Introduction
determinação da estrutura através de cristalografia de raios-X fez contribuições fundamentais para todos os campos da biologia moderna; proporcionando uma visão atômica das macromoléculas que suportam a vida e como eles interagem uns com os outros em uma variedade de contextos; o que nos permite compreender os mecanismos que causam a doença e fornecendo oportunidades para racionalmente projetar medicamentos para tratar a doença. Cristalografia tem sido a técnica experimental dominante para a determinação da estrutura de macromoléculas, e atualmente responde por 89,3% da base de dados estrutural (www.rcsb.org). Esta técnica tem muitas vantagens, incluindo a possibilidade de muito alta resolução, a capacidade de visualizar macromoléculas com uma ampla gama de tamanhos, a recolha de dados relativamente fácil, e a oportunidade de visualizar como a macromolécula interage com solvente, bem como ligantes.
Apesar das inúmeras melhorias tecnológicas na expressão da proteína recombinante 1,2, purificação 3, e biologia molecular utilizados para gerar estes sistemas 4, o maior obstáculo no processo cristalográfica permanece a capacidade de crescer cristais de qualidade de difracção. Isto tem sido especialmente verdadeiro para as proteínas que contêm os domínios grandes em espiral enrolada. Estimou-se que, tanto quanto 5% de todos os aminoácidos são encontrados dentro de bobinas enroladas-5,6, tornando esta uma característica estrutural muito comum 7, mas estas proteínas são muitas vezes mais difícil de purificar e cristalizar do que as proteínas globulares 8-10 . Isto é ainda mais agravado pelo facto de que os domínios em espiral espiralada são encontrados frequentemente no contexto de uma proteína maior, portanto, prever correctamente as fronteiras destes domínios é crítico para evitar a inclusão de sequência não estruturado ou flexível que é muitas vezes prejudicial para a cristalização.
Aqui nós apresentamos uma estrutura conceitual combinando web-based computacional analisa com a Experimental Dados do banco, para ajudar a guiar os usuários através dos estágios iniciais do processo de cristalografia, incluindo: como selecionar fragmento (s) de proteína para estudos estruturais e como preparar e caracterizar amostras de proteínas antes de quaisquer tentativas de cristalização. Nós nos concentramos nossa análise em duas proteínas contendo domínios grandes em espiral enrolada, Shroom (SHRM) e Rho-quinase (Rock). Estas proteínas foram escolhidos uma vez que ambos contêm domínios em espiral espiralada e são conhecidas para formar um complexo biologicamente relevante 11-16. Shroom e Rho-cinase (rocha) são previstos para conter ~ 200 e 680 resíduos de espiral enrolada, respectivamente, muitas porções da qual têm sido caracterizados estruturalmente 17-20. O método descrito aqui fornece um fluxo de trabalho simplificado para identificar rapidamente contendo fragmentos de proteína de filamento helicoidal que serão tratáveis através de cristalização, no entanto, as técnicas descritas podem ser facilmente adaptadas para a maioria de proteínas ou complexos de proteína ou modificada para incorporar high-throughput approaChes como disponíveis. Por último, estes métodos geralmente são baratos e podem ser realizadas pelos usuários em quase todos os níveis de experiência.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Um diagrama da estrutura conceitual ou fluxo de trabalho é descrito na figura 1 para referência. O protocolo pode ser dividido em quatro fases: previsões com base computacional ou de sequências, expressão e purificação de proteínas, a caracterização bioquímica, e cristalização. Os exemplos mostrados analisar domínios Shroom SD2 e / ou complexos de Shroom-rocha, mas pode ser utilizada com qualquer proteína.
1. Use Estabelecida ferramentas baseadas na Web para gerar previsões computacionais de limites de domínio coiled-coil
- Recolha um conjunto evolutivamente diverso de Homólogos sequência.
- Ir para www.uniprot.org e digite Shroom na barra de pesquisa superior.
- Seleccione sequências para download, marcando a caixa ao lado de seu número de acesso. Sequências com uma estrela indicam sequências revisados por UniProt e são geralmente mais confiável. Tome cuidado para garantir que todas as sequências são completas e precisas.
- Salvar os s selecionadosequences clicando no botão Download.
- Alinhe o conjunto de sequências de Shroom utilizando Clustal-Omega 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Clique no botão "Browse" para selecionar o arquivo com as sequências Shroom e empurre Enviar.
- Após o alinhamento estiver completo, clique no botão "Download Alinhamento File".
- Abra o alinhamento múltiplo de sequências geradas em 1.1.5 usando Jalview (File | Alinhamento Entrada | Do arquivo). Dentro da nova janela de alinhamento, cor de identidade (Color | percentagem de identidade).
