रैखिक Agarose चैनलों का उपयोग कर अध्ययन करने के लिए Published: November 26, 2016 doi: 10.3791/54892

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Xiao Sun¹, Ellie S. Heckscher^1,2

¹Committee on Development, Regeneration, and Stem Cell Biology, University of Chicago, ²Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

Summary

ड्रोसोफिला लार्वा व्यवहार के तंत्रिका नियंत्रण का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है। इस प्रकाशन रेखीय agarose चैनलों के उपयोग रैखिक रेंगने और विधियों की निरंतर मुकाबलों बटोर दोहराए रेंगने व्यवहार के दौरान लार्वा संरचनाओं की गतिशीलता यों तो वर्णन करता है।

Abstract

ड्रोसोफिला लार्वा रेंगने ज्ञानेन्द्रिय व्यवहार के तंत्रिका नियंत्रण का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल के रूप में उभर रहा है। , रोक मोड़, और meandering: हालांकि, फ्लैट खुला सतहों पर लार्वा रेंगने व्यवहार सहित जटिल है। आंदोलन के प्रदर्शनों की सूची में इस जटिलता की घटनाओं के लिए एक एकल क्रॉल प्रगति चक्र के दौरान होने वाली का विस्तृत विश्लेषण hinders। इस बाधा को दूर करने के लिए, रैखिक agarose चैनलों किए गए थे कि सीधे, निरंतर, लयबद्ध रेंगने के लार्वा व्यवहार विवश। सिद्धांत रूप में, क्योंकि agarose चैनलों और ड्रोसोफिला लार्वा शरीर दोनों ऑप्टिकली स्पष्ट कर रहे हैं, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट जांच द्वारा लेबल लार्वा संरचनाओं के आंदोलन बरकरार, लार्वा को स्वतंत्र रूप से चलती नजर रखी जा सकती है। अतीत में, लार्वा रैखिक चैनलों में रखा गया था और पूरे जीव, खंड के स्तर पर रेंगने, और मांसपेशियों ¹ विश्लेषण किया गया। भविष्य में, लार्वा चैनलों में रेंगने न्यूरो नजर रखने के लिए कैल्शियम इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकताएनएएल गतिविधि। इसके अलावा, इन तरीकों में से किसी भी जीनोटाइप के लार्वा के साथ और किसी भी शोधकर्ता से डिजाइन चैनल के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रकार से नीचे प्रस्तुत प्रोटोकॉल मोटर नियंत्रण समझने के लिए एक मॉडल के रूप में ड्रोसोफिला लार्वा का उपयोग करते हुए अध्ययन के लिए व्यापक रूप से लागू है।

Introduction

इस विधि के समग्र लक्ष्य के बारे में विस्तार से ड्रोसोफिला लार्वा रेंगने का अध्ययन है। हरकत पर प्रयोगों के विकास और मोटर नियंत्रण ² पर सिद्धांतों का परीक्षण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। परंपरागत रूप से हरकत जलीय जानवर (जैसे, जोंक, एक प्रकार की मछली, मेढक) ³ में अध्ययन किया गया है। इन जानवरों में हरकत का दोहराव प्रकृति rhythmogenesis के अध्ययन के लिए अनुमति दी गई है, हरकत ड्राइविंग biophysical घटनाओं के विश्लेषण के लिए, और तंत्रिका गोलीबारी पैटर्न है कि हरकत के साथ निगरानी के लिए।

सतही आनुवंशिकी, अच्छी तरह से विशेषता विकास, एक शरीर है कि पहले और दूसरे instars पर ऑप्टिकली स्पष्ट है, और पूरे के चल रहे एक संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म पुनर्निर्माण: हरकत की पढ़ाई के लिए ड्रोसोफिला लार्वा का उपयोग अन्य मॉडल प्रणाली अधिक लाभ की एक अद्वितीय संयोजन प्रस्तुत करता है तंत्रिका तंत्र ^4-6। हालांकि, ड्रोसोफिला लार्वा लोकोफ्लैट खुले सतहों पर गति रुक जाता सहित कुछ हद तक जटिल है, बदल जाता है, और चकरा देने वाली क्रॉल ^7। इस प्रकाशन रेखीय agarose चैनलों का उपयोग करने के लिए ड्रोसोफिला लार्वा हरकत व्यवहार मार्गदर्शन करने के लिए कि इस तरह के लार्वा निरंतर प्रदर्शन करते हैं, सीधे, लयबद्ध रेंगने व्यवहार एक विधि प्रस्तुत करता है।

