Introduction
X-ışını kristalografisi yoluyla yapı tayini modern biyolojinin her alanda temel katkılarda bulunmuştur; yaşamı destekleyen ve çeşitli bağlamlarda birbirleriyle nasıl etkileşimde makromoleküllerin bir atom bir görünüm sağlayan; Hastalık ve sağlayan fırsatlar rasyonel hastalığı tedavi etmek için ilaçlar tasarlamaya neden mekanizmaları anlamak için bize izin. Kristalografi uzun makromoleküler yapısını belirlemek için baskın deneysel teknik olmuştur ve şu anda yapısal veritabanı (www.rcsb.org) içinde% 89.3 hesapları vardır. Bu teknik çok yüksek çözünürlükte potansiyeli dahil olmak üzere birçok avantajı vardır, bir boyutlarda geniş, nispeten kolay veri toplama ve makromolekül çözücü yanı sıra ligandlar nasıl etkileşimde görselleştirmek için fırsat makromolekülleri görselleştirmek için yeteneği.
Rekombinant protein ifadesi 1,2, pur sayısız teknolojik gelişmelere rağmenification 3 ve bu sistemleri 4, kristalografik süreçte tek en büyük engel oluşturmak için kullanılan moleküler biyoloji kırınım kaliteli kristaller büyümeye yeteneği kalır. Bu büyük sarmal-coil etki içermeyen protein için özellikle doğrudur olmuştur. Tüm amino asitler kadar 5%, bu çok ortak yapısal özelliği 7 hale sarılmış bobinler 5,6 içinde bulunan olduğu tahmin, ancak bu proteinler çoğu zaman arındırmak ve küresel proteinlerin 8-10 den kristalize etmek daha zordur edilmiştir . Bu ayrıca sarılmış bobin etki genellikle bu nedenle doğru sık kristalleşme için zararlı olduğunu yapılandırılmamış veya esnek dizisinin oluşumunu önlemek için önemlidir bu alanların sınırlarını tahmin, daha büyük bir proteinin kapsamında bulunduğu gerçeğine ile birleşir.
Burada birleştiren kavramsal bir çerçeve sunmak web tabanlı hesaplama experimenta analizleryapısal çalışmalar ve nasıl hazırlamak ve kristalleşme girişimleri öncesinde protein örneklerinin karakterize etmek için protein parçası (ler) nasıl seçileceğini: tezgah l veri kristalografik sürecinin ilk aşamalarında dahil yoluyla kılavuz kullanıcılara yardımcı olmak için. Biz büyük sarmal-coil alanlarını içeren iki protein üzerinde analizimizi odaklanmak, Shroom (SHRM) ve Rho-kinaz (Rock). Her ikisi de halkalaştırılmış halka alanları içerir ve biyolojik olarak alakalı kompleks 11-16 oluşturulması için bilinen bu proteinleri seçilmiştir. Shroom ve Rho-kinaz (Rock), sırasıyla sarılmış-bobinin ~ 200 ve 680 artıkları tahmin edilen, çok sayıda kısımları, yapısal olarak 17-20 karakterize edilmiştir. Burada tarif edilen yöntem, hızlı bir şekilde kristalleşme için müsait olacak halkalı-halka ihtiva eden protein parçalarını tanımlamak için bir iş akışı sağlanmakta, ancak tarif edilen teknikler kolayca en protein veya protein-kompleksleri için uyarlanmış veya yüksek verimli arayışlara dahil etmek üzere modifiye edilebilirches olarak kullanılabilir. Son olarak, bu yöntemler, pahalı olmayan ve hemen hemen tüm seviyeden kullanıcılar tarafından gerçekleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: kavramsal çerçeve ya da iş akışı şeması başvuru için Şekil 1'de açıklanmıştır. hesaplamalı veya sıra tabanlı tahminler, protein ekspresyonu ve saflaştırılması, biyokimyasal karakterizasyonu ve kristalleşme: protokol dört aşamaya bölünebilir. gösterilen örnekler Shroom SD2 etki ve / veya Shroom-kaya kompleksleri analizi, ancak herhangi bir protein ile kullanılabilir.
1. Kullanım Coiled-bobin Alan Sınırları Hesaplamalı Tahminleri oluşturmak için Web tabanlı Araçlar kurulan
- Dizi homologları bir Evrimsel Farklı Set toplayın.
- www.uniprot.org gidin ve üst arama çubuğuna Shroom yazın.
- Seç dizileri yanında onların katılım numarasına kutuyu işaretleyerek indirmek için. yıldızla Diziler UniProt tarafından gözden dizileri gösterir ve genellikle daha güvenilirdir. tüm diziler tam ve doğru olmasını sağlamak için özen gösterin.
- Seçilen s kaydetYükle düğmesini tıklayarak equences.
- Clustal-Omega 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) kullanarak Shroom dizilerinin koleksiyonu aynı hizaya getirin. Gönder itme sonra Shroom dizileri ile dosyayı seçmek için "Browse" düğmesini tıklayın ve.
- Hizalama işlemi tamamlandıktan sonra, "Hizalama İndir Dosya" düğmesini tıklayın.