- Calcular as previsões de estrutura secundária, previsões da sequência flexível ou desordenado, e previu regiões de espiral enrolada dentro da proteína (s) de interesse.
- Ir para http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, para calcular as previsões em espiral enrolada. Copie e cole a seqüência na Caixa de Sequência e clique em Enviar.
NOTA: Esta análise pode levar um par de horas para complete. Uma vez que sequências Shroom são bastante grandes, as sequências podem ter de ser dividida em blocos de menos do que 1,000 aminoácidos para caber dentro da limitação de tamanho do servidor da web. Ao analisar Shrm2, recomenda-se que os aminoácidos C-terminais 1000 são usados como esta secção contém o domínio SHRM SD2 que é conhecido por conter regiões de espiral enrolada. Ao repetir esta análise com outras proteínas, recomenda-se utilizar as sequências de proteínas de comprimento total, quando possível. Se isso não é uma opção, utilizar o maior possível ou fragmento dissecar a sequência com base em dados bioquímicos ou funcionais conhecidos. - Ir para http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, para calcular as previsões em espiral enrolada. Copie e cole a seqüência na Caixa de Sequência e clique em Enviar.
- Ir para http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, para calcular as previsões em espiral enrolada. Copie e cole a seqüência na Caixa de Sequência e clique em Enviar.
- Combinar os resultados de passos 1.1 a 1.2.2 em uma única anotação abrangente da sequência de Shroom.
NOTA: É altamente incentivados a também incluem toda e qualquer i relevantenformação que pode ser adquirida a partir da literatura ou de outras fontes sobre a função da proteína ou purificação nesta fase. - Utilizando esta sequência anotada abrangente, prever limites do domínio (ou uma série de possíveis limites) para a proteína, tentando maximizar a conservação e previu características estruturais, minimizando a quantidade de sequência desordenada ou flexível. Se for conhecida, a proteína resultante deve manter as propriedades funcionais de interesse.
2. expresso e purificar proteínas com os limites de domínio identificada na secção 1
NOTA: O objetivo desta seção é a utilização de uma série de ensaios rápidos e facilmente quantificáveis para a tela de limites de domínio hipotéticas geradas na Seção 1.
- Utilizando técnicas padrão de biologia molecular, gerar um plasmídeo de expressão com a sequência de codificação desejada na moldura 10 dentro do seu -mRuby2-XH2 plasmídeo (veja a Figura 3 para o mapa de vector umnd detalhes adicionais).
- Os níveis de expressão de teste para cada plasmídeo de expressão utilizando células BL21 (DE3) de E. coli ou outra estirpe de expressão adequado em meios de auto-indução 1 à temperatura ambiente durante 18-24 h.
- Transforme os plasmídeos de expressão, bem como um controlo de plasmídeo vazio em BL21 (DE3), seguindo as instruções que vieram com as células ou usando o protocolo de transformação robusta, como o aqui (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial -transformação/).
- A partir da placa recentemente transformados, escolher uma única colónia e crescer uma cultura de arranque de 5 ml a 37 ° C durante a noite em Lisogenia Broth (LB) com meios 34 ug / ml de canamicina.
- No dia seguinte, sedimentar a cultura e lavar o pellet com LB. fresco
- Adicionar a cultura de arranque, para 50 ml de meio de auto-indução com 34 ug / ml de canamicina. Permitir que a cultura a crescer até à saturação quer à temperatura ambiente ou a 37 ° C. Tipicamente, crescem durante ~ 18-24 h.
- celular pellets e congelar os sedimentos de células resultantes a -80 ° C antes da purificação indefinidamente.
- Comparar extractos de células completas de cada estirpe de expressão e o vector de controlo vazio por SDS-PAGE para determinar a estirpe que mais eficientemente produz a proteína de fusão desejada. Para His 10 proteínas de fusão -mRuby2 Cogumelo-SD2, correr 10% de gel SDS-PAGE a 180 V durante ~ 50 min ou até que a frente de corante atingir o fundo do gel de 22.
- Gel mancha com Coomassie Blue para visualizar as proteínas celulares totais dentro de cada estirpe 23.
- Executar uma etapa inicial de cromatografia de afinidade em cada cepa que expressa com sucesso proteína mRuby2-fusion. Tipicamente, executar os passos de purificação 2.3.2-2.3.7 à temperatura ambiente, a menos que a proteína irá beneficiar de condições alteradas, tais como a purificação, a 4 ° C.
- pellets de células descongelamento do passo 2.2.5.