, Agarose चैनलों में ड्रोसोफिला लार्वा व्यवहार का अध्ययन फ्लैट खुला सतहों पर व्यवहार करने के बजाय, कई फायदे हैं। सबसे पहले, यह शोधकर्ताओं ने विशेष रूप से कई आंदोलनों कि लार्वा व्यवहार प्रदर्शनों की सूची का हिस्सा हैं से व्यवहार रेंगने चयन करने के लिए अनुमति देता है। दूसरा, बनाम लार्वा शरीर के आकार चैनल की चौड़ाई का समायोजन करके, रेंगने की गति समायोजित किया जा सकता है। तीसरा, चैनलों के लिए लार्वा कैसे लार्वा भरी हुई है और चैनल के भीतर उन्मुख है के आधार पर पृष्ठीय, उदर, या पार्श्व की ओर से देखा जा करने के लिए अनुमति देते हैं। लार्वा अभिविन्यास में इस बहुमुखी प्रतिभा के हित के किसी भी संरचना रेंगने के दौरान लगातार दिखाई करने के लिए अनुमति देता है। चौथा,चैनलों सूक्ष्मदर्शी और उद्देश्यों की एक विस्तृत विविधता के साथ प्रयोग के लिए उत्तरदायी हैं। उदाहरण के लिए, रैखिक चैनलों उज्ज्वल क्षेत्र stereoscopes और / या कताई डिस्क confocal सूक्ष्मदर्शी ¹ पर उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए पर कम संकल्प इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पांचवां, इस विधि के किसी भी आनुवंशिक पृष्ठभूमि में optogenetic / thermogenetic न्यूरोनल जोड़तोड़ के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है। अंत में, क्योंकि दोनों लार्वा शरीर (पहले और दूसरे instars पर) और agarose चैनलों ऑप्टिकली स्पष्ट कर रहे हैं, जब चैनलों गतिशील आंदोलनों, या आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट जांच द्वारा लेबल लार्वा संरचनाओं के फ्लोरोसेंट तीव्रता में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

विधि वर्णित पहली और दूसरी instar ड्रोसोफिला लार्वा व्यवहार की विस्तृत विज्ञान सम्बन्धी अध्ययन के लिए उपयुक्त है। इस प्रकाशन चैनलों के उपयोग के प्रदर्शन को आगे लार्वा रेंगने के दौरान सीएनएस के फ्लोरोसेंट तीव्रता में गतिशील परिवर्तन का विश्लेषण करती है और एक अग्रदूत के रूप में करने के लिए NeuRonal कैल्शियम इमेजिंग।

