, mientras que los tres mutantes que no cristalizan tienen un comportamiento dramáticamente diferente. Para demostrar que el sistema también puede ser útil en los complejos de proteínas, una variedad de complejos de Shroom-Rock se analizaron por PAGE nativa en la Figura 6B. En este caso, se usó el mismo fragmento de humano Shrm2 SD2 (1427-1610) para ayudar a aclarar el análisis, mientras que se utilizaron diferentes fragmentos de roca humano. Este enfoque sugiere que los complejos formados utilizando roca 700-906 y 746-906 tenían múltiples especies, eran smeary, y menos homogéneo. Complejos que utilizan 788-906 se mejoraron, aunque no de forma espectacular, y esta especie fue capaz de cristalizar, aunque cristales tomaron muchas semanas para formar y en contradegrada la proteína contenida Rock. Complejos generados usando Roca 834-913 forman una sola especie y más uniformes en el gel y fácilmente cristalizan durante la noche. La Figura 7 muestra un conjunto de condiciones de cristalización comunes que se utilizan para informar sobre el comportamiento de la muestra de proteína en los ensayos de cristalización, y podría ser utilizado en general con cualquier proteína. Idealmente, se obtendrá una mezcla de condiciones claras y precipitantes. Las proteínas que no forman precipitados requieren altas concentraciones o condiciones de tamponamiento más estrictas mientras que los que precipitan en muchas condiciones se debe utilizar en una concentración de proteína inferior o con condiciones de tamponamiento que promueven la solubilidad de la proteína.
Figura 1: Flujo de trabajo Diagrama. Un diagrama generalizado que representa la integración de análisis de la secuencia de cálculo y bioquímica yotras técnicas de laboratorio húmedo en una estrategia global para delinear los límites del dominio y la identificación de fragmentos de proteínas para la cristalización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: análisis de la secuencia anotada para el enrollado de la bobina SD2 dominio de Shroom. Una superposición de computacional analiza para el dominio Shroom SD2, incluyendo una alineación de secuencias múltiples CLUSTAL generada por omega y coloreado por identidad de secuencia dentro de Jalview (paso 1.1). También se incluyen predicho estructura secundaria, las predicciones de secuencias desordenadas, y las predicciones de doble espiral del dominio Shroom SD2 (paso 1.2). los límites del dominio hipotético (paso 1.3) se indican como son los límites observados y estructura secundariaelementos puestos de manifiesto por análisis cristalográfico posterior 19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Diagrama del sistema 10 -mRuby2 Su expresión. (A) Representación esquemática del vector de expresión Su 10 -mRuby2-XH2 vector utilizado en este estudio. (B) Esquema del sitio de clonación múltiple de este vector. secuencias de codificación de la proteína normalmente se insertan en este vector a través de BamHI y EcoRI sitios de clonación. El extremo C-terminal de la proteína mRuby2 se muestra en rojo, el sitio de escisión de proteasa TEV se indica con soportes y con el sitio de corte se muestra como un triángulo rojo. Una secuencia de engarce entre el mRuby2 y el sitio de TEV se muestra en cian.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: purificaciones pequeña escala representativos de dos mRuby2 etiquetada proteínas de fusión. (A) Una imagen de muestras de expresión cultivo bacteriano Rubí SHRM SD2 o una proteína no relacionada fusión Rubí conocido por ser insoluble se representan. Una cultura separada que expresa una proteína sin Rubí-etiqueta se muestran a título comparativo. (B) La fracción soluble de los cultivos anteriormente fueron imágenes después de la lisis y centrifugación a 30.000 xg durante 30 min, lo que demuestra la visualización de soluble Rubí-SHRM SD2. (C) Imagen de las perlas de Ni-NTA después de la unión y las subsiguientes etapas de lavado que indican que Ruby-SHRM SD2 se inmoviliza sobrelas perlas. (D) Las muestras de lavado y elución pasos que se describen en los pasos 2.3.6 y 2.3.7 demuestran que la fusión Rubí-SHRM SD2 permanece unido a la resina mientras que en presencia de imidazol hasta 80 mM y se eluye de la columna con eficacia con tampón de elución 1 M imidazol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: proteólisis limitada de dominios SD2 candidatos de diferentes proteínas Shroom. Una comparación de cuatro dominios SD2 de varias proteínas Shroom. (A y B) Los fragmentos SHRM SD2 indicadas se incubaron con un gradiente de concentración de la proteasa tripsina de 0 a 1,0% y los resultados se analizaron por SDS-PAGE. La relación de ese ingenio fragmento de proteínah los límites hipotéticos se indican. Análisis (C) SDS-PAGE de la digestión proteolítica limitada de su proteína de fusión 10 -mRuby2-Shroom SD2 utilizando el método de transcurso de tiempo se describe en el protocolo. La reacción se produjo con 0,025% de tripsina a temperatura ambiente. La digestión del enlazador entre Ruby y Shroom SD2 es rápida y sirve como un control interno. Un producto de degradación presume que co-purifica con el Su proteína de fusión 10 -mRuby2-Shroom SD2 se indica (*). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: La observación de cambios en el comportamiento de proteínas utilizando gel nativo. (A) 10% PAGE nativa que demuestra el efecto de un mutante que cambia las propiedades de mRuby2-Shroom SD2. En estas condiciones SHRM SD2 se ejecuta como dos bandas discretas, mientras que los mutantes punto indicado en el DS2 exhiben una gama de patrones de migración aberrantes. (B) Una comparación de los complejos de Shroom SD2-Rock formado utilizando diferentes versiones de la roca y se analizaron por PAGE nativa. Complejos entre Shroom SD2 y los fragmentos de roca que se indican quinasa (ambas proteínas de doble espiral) se resolvieron mediante PAGE nativo. Los cristales se obtuvieron para el complejo que contiene la roca 788-906 después de muchas semanas, pero complejo que contiene la roca 834-913 cristalizaron rápidamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Pantalla principal rápida para la cristalización. (A) Una pantalla rápida de la cristalización de co comúnnditions se utiliza para evaluar el comportamiento de la muestra de proteína en los ensayos de cristalización. (B) Ejemplos de la matriz de puntuación sencilla para evaluar gotas de cristalización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo descrito aquí está diseñado para ayudar al usuario a identificar los límites de dominio dentro de las grandes proteínas espiral de la bobina para facilitar su cristalización. El protocolo se basa en una incorporación integral de una variedad de datos de predicciones computacionales y otras fuentes para generar una serie de posibles límites de dominio. Estos son seguidos por una serie de experimentos bioquímicos que son rápida y económica, y que se utilizan para perfeccionar estas hipótesis iniciales. Con este enfoque, el usuario podría eliminar rápidamente los fragmentos de proteínas potenciales que no son deseables, y prestar más atención a los mejores candidatos, con objeto de optimizar las posibilidades de obtener cristales.
Hay muchos pasos importantes dentro de esta técnica, sin embargo, ninguno como crítico para la producción de cristales como el desarrollo de la serie inicial de los límites de dominio hipotéticos. Este paso incorpora una variedad de métodos de cálculo, así como la información obcontenida por la literatura o datos funcionales cuando esté disponible. Se debe tener cuidado para evitar el uso de la estrategia para poner a punto inmediatamente a la solución única "mejor" que actualmente no existe un método en el lugar para fijar un valor de confianza cuantificable a cualquiera de las predicciones. En lugar de ello, lo mejor es utilizar como un método para identificar rápidamente un pequeño conjunto de posibles límites de los dominios que deben ser verificadas experimentalmente.
Las propiedades de las proteínas de doble espiral que se pueden analizar con este protocolo son bastante amplio. Desde una perspectiva computacional, la fuerza de predicciones espiral de la bobina está limitado por debajo de 20 aminoácidos, y como se ha mencionado en el paso 1.2.1, las regiones de doble arrollamiento tendría que ser dividido en varias secciones para su análisis por DISOPRED mayor de 1.000 aminoácidos. Consideramos que esta tarde limitación temporal en que se imponga por el servidor web y puede cambiar a medida que el método se actualiza en el futuro. El análisis bioquímico posterior sin embargo, puede sufrirde varias maneras. En primer lugar, los bucles o regiones hipersensibles a las proteasas pueden hacer que la muestra internas parecen ser menos estable de lo que realmente es. proteínas estables que han escindido bucles o melladas de otro modo por la proteasa aún debe dar una apariencia estable en PAGE nativa, por lo que se recomienda que el usuario explore ambas estrategias. PAGE nativa puede ser difícil para algunas proteínas, sin embargo, ya sea porque son muy largos y migran lentamente en gel o porque su carga particular puede hacer correr la dirección opuesta fuera del gel por completo. En estos casos, puede ser útil para explorar diferentes condiciones de tamponamiento para el sistema de gel PAGE nativa.