- Ressuspender cada pelete de células em 1,5 ml de tampão de lise (10% de glicerol, 500 mM de NaCl, 40mM de imidazole, 20 mM de Tris pH 8,0, 1 mM de beta-mercaptoetanol). Complementar o tampão de lise com inibidores da protease, conforme apropriado.
- Adicionar 30 ul de 10 mg / ml de lisozima e incubar à temperatura ambiente durante 20 min. Sonicate seguindo as instruções para o instrumento a ser utilizado.
- Transferir para um tubo de 1,5 ml e centrifugar numa centrífuga de bancada durante 30 min a 14000 xg para sedimentar o material insolúvel ou células não lisadas. Salvar tanto sobrenadante e pellet para posterior análise através de SDS-PAGE.
- Realizar a purificação de afinidade de níquel, incubação da fracção solúvel com 100 ul de contas de Ni-NTA. Incubam-se as contas com lisado solúvel, durante 5-10 min, invertendo diversas vezes para misturar os grânulos.
- Centrifugar a 800 xg durante 30 seg numa centrífuga de mesa para sedimentar as pérolas. Em seguida lavar o sedimento 3-5 vezes com tampão de lise para limpar os contaminantes não-específicos.
- proteína de fusão Eluir Ruby a partir das pérolas com tampão de lise, suplementado com 1H imidazole.
- Use SDS-PAGE para comparar o comportamento dos Seus-mRuby2-Shroom proteínas na purificação "rápida e suja" acima.
3. Caracterizar proteína da amostra para identificar aqueles com propriedades vantajosas
- Usar um conjunto espectrofotómetro a 280 nm para medir a concentração da proteína de fusão Ruby, e depois avaliar a homogeneidade da amostra através do carregamento de 1-5 ug de proteína de fusão num gel PAGE nativo 24. Submeter o gel PAGE nativo a 10% a 4 ° C durante 140 min a 175 V.
- Imagem a PAGE nativa utilizando um gerador de imagens equipado para visualizar fluorescência, observando-se que a fusão mRuby-tagged migra neste ensaio.
NOTA: Tenha cuidado para observar proteína de fusão que está preso na bem como esta proteína é provável agregados. Se um gerador de imagens de fluorescência não está disponível, pode-se muitas vezes visualizar e imagem concentrada amostras de rubi com etiquetas proteína sob uma luz negra ou com uma caixa de luz UV.
- Imagem a PAGE nativa utilizando um gerador de imagens equipado para visualizar fluorescência, observando-se que a fusão mRuby-tagged migra neste ensaio.
- Realizar a proteólise limitada para identificar domínios dobrados de forma estável. Incubar 95 ul de Rubi-SHRM SD2 fusão em ~ 1 mg / ml com 5 ul de 0,025% Subtilisina A.
- Amostra a reacção em pontos de tempo de 0, 0,5, 2, 5, 15, 60, e 120 minutos, removendo 10 ul da reacção para cada ponto de tempo e a visualização do progresso da reacção por meio de SDS-PAGE utilizando um gel de acrilamida a 15% .
- Coram com azul de Coomassie tal como no passo 2.2.7 e avaliar se uma espécie resistente protease podem ser identificadas.
- Integrar dados da eficiência da purificação, o comportamento em PAGE nativa e proteólise limitada sobre as proteínas parcialmente purificadas de fusão mRuby2-Shroom em uma avaliação abrangente do comportamento global destas proteínas em solução.
- (Opcional) Se um ensaio funcional adequado estiver disponível, verifique se há atividade neste momento.
4. Produção de cristais de alta qualidade de o Coiled-coil SD2Domínio de Shroom
NOTA: Todos os passos na secção 4.1 são realizadas à temperatura ambiente a menos que a proteína se beneficiaria de purificação a uma temperatura diferente, geralmente de 4 ° C.
- Usando as 50 ml crescimentos como uma estimativa aproximada de expressão e potencialidades de purificação, execute expressões de grande escala de mRuby2-Shroom SD2 com o objetivo de alcançar a 5-20 mg de amostra completamente purificados. Tipicamente de 2 L de cultura fornece material de partida adequado. Após o crescimento as células por centrifugação a 8000 xg durante 10 min.
- Ressuspender o sedimento do crescimento de 2 L de tampão de lise, como antes, utilizando-se ~ 2 ml de lise por grama de sedimento celular congelado se utilizando lisozima para a lise. Alternativamente, ressuspender em ~ 8 ml / g de sedimento se estiver usando um homogeneizador ou imprensa francesa. Sedimentar os restos celulares através de centrifugação a 30000 xg durante 30 min.