- (Dosyadan | | Giriş Hizalama Dosyası) Jalview kullanarak 1.1.5 oluşturulan çoklu dizi hizalama açın. (| Yüzde Kimlik Color) kimliği ile yeni hizalama penceresinin, renk içinde.
- İkincil yapının tahminler, esnek veya düzensiz dizinin tahminler hesaplayın ve ilgi protein (ler) içinde sarmal-bobin bölgelerini öngördü.
- Spiral-Coil tahminler hesaplamak için, http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi~~pobj gidin. Kopyala ve Dizi Kutusuna dizisi yapıştırın ve Gönder'i tıklayın.
NOT: Bu analiz kompozisyonu birkaç saat sürebilirlete. Shroom sekansları oldukça büyük olduğundan, sekanslar, web sunucusu boyutu kısıtlama uyacak şekilde en az 1000 amino asit bloklar halinde bölünmüş gerekebilir. Shrm2 analiz ederken, bu bölüm, sargılı-sargı bölgesi içerdiği bilinmektedir SHRM SD2 alanını ihtiva 1.000 C-terminal amino asitler kullanılır önerilir. Diğer proteinler ile bu analizi tekrar, mümkün tam boyda bir protein dizilerini kullanmak tavsiye edilir. Bu bir seçenek değilse, bilinen biyokimyasal veya fonksiyonel verilere dayalı diziyi mümkün olan en büyük parçasını kullanabilir veya teşrih. - Spiral-Coil tahminler hesaplamak için, http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi~~pobj gidin. Kopyala ve Dizi Kutusuna dizisi yapıştırın ve Gönder'i tıklayın.
- Spiral-Coil tahminler hesaplamak için, http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi~~pobj gidin. Kopyala ve Dizi Kutusuna dizisi yapıştırın ve Gönder'i tıklayın.
- Shroom dizisinin tek bir kapsamlı açıklama içine 1.2.2 adımlar 1.1 sonuçlarını birleştirin.
NOT: son derece de her türlü ilgili i içerecek şekilde teşvik edilmektedirbelirtilen bilgi Literatürde da bu aşamada, protein işlevi veya saflaştırma ile ilgili diğer kaynaklardan çıkarılabilir. - Bu kapsamlı açıklamalı dizisi kullanarak, koruma maksimize etmek için çalışıyoruz, protein alan sınırları (ya da olası sınırları bir dizi) tahmin ve düzensiz veya esnek dizisinin miktarını en aza indirerek yapısal özelliklerini öngördü. Eğer biliniyorsa, oluşan protein ilgi fonksiyonel özelliklerini muhafaza edilmelidir.
Bölüm 1'de Tanımlanan Alan Sınırları 2. Express ve Arındırmak Proteinler
NOT: Bu bölümün amacı, Bölüm 1'de oluşturulan hipotetik etki sınırlarını ekrana hızlı ve kolay bir şekilde ölçülebilir deneyleri bir dizi kullanmaktır.
- Standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak, His 10 -mRuby2-XH2 plazmid olan çerçeve istenen kodlama dizisinin bir sentezleme plazmidi üretmek (vektör haritası, için Şekil 3'e bakınıznd ek ayrıntılar).
- 18-24 saat boyunca oda sıcaklığında autoinduction ortam 1 BL21 (DE3), E. coli ya da başka uygun bir ifade suşu kullanılarak her bir ifade plazmidi için test ekspresyon seviyeleri.
- örneğin burada bir (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial gibi hücreler ile birlikte ya da sağlam bir transformasyon protokolü kullanılarak talimatlar aşağıdaki sentezleme plasmidleri ve BL21 (DE3) içine boş plazmid kontrol Dönüşümü -Dönüşüm /).
- Taze dönüştürülmüş plaktan, tek bir koloni almak ve 34 ug / ml kanamisin ile gece boyunca lizojeni Broth'ta 37 ° C (LB) ortamı bir 5 mi Başlangıç kültürünün yetiştirilmesi.
- Ertesi gün, kültür pelet ve taze LB ile pelet yıkayın
- 34 ug / ml kanamisin ile autoinduction ortam, 50 ml başlatıcı kültürün ekleyin. Kültür oda sıcaklığında ya da 37 ° C'de, ya da doygunluk büyümeye olanak sağlar. Tipik olarak, 18-24 saat ~ için büyür.
- Pelet hücresis ve saflaştırmaya süresiz önce -80 ° C 'de elde edilen hücre pelletleri dondurma.
- en verimli istenen füzyon proteinini üreten soy belirlemek için her sentezleme gerilme ve SDS-PAGE ile, boş vektör kontrol alınmış bütün hücre özütleri karşılaştır. Onun 10 -mRuby2-Shroom SD2 füzyon proteinleri için, 50 dakika ~ ya da boya cephesinin, jel 22 alt ulaşıncaya kadar 180 V,% 10 SDS-PAGE jellerinin çalıştırın.
- Coomassie Mavisi ile Leke jel her bir suş 23 içinde toplam hücresel protein görselleştirmek için.
- başarılı bir şekilde mRuby2-füzyon proteinini ifade her bir suş ile ilgili bir ilk afinite kromatografi aşamasında gerçekleştirin. Tipik haliyle, protein, 4 ° C de saflaştırma gibi değişen koşullara yararlanacaktır sürece saflaştırma, oda sıcaklığında 2.3.2-2.3.7 adımları gerçekleştirmek.