Protocol

1. लार्वा की तैयारी

1. एक सप्ताह के व्यवहार रिकॉर्डिंग से पहले, एक क्रॉस (25 कुंवारियों और 5 पुरुषों के न्यूनतम) की स्थापना की। 25 डिग्री सेल्सियस पर सब पार और संतान को बनाए रखें।
   नोट: संस्कृति की स्थिति का तापमान बदला जा सकता है, लेकिन समय की रेखा से नीचे वर्णित विकास की गति में परिवर्तन के लिए खाते में समायोजित करने की आवश्यकता होगी।
2. 5 दिन की रिकॉर्डिंग सुबह में, पहली बात करने से पहले, एक अगर / रस टोपी और अगर / रस टोपी के केंद्र में खमीर पेस्ट का एक थपका (0.5-1 एमएल) के साथ एक संग्रह पिंजरे में क्रॉस जगह है।
   1. एक संग्रह पिंजरे बनाने के लिए, एक 6 आस्ट्रेलिया में छेद प्रहार। वर्ग पॉलीथीन ड्रोसोफिला बोतल।
   2. अगर / रस टोपियां बनाने के लिए, एक शंक्वाकार फ्लास्क में 600 मिलीलीटर पानी के साथ अगर की 18 ग्राम मिश्रण। 200 मिलीलीटर सेब के रस के साथ एक अलग कुप्पी मिश्रण 20 ग्राम sucrose में। ठोस जब तक माइक्रोवेव भंग कर रहे हैं। गठबंधन और हलचल, मिश्रण 60 डिग्री सेल्सियस को शांत करने के लिए अनुमति देता है। 95% इथेनॉल में 20 मिलीलीटर 10% मिथाइल-P-hydroxybenzoate जोड़ें, और हलचल। जोड़े ~ 7मिलीलीटर एक 35 x 10 मिमी दौर पेट्री डिश के नीचे आधा करने के लिए। अगर / रस आरटी पर 1 घंटे के लिए जमना करने की अनुमति दें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
   3. खमीर पेस्ट बनाने के लिए, मात्रा सूखी खमीर और पानी से बराबर भागों को जोड़ने। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
3. लार्वा संग्रह के स्वास्थ्य की जाँच करें।
   1. सुबह में, 4 और 3 दिन की रिकॉर्डिंग से पहले, टोपी को हटा दें और पिंजरे पर एक ताजा टोपी रखें। प्रत्येक दिन एक ही समय में टोपियां बदलें और अंडे की एक 24 घंटा संग्रह नव रची लार्वा पाने के लिए।
   2. प्रत्येक टोपी के बाद हटा दिया जाता है, देखने के लिए कितने अंडे पार बिछाने है यह जांच करते हैं। 500-2,000 अंडे के बीच की अपेक्षा करें। यदि आवश्यक हो तो, वयस्कों की संख्या को समायोजित करें।
      नोट: कुछ अंडे लार्वा में रची है चाहिए, और नव रची लार्वा खमीर पेस्ट से दूर मिल जाएगा।
   3. 24 घंटे के लिए प्रत्येक टोपी उम्र। पता लगाएँ कि क्या लार्वा स्वस्थ हैं टोपी को फिर से जांच करते हैं।
      नोट: अधिकांश अंडे लार्वा में रची है चाहिए, और लार्वा तु में क्रॉल किया जाना चाहिए थाएएसटी पेस्ट। गरीबों के स्वास्थ्य के लक्षण पेट में महत्वपूर्ण काले धब्बे के साथ unhatched अंडे की एक बड़ी संख्या है, खमीर पेस्ट से दूर मृत लार्वा निकायों, और लार्वा, एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का संकेत शामिल हैं। लार्वा अस्वस्थ हैं, तो, पिंजरे बदल ताजा टोपियां / खमीर पेस्ट बना लें, और जीनोटाइप की जाँच करें।
   4. वर्ष टोपियां त्यागें।
4. व्यवहार रिकॉर्डिंग के लिए लार्वा लीजिए।
   1. रिकॉर्डिंग से पहले दोनों 2 और 1 दिन में टोपी को हटा दें और एक ताजा टोपी के साथ बदलें।
   2. प्रत्येक हटा टोपी लेबल और 25 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं। इस व्यवहार रिकॉर्डिंग के लिए लार्वा का मंचन एक श्रृंखला का उत्पादन होगा। नव रची (0-4 घंटा के posthatch) दूसरे instar (24-48 घंटा posthatch) के माध्यम से लार्वा चैनलों में इस्तेमाल किया जा सकता है। लगातार दिन पर रिकॉर्डिंग के लिए टोपियां बचाओ।
   3. 48 घंटे के बाद सभी टोपियां त्यागें।
   4. यदि आवश्यक हो, के लिए साइन अप करने के लिए 5 अतिरिक्त डी चरणों को दोहराएँ 1.4.1-1.4.3। कि कम होने के बाद निषेचित अंडे का उत्पादन किया जाता है।

1. रैखिक चैनल PDMS (Polydimethylsiloxane, एक सिलिकॉन elastomer) कास्टिंग मोल्ड (चित्रा 1 ए) तैयार करें। नए नए साँचे कास्टिंग PDMS अनुरोध पर हेक्शेर प्रयोगशाला से उपलब्ध हैं।
   1. isopropyl शराब के साथ कास्टिंग मोल्ड साफ करें। शुष्क हवा, थपका प्रयोगशाला पोंछे के साथ सूखी, या कैन्ड हवा का उपयोग करें।
   2. कास्टिंग मोल्ड एक 10 सेमी पेट्री डिश ढक्कन या अन्य कंटेनर में रखें।
2. तैयार है और agarose समाधान डालना।
   1. जब तक पूरी तरह से भंग microwaving द्वारा पानी में एक 3% agarose समाधान (100 मिलीलीटर में 3 जी) बनाओ।
   2. 55 डिग्री सेल्सियस के लिए कूल, बुलबुले की सतह के लिए वृद्धि करने के लिए अनुमति देता है।
   3. कास्टिंग ढालना इतना है कि मोल्ड सिर्फ कवर किया जाता है युक्त पेट्री डिश में agarose मिश्रण डालो। agarose सेट करते हैं जब तक बढ़ाया।
3. कास्टिंग ढालना से agarose चैनलों निकालें। एक धार के साथ agarose डिस्क के किनारों ट्रिम।
   1. चैनल रखोपानी में डूबे एक 10 सेमी पेट्री डिश में है। वे 7 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।