- Lote ligar a fracção solúvel a partir de 4.1.1 utilizando 10 ml de resina Ni-NTA. Despeje em coluna de gravidade apropriadoe permitir que as proteínas não ligadas para drenar.
- Lavar 3-5 vezes da resina com 40 ml de tampão de lise, seguindo-se uma lavagem com tampão de lise suplementado com NaCl 1 M.
- Lavar a resina com 40 ml de tampão de lise suplementado com imidazole 80 mM.
- Elui-se a proteína de fusão-rubi Shroom com 40 ml de tampão de lise suplementado com 1 M de imidazol. fracionar manualmente a proteína eluída em 4-10 ml frações.
- Confirmar fracções contendo proteína de fusão Rubi-Shroom utilizando 10% de SDS-PAGE.
- Dialisar fracções apropriadas (tipicamente frações 2-4) em 8% de glicerol, NaCl 250 mM, imidazole 15 mM, 20 mM Tris pH 8,0, 1 mM β-Me, utilizando tubagem de diálise de 6-8 kDa MWCO. Adicionar 1 mg de protease de TEV por cada 25-50 mg de proteína de fusão. Dialisar durante a noite à temperatura ambiente com agitação lenta.
- purificação de níquel afinidade Repita os passos 4.1.2. a 4.1.6. O domínio Shroom SD2 agora deve permanecer na fracção livre enquanto o seu 10 -mRuby2 continuam vinculados aose a resina vai ser encontrada nas fracções de eluição. Confirmar esta usando 12% da coloração SDS-PAGE com azul de Coomassie.
- Dialisar fracções contendo domínio Shroom SD2 em 8% de glicerol, 100 mM de NaCl, Tris 20 mM, pH 8,0, tampão mM de beta-mercaptoetanol a 5 durante a noite.
- Realizar cromatografia de permuta aniónica utilizando um 25 FPLC, e eluindo com um gradiente de NaCl 0,1-1,0 M de NaCl. Analise fracções, utilizando 12% de SDS-PAGE.
- Usando um concentrador de rotação (MWCO de 10 kDa ou superior, dependendo da proteína a ser estudada), concentrar as fracções do pico a ~ 0 mg / ml, e, em seguida, realizar cromatografia de exclusão de tamanho 26, a análise através de fracções de pico de 12% de SDS-PAGE.
- Piscina fracções de pico e diálise em Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM, 2% de glicerol, 1 mM β-Me, e concentra-se para 10 mg / ml antes da cristalização.
Opcional: Durante esta etapa, remover amostras de 5 uL em concentrações de 1, 2, 5, e 10 mg / ml durante o curso de se concentrar a amostra.Execute um nativo de carregamento da página 2-5 mL de cada amostra de olhar para o comportamento da amostra durante esta etapa.
- Tela de um pequeno conjunto de 12 condições para identificar uma concentração de proteína ideal para ensaios de cristalização. A composição destas condições é descrita na Figura 7.
- Usando 24 poços sentam-se tabuleiros de cristalização gota, realizar ensaios de cristalização utilizando o método de difusão de vapor, de pipetagem de 500 ul de cada uma das 12 condições em poços separados seguidos por gotas que inicialmente contêm 1 ml de solução bem e 1 ul de amostra de proteína em as lamelas . Consulte 27 para obter informações adicionais sobre esta técnica.
- Rapidamente selar a bandeja com fita adesiva transparente e mover a bandeja para um ambiente controlado temperatura adequada que é vibração livre. A temperatura utilizada pode variar, mas 4 ° C, 16 ° C, e 20 ° C são bastante comuns.
- Examine as gotas nas bandejas durante a próxima 3 days usando um microscópio de até 100X. No final do período de 3 dias, marcar cada gota como contendo nenhuma precipitação (clara), precipitação de luz, precipitação pesada (castanho), ou cristais. Uma concentração adequada de proteínas deve conter não mais do que 6 precipitações pesados.
- Usando a concentração de proteína identificada em 4.2, o despiste de uma larga gama de telas de cristalização disponíveis comercialmente. O uso de um tratamento de cristalização ou robô líquido aumenta grandemente o presente processo e ao mesmo tempo a redução do erro nas gotas. Isto requer muito menos proteína, bem como, permitir que o utilizador para rastrear mais condições com uma única amostra.