- Aşama 2.2.5 gelen çözülme hücre topakları.
- liziz tamponu (% 10 gliserol, 500 mM NaCI, 40, 1.5 ml, her hücre pelletinimM imidazol, 20 mM Tris pH 8.0, 1 mM p-merkaptoetanol). uygun protez önleyicileri ile liziz tamponu Ek.
- 10 mg / ml lizozim, 30 ul ilave edin ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. enstrüman için yönergeleri izleyerek sonikasyon kullanılır.
- çözünmeyen materyal ya da çözünen hücreler pelet 14,000 x g'de 30 dakika boyunca masa üstü bir santrifüj içinde 1.5 ml tüp ve santrifüj içine aktarın. SDS-PAGE yoluyla sonraki analiz için supernatant ve pelet hem kaydedin.
- Ni-NTA boncuk 100 uL eriyebilir kısma kuluçkalanması, nikel afinite saflaştırma gerçekleştirmek. boncuk karıştırmak için birkaç kez ters yüz, 5-10 dakika boyunca Çözünür lizat boncuk inkübe edin.
- boncuk pelet bir masaüstü santrifüj 30 saniye boyunca 800 x g'de santrifüjleyin. non-spesifik kirleticiler temizlemek için lizis tamponu ile pelet 3-5 kez yıkayarak bu izleyin.
- liziz tamponu ile boncuk elute Ruby füzyon proteini 1 ile desteklenmişM imidazol.
- Yukarıda "hızlı ve kirli" saflaştırma His-mRuby2-Shroom proteinlerinin davranışını karşılaştırmak için SDS-PAGE kullanın.
3. karakterize Protein Numune Avantajlı özellikleri olanlar tanımak
- Yakut füzyon proteini konsantrasyonunu ölçmek ve sonra da ana PAGE jeli 24 üzerinde füzyon proteininin 1-5 ug yükleme numunenin homojenliğini değerlendirmek için 280 nm'de bir spektrofotometre seti kullanın. 175 V 140 dakika boyunca, 4 ° C'de,% 10 yerel PAGE jel üzerinde çalıştırıldı
- Görüntü mruby-etiketli füzyon bu testte göç nerede gözlemleyerek, floresan görselleştirmek için donanımlı bir görüntüleyici kullanarak yerel SAYFA.
NOT: Bu proteinin muhtemelen toplandığında sıra kalmış füzyon proteini gözlemlemek için dikkatli olun. Bir floresan görüntüleme mevcut değilse, bir çoğu görselleştirmek ve Ruby görüntü konsantre örnekleri siyah ışık altında ya da bir UV ışık kutusu ile protein etiketledi.
- Görüntü mruby-etiketli füzyon bu testte göç nerede gözlemleyerek, floresan görselleştirmek için donanımlı bir görüntüleyici kullanarak yerel SAYFA.
- stabil katlanmış etki tespit etmek sınırlı proteoliz gerçekleştirin. % 0.025 subtilisin A. 5 ul / ~ 1 mg ml Ruby-SHRM SD2 füzyon 95 ul inkübe
- zaman noktalarında reaksiyonu Örnek 0, 0.5, 2, 5, 15, 60 ve 120 dakika sonra, her bir zaman noktası için reaksiyonundan 10 ul çıkarılması ve% 15 akrilamid jel kullanılarak, SDS-PAGE yoluyla tepkimenin ilerleyişinin görüntülenmesi .
- Adım 2.2.7 olarak Coomassie Mavisi ile leke ve bir proteaz dirençli türler tespit edilebilir olup olmadığını değerlendirir.
- çözelti, bu proteinlerin genel davranışı hakkında kapsamlı bir değerlendirme olarak, kısmen saflaştırılmış mRuby2-Shroom füzyon proteinlerinin üzerinde saflaştırma verimi, davranış yerel PAGE ve sınırlı proteoliz veri entegre.
- Uygun fonksiyonel tahlil varsa (İsteğe bağlı), bu noktada etkinlik için kontrol edin.
4. Coiled-coil SD2 Yüksek Kalite Kristaller ÜretenShroom Etki Alanı
Not: Protein, genellikle farklı sıcaklıkta saflaştırma 4 ° C yararlanacak sürece bölüm 4.1 içinde Bütün aşamalar oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
- İfade ve saflaştırma potansiyeli kaba bir tahmin olarak 50 mi büyümeleri kullanarak, tamamen saflaştırılmış örnek 5-20 mg elde etme amacı ile mRuby2-Shroom SD2 büyük ölçekli ifadeleri gerçekleştirin. Tipik olarak kültür 2L yeterli başlangıç malzemesi sağlar. 10 dakika için 8000 x g'de santrifüjleme ile büyüme pelet sonra hücreler.
- liziz için lizozim kullanılarak donmuş hücre peleti gramı başına liziz ~ 2 ml kullanılarak, daha önce parçalama tamponu içinde 2 L büyüme pelletini. Alternatif olarak, ~ 8 ml / g pelet de tekrar süspansiyon bir homojenleştirici veya Fransızca basın kullanarak eğer. 30 dakika süre ile 30,000 x g'de santrifüj ile hücre yıkıntıları pelet haline.