Mientras que el enfoque del trabajo que aquí se presenta ha sido de grandes proteínas que contienen espiral de la bobina, este protocolo se puede utilizar para casi cualquier proteína con muy pocas adaptaciones. La adición principal para las proteínas globulares sería la adición de software de predicción de dominio como pDomTHREADER 28 </ sup> o DomPred 29 que debe buscar los límites de dominio, y la estructura predicciones terciarias tales como Phyre2 30 para mejorar la capacidad de predicción del análisis de la secuencia. Además, hay muchos algoritmos disponibles para realizar predicciones de estructura secundaria y predicciones desordenados, y la inclusión de algoritmos adicionales podrían ser útiles. Las proteínas globulares menudo poseen actividad enzimática u otras lecturas funcionales que proporcionen información adicional importante durante la selección de objetivos. Además, las técnicas moderadas o de alto rendimiento pueden ser incorporados según sea apropiado. Por ejemplo, los sistemas de bajo costo para 1-2 ml de cultivos y purificaciones de afinidad de metal en formatos de 96 pocillos están disponibles 31. Por último, el uso de la robótica para la creación de un gran número de experimentos de cristalización utilizando mínima de la muestra se está convirtiendo en rutina, pero la operación eficiente de los sistemas robóticos se basa en el comportamiento de las muestras de proteínas bien caracterizados. AdiciónAL modificaciones a este protocolo podrían incluir el muestreo de una variedad de etiquetas de afinidad. Muchas etiquetas fluorescentes diferentes están disponibles, o His, GST, Thioredoxin-, Streptomyces, y MBP están entre docenas de opciones disponibles si no se necesita una etiqueta fluorescente o útiles.
Al realizar este procedimiento, el usuario debe ser consciente del efecto que la etiqueta mRuby2 podría tener sobre la proteína de interés de los usuarios. La evidencia anecdótica de uso de esta etiqueta en una variedad de diferentes fusiones apoya el hecho de que a veces se unirá mRuby2 bastante fuertemente a la proteína de interés, permaneciendo unido a través de múltiples etapas cromatográficas. Este comportamiento es obviamente indeseable, pero los complejos de Ruby no deseados por lo general se puede separar y eliminar cromatográficamente. No está claro si se trata de un comportamiento de tipo chaperón como se ha observado para el MBP 32.
Después de la obtención de cristales, todavía hay muchos retos a los que comúnmente se enfrentan a coila bobina proteínas llevado que no se abordan en este protocolo. El más común es la mala calidad de difracción, ya sea debido a los enrejados o anisotrópico de difracción formada de manera imperfecta. Existen herramientas en el lugar para ayudar con la difracción anisotrópico 33, y éstas han sido críticos para la resolución de algunas estructuras de doble arrollamiento 18,20. Muchas patologías de cristal son por desgracia difícil de superar con rapidez, por lo tanto, a menudo es prudente buscar formas cristalinas adicionales con propiedades mejoradas de difracción. Esto es facilitado por el cribado robótico de miles de condiciones. Por otra parte hay muchas técnicas de post-cristalización para mejorar la calidad de difracción como la deshidratación, o siembra, 34.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BL21(DE3) Rosetta | Emd Millipore | 70954-3 | |
| BL21(DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | |
| BL21(DE3) Codon Plus | Agilent Technologies | 230245 | |
| Lysozyme | Spectrum Chemical Mfg Corp | L3008-5GM | |
| Ni-NTA resin | Life Technologies | 25216 | |
| SubtilisinA | Spectrum Chemical Mfg Corp | S1211-10ML | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-160 | |
| INTELLI-PLATE 96: | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
| PEG 3350 | Hampton research | HR2-591 | |
| PEG 8000 | Hampton research | HR2-515 | |
| PEG 400 | Hampton research | HR2-603 | |
| PEG 4000 | Hampton research | HR2-605 | |
| pcDNA3.1-Clover-mRuby2 | Addgene | 49089 | |
| Overnight Express Autoinduction System 1 | Emd Millipore | 71300 | |
| Lysogeny Broth powder | ThermoFisher Scientific | 12795027 |
References
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