- Melhorar as condições iniciais identificados a partir de telas de amplos variando sistematicamente cada uma das variáveis dentro da gota de cristalização, usando 24-de rastreio bem como as bandejas antes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um diagrama que descreve o fluxo de trabalho utilizado neste sistema é mostrado na Figura 1 e inclui três etapas principais. A análise computacional da sequência é utilizada para desenvolver hipóteses acerca dos limites do domínio da proteína de filamento helicoidal de interesse. Um exemplo de uma análise anotada do domínio Shrm2 SD2 é mostrado na Figura 2. Neste diagrama, o objetivo foi identificar os possíveis limites de domínio para um domínio conservado no C-terminal do regulador do citoesqueleto Shroom chamado SD2. A partir desta análise foi de três conjuntos distintos de limites de domínio hipotéticos foram gerados contendo fragmentos em espiral espiralada que abrangem todo o conservada SD2 ou fragmentos mínimas perto do terminal C, que terminou como os melhores candidatos para a cristalização. Os candidatos identificados a partir da análise da sequência são então rapidamente testados em pequena escala utilizando uma proteína de fusão com mRuby2 (Figura 3) for análise eficiente. Representante pequena escala (50 ml de cultura) a partir de duas purificações His 10 proteínas -mRuby2-marcados são mostrados na Figura 4. Nesta figura, o comportamento de uma proteína insolúvel é prontamente aparente, em comparação com o seu homólogo solúvel. Mal ou expressando fusões de proteínas insolúveis são facilmente e rapidamente identificados desta forma. As análises bioquímicas de fragmentos de proteína por proteólise limitada são mostradas na Figura 5 para uma variedade de fragmentos, utilizando o sistema de murchar rubi descrito ou com domínios Shroom SD2 isoladas e purificadas. Na Figura 5A, duas variantes de rato SHRM SD2 correspondente aos limites de domínios hipotéticos # 2 e # 1 na Figura 3 foram digeridos utilizando um gradiente de concentração de protease (0-1,0%) durante 30 min à temperatura ambiente. Ambos foram eficazmente degradado em uma série de produtos menores a concentrações enzimáticas moderadas. A Figura 5B mostra a same experiência realizada utilizando hipotética limite # 3 de Drosophila SHRM SD2. Esta proteína se cristalizar e a sua estrutura tem sido descrito 19. análise proteolíticas também pode ser útil quando se examina Rubi-fusões conforme gerado a partir do protocolo acima. Como mostrado na Figura 5C, uma proteína de fusão com rubi humano Shrm2 SD2 (1427-1610) foi digerido com uma concentração elevada (0,025%) da protease subtilisina não específica à temperatura ambiente para os pontos de tempo indicados. Aqui, o ligante entre Ruby e SHRM foi imediatamente clivada como seria de esperar. Além disso, os produtos formados foram menores indicando esta proteína tem duas outras regiões sensíveis protease, no entanto, os produtos de degradação que foram produzidos dentro de 2 min permaneceu praticamente intacto ao longo do resto da experiência, indicando que a proteína é realmente muito estável.
Uma abordagem complementar é mostrado usando analys página nativerepresenta na Figura 6. Na Figura 6A, Ruby-tagged humano SHRM SD2 (1427-1610) assim como a proteína que contém as mutações pontuais indicados dentro SHRM são analisadas por PAGE nativa. Nesta experiência, a proteína de tipo selvagem (que forma cristais) é executado como duas bandas distintas, enquanto que os três mutantes que não cristalizam têm um comportamento muito diferente. Para demonstrar que o sistema também pode ser útil em complexos proteicos, uma variedade de complexos de Shroom-Rock foram analisadas por PAGE nativa na Figura 6B. Neste caso, o mesmo fragmento de humano Shrm2 SD2 (1427-1610) foi utilizado para ajudar a esclarecer a análise, embora diferentes fragmentos de rocha humana foram utilizados. Esta abordagem sugeriu que os complexos formados usando Rocha 700-906 e 746-906 tinha várias espécies, foram smeary, e menos homogênea. Complexos utilizando 788-906 foram melhoradas, embora não drasticamente, e esta espécie foi capaz de cristalizar, embora cristais levou muitas semanas para formar e contained degradada proteína Rock. Complexos gerados usando Rocha 834-913 formado uma espécie simples e mais uniformes no gel e prontamente cristalizou durante a noite. A Figura 7 mostra um conjunto de condições de cristalização comuns que são usados para informar sobre o comportamento da amostra de proteína em ensaios de cristalização, e pode ser utilizado geralmente com qualquer proteína. Idealmente, será obtida uma mistura de condições claras e precipitantes. As proteínas que não formam precipitados requerem concentrações elevadas ou condições de tamponamento mais rigorosas, enquanto que aqueles precipitar em muitas condições deveria ser utilizado a uma concentração de proteína mais baixa ou com condições de tamponamento que promovam a solubilidade da proteína.