- Toplu Ni-NTA reçinesi 10 ml kullanılarak 4.1.1 çözünür fraksiyonu bağlanır. Uygun yerçekimi sütunu içine dökünve ilişkisiz proteinler boşalmasını sağlayın.
- Yıkama, 1 M NaCl ilave lizis tamponu ile yıkama, ardından liziz tamponu, 40 ml ile 3-5 kez reçine.
- 80 mM imidazol ile takviye liziz tamponu, 40 ml ile yıkayın reçinesi.
- 1 M imidazol ilave lizis tamponu 40 ml Ruby Shroom füzyon proteinini ayrıştırmak. El 4-10 ml'lik kısımlar halinde elüt protein fraksiyonlanması.
- % 10 SDS-PAGE kullanılarak Ruby-Shroom füzyon proteinini ihtiva eden fraksiyonlar teyit edin.
- % 8 gliserol, 250 mM NaCI, 15 mM imidazol, 20 mM Tris pH 8.0 içinde (tipik olarak 2-4 kısım), uygun fraksiyonlar Dialyze, 1 mM β-ME 6-8 kDa'lık bir MWCO diyaliz tüpü kullanılarak. Füzyon proteininin her 25-50 mg TEV proteaz 1 mg ekleyin. Yavaş karıştırma ile gece boyunca oda sıcaklığında dialyze.
- Tekrarlama nikel yakınlık arıtma 4.1.2 adımları. 4.1.6 için. Onun 10 -mRuby2 bağlı kalır iken Shroom SD2 alanı artık ilişkisiz fraksiyon kalmalıdırReçine ve elüsyon fraksiyonlarında bulunur. Coomassie Mavisi ile bu kullanarak% 12 SDS-PAGE boyama onaylayın.
- % 8 gliserol, 100 mM NaCl, 5 mM p-merkaptoetanol tamponu, gece boyunca 20 mM Tris, pH 8.0 içine Shroom SD2 domenini ihtiva eden fraksiyonlar dialyze.
- Bir FPLC kullanılması ile anyon değişim kromatografisi 25 gerçekleştirin ve 0.1-1.0 M NaCI bir NaCI gradyanı ile elüt edilerek kromatograflanmıştır. % 12 SDS-PAGE kullanılarak kesirler analiz edin.
- Bir spin konsantratör (10. kDa'lık bir MWCO veya daha proteini çalışılan bağlı olarak),% 12 SDS-PAGE ile zirve fraksiyonları analiz ~ 0 mg / ml, ve daha sonra, boyut dışlama kromatografisi 26 gerçekleştirmek için pik fraksiyonlar konsantre edilir.
- Havuz tepe fraksiyonları ve 20 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCI,% 2 gliserol içine diyaliz 1 mM β-ME ve / ml kristalleştirmeden önce 10 mg konsantre edilir.
İsteğe bağlı: Bu adımda, bir konsantrasyonda 5 ul numune kaldırma 1, 2, 5, ve 10 mg / ml lik bir numuneyi konsantre sırasında.Bu adım sırasında, örneğin davranış bakmak her numunenin bir nativ PAGE yükleme 2-5 ul çalıştırın.
- kristallendirme çalışmalarında için en uygun protein konsantrasyonunun tespit etmek 12 koşulları küçük dizisi taramasında. Bu koşulların bileşim olup, Şekil 7'de tarif edilmektedir.
- Buhar difüzyon yönteminde, pipetleme ile kristalizasyon denemeler gerçekleştirmek 24-çukurlu, kuluçka süresi, damla kristalleştirme tepsileri, ilk başta çözelti 1 ul lamelleri protein örneğinin 1 ul içeren damlalar, ardından ayrı bir kuyu içine 12 koşullarının her birinin 500 ul . Bu teknikle ilgili ek bilgi için 27 bakınız.
- Hızla şeffaf bir bantla tepsiyi mühür ve titreşimsiz bir uygun sıcaklık kontrollü bir ortamda kaseti taşıyın. değişebilir kullanılan sıcaklık, ancak 4 ° C, 16 ° C ve 20 ° C oldukça yaygındır.
- Sonraki 3 gün boyunca tepsilere damla incelemek100X büyütme kadar bir mikroskop kullanılarak ays. 3 günlük dönemin sonunda, hiçbir yağış (net), hafif yağış, ağır yağış (kahverengi), ya da kristaller içeren her damla puan. Uygun bir protein konsantrasyonu en fazla 6, ağır çökeltilerin içermelidir.
- 4.2 tanımlanan protein konsantrasyonu, ticari olarak temin edilebilir kristalizasyon ekranlar geniş bir ekran. Ayrıca damla hatayı en aza indirerek bir sıvı taşıma veya kristalleşme robotun kullanımı büyük ölçüde bu süreci hızlandırır. Bu kullanıcı tek bir örnek ile daha fazla koşul ekrana izin, hem de çok daha az protein gerektirir.