3. रिकार्ड व्यवहार करने के लिए एक चैनल में एक लार्वा लोड हो रहा है

नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर चैनलों के भंडारण, तो चैनलों व्यवहार रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग करने से पहले आरटी के लिए आने के लिए अनुमति देते हैं।

1. एक साफ रेजर ब्लेड का प्रयोग चरण 2 (2A चित्रा) में तैयार किया है उन में से एक भी चैनल में कटौती करने के लिए।
2. चैनल एक गिलास coverslip (चित्रा 2 बी) पर अंडाकार साइड-अप करने के लिए जगह संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। आकार और coverslip की मोटाई विशिष्ट इमेजिंग के लिए इस्तेमाल गुंजाइश पर निर्भर करता है।
3. अगर / रस चरण 1 में तैयार टोपी से एक लार्वा का चयन करें और कटौती चैनल (चित्रा -2) में जगह ठीक संदंश का प्रयोग करें।
   1. लार्वा निचोड़ मत करो। संदंश शाखा की नोक के साथ धीरे इसे उठाओ। यह भी ठीक एक बिंदु के साथ एक तूलिका के साथ लार्वा हेरफेर करने के लिए संभव है।
      नोट: यह महत्वपूर्ण है लार्वा के रूप में बहुत सेन हैंस्पर्श करने के लिए sitive। वे सावधानी से नियंत्रित नहीं कर रहे हैं, तो nociceptive प्रतिक्रियाओं प्रयोग के पहले कुछ सेकंड के दौरान उनके व्यवहार पर हावी हो सकता है।
   2. संक्षेप में उन्हें पानी में जलमग्न द्वारा लार्वा धो लें।
   3. कटौती चैनल पर लार्वा रखने के बाद, संदंश शाखा की नोक का उपयोग धीरे चैनल ग्रोव में लार्वा तंग करने के लिए।
      नोट: सबसे अनुप्रयोगों के लिए लार्वा की चौड़ाई और चैनल की चौड़ाई से मेल खाना चाहिए। विकास के विभिन्न चरणों में लार्वा की औसत चौड़ाई इस प्रकार है: 0 घंटा posthatch - 140 माइक्रोन, 24 घंटा posthatch - 180 माइक्रोन, 48 घंटा posthatch - 320 माइक्रोन, 72 घंटा posthatch - 500 माइक्रोन, 96 घंटा के posthatch - 750 माइक्रोन ^8। चैनल निम्नलिखित चौड़ाई में आते हैं: 100, 150, 200, 250, और 300 माइक्रोन, और सभी चैनलों 150 माइक्रोन गहरी हैं।
   4. चैनल के भीतर लार्वा की स्थिति को समायोजित करने के लिए एक संदंश शाखा या तूलिका की नोक का प्रयोग करें। यह किसी भी दिशा में उन्मुख जा सकता है: उदरअप, उदर नीचे, उदर के लिए एक तरफ, क्या संरचना के आधार पर imaged किया जा रहा है।
4. संदंश का प्रयोग, धीरे इस तरह से अधिक चैनल फ्लिप कि लार्वा कांच कवर पर अब है। चैनल के सिरों पर पानी की एक या दो बूँदें इतनी जगह है कि यह पानी (चित्रा 2 डी) के साथ भरता है।
   1. धीरे चैनल के पक्ष उठा किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए।
   2. लार्वा के उन्मुखीकरण को समायोजित करें। ऐसा करने के लिए, धीरे चैनल नहीं बल्कि कांच कवर लार्वा रोल करने के लिए खिसकाएं। इस उन्मुखीकरण परिवर्तन नहीं होता है, तो कांच कवर हटाने और लार्वा स्थिति को समायोजित। लार्वा imaged किया जा करने के लिए तैयार है।
   3. छवि चैनल / एक औंधा माइक्रोस्कोप पर coverslip। एक ईमानदार माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग हैं, बस चैनल / coverslip पलटना।