Figura 1: Fluxo de trabalho Diagram. Um diagrama generalizado que descreve a integração de análise da sequência computacional e bioquímica eoutras técnicas de laboratório molhado em uma estratégia abrangente para delinear limites de domínio e identificar fragmentos de proteínas para a cristalização. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: anotada análise de sequência para o domínio SD2 espiral enrolada de Shroom. Uma sobreposição de análises computacionais para o domínio Shroom SD2, incluindo um alinhamento de sequências múltiplas CLUSTAL gerado pela Omega e colorido por identidade de sequência dentro Jalview (Passo 1.1). Também incluídos estão previstos estrutura secundária, as previsões de sequência desordenadas, e as previsões em espiral espiralada do domínio Shroom SD2 (Passo 1.2). limites hipotético de domínio (passo 1.3) são indicados como são observados os limites e estrutura secundáriaelementos como revelado pelo subsequente análise cristalográfica 19. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Diagrama do seu sistema 10 -mRuby2-expressão. (A) Representação esquemática do vector de expressão His 10 -mRuby2 XH2-vector utilizado neste estudo. (B) Esquema do local múltiplo de clonagem deste vector. sequências de codificação de proteínas são tipicamente inserido neste vector por meio de BamHI e EcoRI locais de clonagem. O extremo C-terminal da proteína mRuby2 é mostrado a vermelho, local de clivagem de protease de TEV é indicado com suportes e com o local de clivagem como um triângulo vermelho. A sequência ligante entre as mRuby2 e o local de TEV é mostrado em ciano.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Representante purificações de pequena escala de dois mRuby2 marcado proteínas de fusão. (A) Uma imagem de amostras de bactérias cultura expressão Rubi SHRM SD2 ou uma proteína de fusão de Ruby não relacionada conhecido por ser insolúvel são retratados. A cultura separada expressar uma proteína sem um Rubi-tag é mostrada para comparação. (B) A fracção solúvel a partir das culturas acima foram fotografadas após a lise e centrifugação a 30000 xg durante 30 minutos, demonstrando a visualização de solúvel Rubi-SHRM SD2. (C) Imagem das contas de Ni-NTA após a ligação e passos de lavagem subsequentes, indicando que Rubi-SHRM SD2 está sendo imobilizada sobreos grânulos. (D) As amostras de passos de lavagem e eluição como descrito nos passos 2.3.6 e 2.3.7 demonstram que a fusão Rubi-SHRM SD2 permanece ligada à resina, enquanto na presença de imidazolo até 80 mM, e seja efectivamente fluido da coluna com tampão de eluição de imidazole a 1 M. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: proteólise limitada de domínios SD2 candidatos de diferentes proteínas Shroom. Uma comparação de quatro domínios SD2 a partir de várias proteínas Shroom. (A e B) Os fragmentos SHRM SD2 indicados foram incubadas com um gradiente de concentração da protease tripsina de 0 a 1,0% e os resultados analisados por SDS-PAGE. A relação dessa sagacidade fragmento de proteínah, os limites são indicados hipotéticos. Análise (C) de SDS-PAGE de digestão proteolítica limitada da sua proteína de fusão 10 -mRuby2 Cogumelo-SD2 usando o método de curso de tempo descrito no protocolo. A reacção ocorreu com 0,025% de tripsina, à temperatura ambiente. A digestão do ligante entre Ruby e Shroom SD2 é rápido e serve como um controlo interno. Um produto de degradação presume-se que co-purifica com a sua proteína de fusão 10 -mRuby2 Cogumelo-SD2 é indicado (*). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Observando as mudanças no comportamento de proteína utilizando gel nativo. (A) 10% PAGE nativa que demonstra o efeito de um mutante que altera as propriedades de mRuby2-Shroom SD2. Sob estas condições SHRM SD2 é executado como duas bandas discretas, enquanto que mutantes ponto indicado dentro do SD2 exibir uma série de padrões de migração aberrantes. (B) Uma comparação de complexos Shroom SD2-rock formada utilizando diferentes versões do Rock e analisadas por PAGE nativa. Complexos entre Shroom SD2 e os fragmentos indicados of Rock quinase (ambas as proteínas em espiral espiralada) foram resolvidas por PAGE nativa. Os cristais foram obtidos para o complexo contendo Rocha 788-906 depois de muitas semanas, mas complexo contendo Rocha 834-913 cristalizados rapidamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: tela principal rápida para a cristalização. (A) A tela rápida de co comum cristalizaçãonditions é utilizado para avaliar o comportamento da amostra de proteína em ensaios de cristalização. (B) Exemplos da matriz de pontuação simples para avaliar gotas de cristalização. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O protocolo aqui descrito é projetado para ajudar o usuário a identificar limites de domínio dentro de proteínas em espiral enrolada grandes para facilitar a sua cristalização. O protocolo baseia-se em uma incorporação integral de uma variedade de dados de previsões computacionais e outras fontes para gerar uma série de potenciais limites do domínio. Estes são seguidos por um conjunto de experiências bioquímicas que são rápidos e baratos, e são utilizados para refinar ainda mais estas hipóteses iniciais. Usando essa abordagem, o usuário pode eliminar rapidamente fragmentos de proteínas potenciais que são indesejáveis, e se concentrar mais atenção nos melhores candidatos, melhorando assim as perspectivas de obtenção de cristais.