- sistematik olarak daha önce 24-iyi tarama tepsileri kullanarak kristalleşme damla içinde değişkenlerin her değiştirerek geniş ekranlarından tespit başlangıç koşullarını iyileştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu sistemde kullanılan iş akışı gösteren bir diyagram Şekil 1'de gösterildiği ve üç ana aşamadan içerir. dizinin Hesaplamalı analiz ilgi sarmal-bobin proteinin etki alanı sınırları konusunda hipotezler geliştirmek için kullanılmaktadır. Shrm2 SD2 alanının açıklamalı bir analizinin bir örneği, Şekil 2'de gösterilmiştir. Bu diyagramda, hedef Shroom SD2 adı sitoskeletal regülatör C-terminusunda korunmuş bir alan için olası etki sınırlarını tespit etmek olmuştur. Bu analizden varsayımsal etki alanı sınırları üç ayrı set kristalleşme için en iyi aday olarak sona erdi C-ucuna yakın tüm korunmuş SD2 ya da çok az fragmanlarını kapsayan sarmal-bobin parçalarını içeren üretildi oldu. Dizi analizi ile ilgili tanımlanan adaylar daha sonra hızlı bir şekilde (Şekil 3) fo mRuby2 ile bir protein füzyonu kullanılarak küçük bir ölçekte test edilirverimli analiz r. Örnek (küçük kültürün 50 mL) ile iki arasında saflaştırma His 10 -mRuby2 etiketli proteinler, Şekil 4'te gösterilmiştir. Bu şekilde, bir çözünmeyen protein davranışı çözünebilir muadili ile karşılaştırıldığında kolayca anlayacaklardır. Kötü ifade eden ya da çözünmeyen protein füzyonları kolay ve hızlı bir şekilde, bu şekilde tespit edilir. Sınırlı proteoliz ile protein fragmanlarının biyokimyasal analizler tarif edilen veya izole edilmiş ve saflaştırılmış Shroom SD2 etki Ruby sistemi kalmamak kullanarak fragmanlarının çeşitli Şekil 5'te gösterilmiştir. Şekil 5A'da, bir fare SHRM SD2 iki modeli Şekil 3'te # 2 ve # 1, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (0-1.0%) kaynaklı proteaz konsantrasyonu gradyanı kullanılarak sindirildi varsayımsal alan sınırları tekabül etmektedir. Bunların her ikisi de etkili bir orta enzim konsantrasyonlarında küçük ürünlerin bir dizi haline bozulmuş bulundu. Şekil 5B, sam gösterire deneyi Drosophila SHRM SD2 gelen varsayımsal sınır 3. kullanılarak yapıldı. Bu protein, kristalize yoktu ve yapısı 19 tarif edilmiştir. Yukarıdaki protokole oluşturulan olarak Ruby-füzyonu incelerken proteolitik analizi de yararlı olabilir. Şekil 5C'de, insan Shrm2 SD2 (1427-1610) ile birlikte bir Ruby füzyon proteini de gösterildiği gibi, belirtilen zaman noktalarında, oda sıcaklığında, spesifik olmayan proteaz Subtilisin yüksek bir konsantrasyonunun (% 0.025) ile sindirildi. Burada Ruby ve SHRM arasındaki bağlayıcının hemen beklenen bir şekilde ayrıldı. Ayrıca, küçük ürünler diğer iki proteaz duyarlı bölgeleri bu proteini vardır belirten, ancak, 2 dakika içinde üretildi bozunma ürünleri aslında oldukça kararlı protein gösteren deney geri kalanı boyunca büyük ölçüde sağlam kaldı oluşmuştur.
Tamamlayıcı bir yaklaşım yerli SAYFA analys kullanılarak gösterilirŞekil 6'da yer almaktadır. SHRM içinde belirtilen nokta mutasyonları içeren Şekil 6A, içinde Ruby-etiketli insan SHRM SD2 (1427-1610) yanı sıra protein doğal PAGE ile analiz edilir. kristalleşmez üç mutant önemli ölçüde farklı bir davranış varken Bu deneyde, (kristaller oluşturur) vahşi-tür proteini, iki farklı bantlar olarak çalışır. Sistem, aynı zamanda protein kompleksleri yararlı olabilir göstermek için, Shroom-kaya komplekslerinin çeşitli Şekil 6B'de yerel PAGE ile analiz edildi. Bu durumda, insan Shrm2 SD2 aynı parçası (1427-1610), insan Rock, farklı parçaları kullanılmıştır ise, analiz açıklığa kavuşturmak için kullanıldı. Bu yaklaşım, kompleksleri Kaya 700-906 ve 746-906, birden fazla tür sahip yağlı ve daha az homojen olan kullanılarak meydana getirdiğini öne sürdü. kristaller oluşmaya birçok hafta sürdü ve aleyhte olmasına rağmen, 788-906 kullanan kompleksler değil dramatik olsa düzeldi ve bu türün kristalize başardıtained Kaya proteini bozulmuş. Kaya 834-913 kullanılarak oluşturulan kompleksler jel üzerinde tek ve daha üniform türler oluşturduğu ve hali hazırda, gece boyunca kristallendirildi. Şekil 7, kristallendirme çalışmalarında protein örneğinin davranışına bilgilendirmek için kullanılan ortak kristalleştirme olan bir dizi şartı göstermektedir ve herhangi bir protein ile, genel olarak kullanılabilir. İdeal olarak, açık ve çökeltme koşullarını bir karışımı elde edilecektir. birçok durumda çökelmesi olanlar daha düşük bir protein konsantrasyonunda ve protein çözünürlüğünü teşvik tamponlama koşulları ile birlikte kullanılmalıdır ise çökelti oluşturmayan proteinler yüksek konsantrasyonlarda ve daha sıkı tamponlama koşulları gerektirir.