4. व्यवहार रिकॉर्डिंग में रुचि के उपाय फ़ीचर

1. ब्याज की एक संरचना के लिए (जैसे, पूंछ, सीएनएस), ब्याज की एक विशेषता को मापने के लिए (जैसेप्रतिदीप्ति तीव्रता, स्थान) समय के साथ।
   नोट: इस तरह के सिर और पूंछ के रूप में संरचनाएं मैन्युअल एनोटेट जा सकता है। उदाहरण के लिए, सिर के रूप में अंधेरे एच के आकार का मुंह हुक से युक्त पहचाना जा सकता है, और पूंछ के रूप में पीछे सांस की नली spiricles युक्त पहचाना जा सकता है। इस पत्र तंत्रिका कॉर्ड पर केंद्रित है। एक यूएएस MYR-GFP transgene (elav> GFP) ^9,10 ड्राइव करने के लिए fluorescently केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) लेबल करने के लिए न्यूरोनल GAL4 लाइन elav-GAL4 का प्रयोग करें। सीएनएस दो पूर्वकाल मस्तिष्क पालियों तंत्रिका कॉर्ड, जो पीछे (चित्रा 3) के लिए प्रदान करने के लिए संलग्न होता है।
2. तंत्रिका कॉर्ड (एफ _{(नेकां))} हर समय बिंदु (टी) पर की पिक्सेल तीव्रता को मापने। नीचे एक मैनुअल एनोटेशन दृष्टिकोण का वर्णन है, लेकिन इस कदम से स्वचालित किया जा सकता है।
   1. 'विश्लेषण' मेनू में फिजी (या इसी तरह के सॉफ्टवेयर) में मतलब ग्रे मूल्य और SLIC रिपोर्ट करने के लिए "सेट माप ..." संवाद बॉक्स का उपयोग करेंई स्थिति।
   2. मैन्युअल फिल्म (चित्रा 3) का पहला फ्रेम में तंत्रिका कॉर्ड के केंद्र में एक बॉक्स आकर्षित। यह कदम भी छवि विभाजन और पंजीकरण एल्गोरिदम के साथ स्वचालित किया जा सकता है।
   3. ब्याज की बॉक्सिंग क्षेत्र में औसत पिक्सेल तीव्रता रिपोर्ट करने के लिए 'विश्लेषण' मेनू में "उपाय" कमांड का प्रयोग करें। यह एक "परिणाम" खिड़की उत्पन्न करता है।
   4. अगले फ्रेम में, मैन्युअल तीर कुंजियों का उपयोग करके आकार बदलने के बिना बॉक्स का स्थान। "उपाय" कमांड फिर से प्रयोग करें। अद्यतन परिणामों "परिणाम" विंडो में दिखाया जाएगा। ब्याज की प्रत्येक फ्रेम के लिए इस चरण को दोहराएँ।
   5. सहेजें "परिणाम" का उपयोग कर 'के रूप में सहेजें ...' कमांड फ़ाइल मेनू से। परिणाम एक .xls फ़ाइल के रूप में निर्यात किया जाएगा।