Há muitos passos importantes dentro desta técnica, no entanto, nenhum tão crítico para a produção de cristais, como o desenvolvimento do conjunto inicial de limites de domínio hipotéticos. Este passo incorpora uma variedade de abordagens computacionais, bem como informações obtained a partir da literatura ou de dados funcional quando disponíveis. Cuidados devem ser tomados para evitar o uso da estratégia de aprimorar imediatamente até a solução única "melhor" que não existe actualmente nenhum método no lugar para fixar um valor de confiança quantificável para qualquer das previsões. Em vez disso, ele é melhor usado como um método para identificar rapidamente um pequeno conjunto de possíveis limites de domínio que precisam ser verificados experimentalmente.
As propriedades das proteínas em espiral espiralada que podem ser analisadas com este protocolo são bastante amplas. Do ponto de vista computacional, a força de previsões em espiral enrolada é limitado abaixo de 20 aminoácidos, e, como mencionado no passo 1.2.1, regiões de espiral enrolada maior do que 1,000 aminoácidos teria de ser dividida em múltiplas secções para análise por DISOPRED. Vemos esta limitação mais tarde como temporária, uma vez que é imposta pelo servidor e pode mudar à medida que o método é atualizado no futuro. A análise bioquímica subsequente no entanto, pode sofrerde várias maneiras. Em primeiro lugar, loops ou regiões hipersensíveis a proteases podem fazer a amostra internos parecem ser menos estável do que realmente é. proteínas estáveis que clivados laços ou estão a ser recortadas pela protease ainda deve dar uma aparência estável em PAGE nativa, que é por isso que é recomendado que o usuário explore as duas estratégias. PAGE nativa pode ser difícil para algumas proteínas, no entanto, seja porque eles são muito longos e migrar lentamente em gel ou porque a sua carga particular pode fazê-los rodar na direcção oposta para fora do gel inteiramente. Nestes casos, pode ser útil para explorar as diferentes condições de tamponamento para o sistema de gel de PAGE nativa.
Embora o foco do trabalho aqui apresentado tem sido em grandes contendo proteínas em espiral enrolada, este protocolo pode ser utilizado para praticamente qualquer proteína com poucas adaptações. A adição primária para proteínas globulares seria a adição de software de predição de domínio, tais como pDomTHREADER 28 </ sup> ou DomPred 29 para procurar limites de domínio, e as previsões estrutura terciária como Phyre2 30 para aumentar o poder preditivo da análise da sequência. Além disso, existem muitos algoritmos disponíveis para a realização de previsões de estrutura secundária e previsões desordenados, e a inclusão de algoritmos adicionais poderia ser útil. proteínas globulares geralmente possuem atividade enzimática ou outras leituras funcionais que fornecem informações adicionais importantes durante a seleção do alvo. Além disso, técnicas de moderadas ou de alto rendimento podem ser incorporados como apropriado. Por exemplo, sistemas dispendiosos para 1-2 ml de culturas e purificações de afinidade com metal em formatos de 96 cavidades estão prontamente disponíveis 31. Por último, a utilização de robótica para a criação de um grande número de experiências de cristalização utilizando amostra mínima está a tornar-se rotina, mas a operação eficiente de sistemas robóticos se baseia no comportamento de amostras de proteínas bem caracterizadas. Adiçãoal modificações a este protocolo pode incluir amostragem de uma variedade de marcas de afinidade. Muitas marcas fluorescentes diferentes estão disponíveis, ou His, GST, Thioredoxin-, Streptomyces, e MBP estão entre dezenas de opções disponíveis se um marcador fluorescente não é necessária ou útil.