Şekil 1: Diagram Akışı. hesaplamalı dizi analizi ve biyokimyasal ve entegrasyonunu gösteren bir genelleştirilmiş şemasıetki alanı sınırlarını belirleyen ve kristalleşme için protein fragmanlarını belirlenmesi için kapsamlı bir strateji içine diğer ıslak laboratuvar teknikleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Shroom dan sarmal-coil SD2 etki alanı için Açıklamalı dizi analizi. Hesaplamalı bir bindirme CLUSTAL omega tarafından üretilir ve Jalview (adım 1.1) içinde sekans özdeşliğinin renklendirilmiş bir çoklu dizi hizalama dahil Shroom SD2 alan için analiz eder. Ayrıca ikincil yapısını, düzensiz dizi tahminler ve Shroom SD2 etki sarmal-bobin tahminler (Adım 1.2) tahmin edilmektedir dahil. gözlenen sınırları ve ikincil yapı olarak varsayımsal alan sınırları (1.3 Adım) gösterilirsonraki kristalografik analizi 19 ortaya koyduğu gibi unsurlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: His 10 -mRuby2-sentezleme sistemi diyagramı. (A) şematik sentezleme vektörünün His 10 -mRuby2-XH2 vektörü, bu çalışmada kullanılan. Bu vektör, çoklu klonlama alanının (B) Diyagram. Protein kodlayıcı diziler genellikle, BamHI ve EcoRI klonlama sitelerinin ile bu vektöre yerleştirilir. mRuby2 proteininin aşırı C-terminali kırmızı gösterilir, TEV proteaz bölme sitesi parantez ve kırmızı üçgen olarak gösterilen bölünme sitesi ile gösterilir. mRuby2 TEV site arasında bir linker dizisi mavi gösterilmiştir.Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: İki mRuby2 Temsilcisi küçük ölçekli saflaştırma füzyon proteinleri etiketli. (A), bakteriyel kültür sentezleme Ruby SHRM SD2 veya çözünmez olduğu bilinen olmayan Ruby füzyon proteininin numune bir görüntü resmedilmiştir. Ruby-etiketi olmadan bir proteini ifade ayrı bir kültür karşılaştırma için gösterilmiştir. Çözünebilir Ruby-SHRM SD2 görselleştirme gösteren (B), 30 dakika boyunca 30,000 x g'de liziz ve santrifüj Aşağıda, yukarıda görüntülenmiştir kültürlerinden çözünebilir fraksiyon. Bağlandıktan sonra Ni-NTA boncuk (C), görüntü ve yakut-SHRM SD2 üzerinde hareketsiz olduğunu belirten bir sonraki yıkama adımlarıboncuklar. (D) Aşama 2.3.6 ve 2.3.7 de tarif edildiği gibi yıkama ve elüsyon adımları numuneleri ve etkili bir kolondan elüt edilip ayrılmıştır 80 mM imidazol mevcudiyetinde ise Ruby SHRM SD2 füzyon reçinesine bağlı olduğunu ortaya koymaktadır 1 M imidazol elüsyon tamponu ile yıkandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: Farklı Shroom proteinlerden aday SD2 etki sınırlı proteoliz. Çeşitli Shroom proteinler dört SD2 alan bir karşılaştırması. (A ve B) belirtilen SHRM SD2 fragmanları, SDS-PAGE ile analiz% 1.0, 0 ila proteaz tripsin bir konsantrasyon gradyanı sonuçları ile inkübe edildi. bu protein parçası wit ilişkisih varsayımsal sınırları belirtilmiştir. Protokolde tarif edilen zaman süreci yöntemi kullanılarak His 10 -mRuby2-Shroom SD2 füzyon proteininin sınırlı proteolitik sindirimi (C), SDS-PAGE analizi. Reaksiyon,% 0.025, oda sıcaklığında tripsin ile meydana geldi. Ruby ve Shroom SD2 arasındaki bağlayıcının sindirimi hızlıdır ve bir iç kontrol olarak hizmet vermektedir. Onun 10 -mRuby2-Shroom SD2 füzyon proteini ile-arındırır co A varsayılan bozunma ürünü (*) belirtilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: Yerel jel kullanılarak protein davranış değişiklikleri gözlemek. (A) mRuby2-Shroo özelliklerini değiştiren bir mutant etkisini gösteren,% 10 yerel PAGEm SD2. SD2 içinde belirtilen nokta mutantlar anormal göç desen bir dizi görüntüler ise bu koşullar altında SHRM SD2, iki ayrı bantları olarak çalışır. (B) Rock farklı sürümlerini kullanılarak oluşturulan ve yerli PAGE ile analiz Shroom SD2-Kaya komplekslerinin karşılaştırılması. Shroom SD2 ve Kaya kinazın belirtilen parçalarının (her ikisi de halkalaştırılmış halka proteinleri) arasında kompleksler yerel PAGE ile çözüldü. Kristaller hızla kristalize birkaç hafta ancak Kaya 834-913 içeren kompleks sonra Kaya 788-906 içeren kompleks elde edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7: kristalleşme Hızlı birincil ekran. (A) Ortak kristalleşme co hızlı bir ekranşulları kristallendirme çalışmalarında protein numunesinin davranışını değerlendirmek için kullanılır. Basit puanlama matrisi (B) Örnekler kristalleşme damla değerlendirmek için. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol kullanıcı kristalleşme kolaylaştırmak için büyük sarmal-coil proteinler içinde etki alanı sınırları belirlemeye yardımcı olmak için tasarlanmıştır. protokol potansiyel etki alanı sınırları bir dizi oluşturmak için hesaplamalı tahminler ve diğer kaynaklardan gelen verilerin çeşitli bütünsel dahil dayanır. Bu hızlı ve ucuz ve daha bu ilk hipotezleri geliştirmek için kullanılan biyokimyasal deneyler bir dizi tarafından takip edilmektedir. Bu yaklaşımı kullanarak, kullanıcının hızlı istenmeyen potansiyel protein parçalarını ortadan kaldırabilir ve böylece kristaller elde umutları iyileştirilmesi, daha iyi adayları daha fazla ilgi odağı.
Birçok önemli adımlar varsayımsal alan sınırları ilk setinin gelişme olarak kristallerinin üretimi için kritik hiçbiri, yine de, bu tekniğin içinde bulunmaktadır. Bu adım bilgi ob yanı sıra, hesaplamalı yaklaşımlar bünyesinde toplayanMevcut olduğunda Literatürde veya fonksiyonel verilerden tained. Bakım tahminler herhangi bir ölçülebilir güven değerini eklemek yerinde hiçbir yöntem bulunmuyor olarak tek bir "en iyi" çözüm aşağı hemen bilemek için strateji kullanarak önlemek için alınmalıdır. Bunun yerine, en iyi hızlı deneysel doğrulanması gerekir olası etki alanı sınırları küçük bir dizi tanımlamak için bir yöntem olarak kullanılmaktadır.
Bu protokol ile analiz edilebilir sarılmış bobin proteinlerinin özellikleri oldukça geniştir. hesaplama açısından, sarmal bobin tahminler gücü 20 amino asit, aşağıda sınırlıdır ve aşama 1.2.1'de belirtildiği gibi, sargılı-sargı bölgesi daha büyük 1000 amino asit DISOPRED ile analiz için birden çok bölüme bölünmesi gerekir. Biz web sunucusu tarafından dayatılan ve yöntem gelecekte yükseltilir olarak değişebilir gibi geçici bu sonradan sınırlama görüntüleyin. sonraki biyokimyasal analizler, ancak acıçeşitli yollarla. Birincisi, iç döngüler veya numune yapabilir proteazlar karşı aşırı duyarlı bölgeler aslında daha az kararlı görünmektedir. proteaz tarafından döngüler bölünen olan veya başka çentikli olan stabil proteinler hala kullanıcı her iki stratejileri keşfetmek tavsiye edilir neden olan, doğal PAGE istikrarlı bir görünüm vermelidir. Yerli SAYFA çok uzun ve jel yavaşça göç veya kendi özel şarj yapabilir çünkü onları tamamen jel dışarı ters yönde çalıştırmak ancak ya, çünkü bazı proteinler için zor olabilir. Bu durumlarda, yerel PAGE jeli sistemi için farklı tamponlama koşulları keşfetmek için yararlı olabilir.
Burada sunulan çalışma odak büyük halkalaştırılmış halka ihtiva eden proteinler üzerinde olsa da, bu protokol çok az uyarlamalar hemen hemen herhangi bir protein kullanılabilmektedir. Küresel proteinlerin birincil ilave böyle pDomTHREADER 28 <olarak etki tahmin yazılımı ek olurdu/ sup> veya DomPred 29 etki alanı sınırları aramak için, ve bu tür Phyre2 30 gibi tersiyer yapı tahminleri dizi analizi tahmin gücünü artırmak için. Ayrıca, orada ikincil yapı tahminleri ve düzensiz tahminler yapmak için birçok algoritma vardır ve ek algoritmalar dahil yararlı olabilir. Küresel proteinler genellikle enzimatik aktivite veya hedef seçimi sırasında önemli ek bilgiler sağlayacak diğer fonksiyonel readouts sahip. Bundan başka, orta ya da yüksek verimli teknikleri, uygun şekilde dahil edilebilir. Örneğin, 96-çukurlu formatta 1-2 ml'lik kültürlerde ve metal afinite saflaştırma için ucuz sistemleri 31 kolaylıkla temin edilebilir. Son olarak, en az örnek kullanarak kristalleşme deneylerin çok sayıda kurmak için robotik kullanımı rutin haline geliyor, ancak robotik sistemlerin verimli çalışması iyi karakterize protein örneklerinin davranışı esas alınmaktadır. İlaveBu protokole el değişiklikler afinite etiketleri çeşitli örnekleme içerebilir. Birçok farklı floresan etiketleri mevcuttur ya da bir floresan etiketi gerekli ya da yararlı değilse His, GST, Thioredoxin-, streptokok ve MBP- mevcut seçenekler onlarca arasındadır.