Ao realizar este procedimento, o usuário deve estar consciente do efeito que a tag mRuby2 pode ter na proteína de interesse dos usuários. Evidência anedótica de usar esta etiqueta em uma variedade de diferentes fusões suporta o facto de que, por vezes, mRuby2 vai ligar bastante bem para a proteína de interesse, mantendo-se ligado através de múltiplos passos cromatográficos. Este comportamento é obviamente indesejável, mas complexos de Ruby não intencionais geralmente pode ser separado e removido cromatograficamente. Não está claro se este é um comportamento semelhante a chaperona como tem sido observado para MBP 32.
Após a obtenção de cristais, que ainda existem muitos desafios que são comumente enfrentados com coiproteínas-coil levou que não são abordadas no presente Protocolo. O mais comum é de má qualidade difração, quer devido a treliças ou difração anisotrópica formados imperfeitamente. Existem ferramentas no lugar para ajudar com anisotrópica difração de 33, e estes têm sido fundamentais para a resolução de algumas estruturas em espiral enrolada 18,20. Muitas patologias cristal são, infelizmente, difícil de superar rapidamente, por isso é muitas vezes prudente procurar formas cristalinas adicionais com propriedades de difração melhorados. Isto é facilitado por o rastreio de milhares de robótico condições. Alternativamente, existem muitas técnicas de pós-cristalização para melhorar a qualidade de difração como desidratação, ou semear 34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BL21(DE3) Rosetta | Emd Millipore | 70954-3 | |
| BL21(DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | |
| BL21(DE3) Codon Plus | Agilent Technologies | 230245 | |
| Lysozyme | Spectrum Chemical Mfg Corp | L3008-5GM | |
| Ni-NTA resin | Life Technologies | 25216 | |
| SubtilisinA | Spectrum Chemical Mfg Corp | S1211-10ML | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-160 | |
| INTELLI-PLATE 96: | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
| PEG 3350 | Hampton research | HR2-591 | |
| PEG 8000 | Hampton research | HR2-515 | |
| PEG 400 | Hampton research | HR2-603 | |
| PEG 4000 | Hampton research | HR2-605 | |
| pcDNA3.1-Clover-mRuby2 | Addgene | 49089 | |
| Overnight Express Autoinduction System 1 | Emd Millipore | 71300 | |
| Lysogeny Broth powder | ThermoFisher Scientific | 12795027 |
References
- Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
- Chapman, T. Protein purification: pure but not simple. Nature. 434 (7034), 795-798 (2005).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. Predicting coiled coils from protein sequences. Science. 252 (5009), 1162-1164 (1991).
- Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils. J Struct Biol. 137 (1-2), 41-53 (2002).
- Lupas, A. N., Gruber, M. The structure of alpha-helical coiled coils. Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).
- Hernandez Alvarez, B., et al. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Eng Des Sel. 21 (1), 11-18 (2008).
- Slabinski, L., et al. The challenge of protein structure determination--lessons from structural genomics. Protein Sci. 16 (11), 2472-2482 (2007).
- Slabinski, L., et al. XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
- Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure. Curr Biol. 13 (24), 2125-2137 (2003).
- Hildebrand, J. D. Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network. J Cell Sci. 118 (Pt 22), 5191-5203 (2005).
- Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins. J Biol Chem. 281 (29), 20542-20554 (2006).
- Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction. Dev Dyn. 239 (7), 2078-2093 (2010).
- Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis. Mol Biol Cell. 22 (6), 795-805 (2011).
- Das, D., et al. The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice. Biol Open. 3 (9), 850-860 (2014).
- Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA. J Biol Chem. 279 (8), 7098-7104 (2004).
- Mohan, S., et al. Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology. PLoS One. 8 (12), e81075 (2013).
- Mohan, S., et al. Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction. Mol Biol Cell. 23 (11), 2131-2142 (2012).
- Tu, D., et al. Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I. PLoS One. 6 (3), e18080 (2011).
- Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol. 7, 539 (2011).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue. Anal Biochem. 48 (2), 617-620 (1972).
- Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Jungbauer, A., Hahn, R.
- Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography. J Chromatogr A. 1132 (1-2), 98-108 (2006).
- Giege, R. A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day. FEBS J. 280 (24), 6456-6497 (2013).
- Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination. Bioinformatics. 25 (14), 1761-1767 (2009).
- Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure. Protein Sci. 11 (12), 2814-2824 (2002).
- Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).
- Elsliger, M. A., et al. The JCSG high-throughput structural biology pipeline. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66 (Pt 10), 1137-1142 (2010).
- Bach, H., et al. Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies. J Mol Biol. 312 (1), 79-93 (2001).
- Strong, M., et al. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8060-8065 (2006).
- Heras, B., Martin, J. L. Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 9), 1173-1180 (2005).