Bu yordamı gerçekleştirirken, kullanıcı mRuby2 etiketi ilgi kullanıcıların protein üzerindeki olası etkisine dikkatli olmalıdır. Farklı füzyonlarının çeşitli bu etiketi kullanılarak yaptığımız gözlemler çok kromatografik adımları bağlı kalan mRuby2 zaman, ilgi konusu proteine çok sıkı bir şekilde bağlanan gerçeğini destekler. Bu davranış açıkça istenmeyen bir durumdur, ancak istenmeyen Ruby kompleksleri genellikle ayrılabilir ve kromatografik kaldırıldı olabilir. MBP 32 için gözlenmiştir gibi bu bir hastabakıcı gibi davranış olup olmadığı belirsizdir.
kristaller elde ettikten sonra, yaygın COI ile karşı karşıyayız hala pek çok sorun vardırBu protokolde ele alınmamaktadır led-bobin proteinleri. En yaygın eksik menfezler veya anizotropik dağılmasını oluşmuş ya zayıf difraksiyon kalitesidir. Orada anizotropik kırınım 33 yardımcı olmak için yerinde araçlar vardır ve bu bazı sarmal-bobin yapıları 18,20 çözmek için kritik olmuştur. Birçok kristal patolojileri nedenle gelişmiş kırınım özelliklere sahip ek kristal formları aramak için sık sık ihtiyatlı olduğunu, hızla aşmak için ne yazık ki zordur. Bu koşullar binlerce robot tarama ile kolaylaştırılır. Alternatif olarak, dehidrasyon ya da 34 tohum olarak sapma kalitesini artırmak için çok sayıda, kristallendirme teknikleri vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BL21(DE3) Rosetta | Emd Millipore | 70954-3 | |
| BL21(DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | |
| BL21(DE3) Codon Plus | Agilent Technologies | 230245 | |
| Lysozyme | Spectrum Chemical Mfg Corp | L3008-5GM | |
| Ni-NTA resin | Life Technologies | 25216 | |
| SubtilisinA | Spectrum Chemical Mfg Corp | S1211-10ML | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-160 | |
| INTELLI-PLATE 96: | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
| PEG 3350 | Hampton research | HR2-591 | |
| PEG 8000 | Hampton research | HR2-515 | |
| PEG 400 | Hampton research | HR2-603 | |
| PEG 4000 | Hampton research | HR2-605 | |
| pcDNA3.1-Clover-mRuby2 | Addgene | 49089 | |
| Overnight Express Autoinduction System 1 | Emd Millipore | 71300 | |
| Lysogeny Broth powder | ThermoFisher Scientific | 12795027 |
References
- Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
- Chapman, T. Protein purification: pure but not simple. Nature. 434 (7034), 795-798 (2005).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. Predicting coiled coils from protein sequences. Science. 252 (5009), 1162-1164 (1991).
- Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils. J Struct Biol. 137 (1-2), 41-53 (2002).
- Lupas, A. N., Gruber, M. The structure of alpha-helical coiled coils. Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).
- Hernandez Alvarez, B., et al. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Eng Des Sel. 21 (1), 11-18 (2008).
- Slabinski, L., et al. The challenge of protein structure determination--lessons from structural genomics. Protein Sci. 16 (11), 2472-2482 (2007).
- Slabinski, L., et al. XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
- Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure. Curr Biol. 13 (24), 2125-2137 (2003).
- Hildebrand, J. D. Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network. J Cell Sci. 118 (Pt 22), 5191-5203 (2005).
- Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins. J Biol Chem. 281 (29), 20542-20554 (2006).
- Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction. Dev Dyn. 239 (7), 2078-2093 (2010).
- Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis. Mol Biol Cell. 22 (6), 795-805 (2011).
- Das, D., et al. The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice. Biol Open. 3 (9), 850-860 (2014).
- Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA. J Biol Chem. 279 (8), 7098-7104 (2004).
- Mohan, S., et al. Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology. PLoS One. 8 (12), e81075 (2013).
- Mohan, S., et al. Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction. Mol Biol Cell. 23 (11), 2131-2142 (2012).
- Tu, D., et al. Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I. PLoS One. 6 (3), e18080 (2011).
- Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol. 7, 539 (2011).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue. Anal Biochem. 48 (2), 617-620 (1972).
- Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Jungbauer, A., Hahn, R.
- Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography. J Chromatogr A. 1132 (1-2), 98-108 (2006).
- Giege, R. A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day. FEBS J. 280 (24), 6456-6497 (2013).
- Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination. Bioinformatics. 25 (14), 1761-1767 (2009).
- Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure. Protein Sci. 11 (12), 2814-2824 (2002).
- Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).
- Elsliger, M. A., et al. The JCSG high-throughput structural biology pipeline. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66 (Pt 10), 1137-1142 (2010).
- Bach, H., et al. Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies. J Mol Biol. 312 (1), 79-93 (2001).
- Strong, M., et al. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8060-8065 (2006).
- Heras, B., Martin, J. L. Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 9), 1173-1180 (2005).