5. माप का विश्लेषण करें

1. प्रत्येक च को सामान्य _{(नेकां)} 0 और 1 (जेड _{(टी के} बीच एक मूल्य के लिए _{मूल्य)} </ Em>)।
   1. स्प्रेडशीट (या अन्य कार्यक्रम) में, Results.xls फ़ाइल खोलें। इस फ़ाइल में फ्रेम संख्या और औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व करने वाले दो कॉलम होगा।
   2. एक नया स्तंभ बनाओ और सूत्र Z _(टी) = च _{(नेकां [टी])} सफाई MIN _{(च [नेकां])} / अधिकतम _{(च [नेकां])} सफाई MIN _का उपयोग करें _{(f [नेकां])} एक सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति मूल्य उत्पन्न करने के लिए हर समय बिंदु के लिए इसी।
2. रिकॉर्डिंग में प्रत्येक प्रगति के लिए प्रगति की अवधि निर्धारित करते हैं।
   नोट: एक छलाँग चक्र आगे के लिए दोहराव पूरे शरीर की गति की इकाई है (और रिवर्स) रेंगने। परंपरा के मुताबिक इस तरह के पेट या सीएनएस ^{1 के} रूप ^में एक आगे प्रगति शुरू होता है (और समाप्त होता है) पूंछ, सिर, और अन्य आंतरिक अंगों के आगे आंदोलन के साथ।
   1. मैन्युअल व्यवहार रिकॉर्डिंग का निरीक्षण किया और प्रत्येक प्रगति की दीक्षा बार (i) रिकॉर्ड (मैं _{(स्ट्राइड साइकिल [एन]))।}
      नोट: नीचे दिए गए उदाहरण में, आगे आंदोलनसीएनएस के रूप में एक छलाँग चक्र की दीक्षा (चित्रा 3) का इस्तेमाल किया गया था।
   2. प्रत्येक प्रगति के लिए अवधि की गणना: Δ टी _{(स्ट्राइड चक्र) =} मैं _{(स्ट्राइड साइकिल [एन 1])} -मैं _{(स्ट्राइड साइकिल [एन])।}
3. रिकॉर्डिंग के हर समय बिंदु के लिए गुजरे प्रगति चक्र के प्रतिशत की गणना।
   1. स्प्रेडशीट फ़ाइल एक छलाँग चक्र (ग) के शुरू होने के बाद से गुजरे समय का प्रतिनिधित्व करने में एक अतिरिक्त स्तंभ बनाओ। समय सेट प्रत्येक प्रगति की दीक्षा में शून्य करने के लिए प्रगति दीक्षा के बाद से (ग _{(स्ट्राइड साइकिल [एन])} = 0)। तदनुसार दीक्षा के बाद बार समायोजित करें।
   2. का प्रतिनिधित्व प्रतिशत प्रगति चक्र गुजरे (% छलाँग चक्र) स्प्रेडशीट फ़ाइल में एक अतिरिक्त स्तंभ बनाने छलाँग अवधि द्वारा समायोजित बार फूट डालो और 100 से गुणा प्रगति चक्र के प्रतिशत में बदलने के लिए गुजरे।% छलाँग चक्र = (ग _{(स्ट्राइड साइकिल [एन] ))} / (Δ टी ₍स्ट्राइड चक्र) * 100)।

6. ध्रुवीय भूखंड समन्वय क्रॉल चक्र से अधिक ब्याज की संरचनाओं की गतिशीलता का प्रतिनिधित्व करते हैं उत्पन्न

1. Matlab में, अद्यतन Results.xls आयात करने के लिए होम टैब में 'डेटा आयात करें' बातचीत का उपयोग करें।
2. बनाओ एक नई सरणी "थीटा" युक्त प्रतिशत प्रगति चक्र मूल्यों (% छलाँग चक्र)। ( "थीटा = var1" जहां var1% छलाँग चक्र का प्रतिनिधित्व करता है)।
3. एक नई सरणी "रो" सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति मूल्यों (जेड _(टी)) को शामिल करें। ( "रो = var2" जहां var2 प्रतिनिधित्व जेड _(टी))।
4. कोण के रूप में प्रतिशत प्रगति चक्र, और त्रिज्या ( "polarplot (थीटा, रो)") के रूप में प्रतिदीप्ति के साथ समन्वय स्थापित ध्रुवीय भूखंडों बनाने के लिए 'polarplot' कमांड का प्रयोग करें।

Representative Results

यह लेख ड्रोसोफिला लार्वा व्यवहार agarose चैनलों का उपयोग मार्गदर्शन के लिए और एक क्रॉल चक्र पर लार्वा संरचनाओं की गतिशीलता को मापने के लिए एक विधि का वर्णन है। रैखिक चैनलों में लार्वा लयबद्ध रेंगने (चित्रा 3) के निरंतर मुकाबलों प्रदर्शन करते हैं। क्योंकि दोनों लार्वा और चैनलों ऑप्टिकली स्पष्ट कर रहे हैं, चैनलों लार्वा फ्लोरोसेंट जांच हित के किसी भी संरचना में व्यक्त व्यक्त के साथ प्रयोग किया जा सकता है। हम सभी न्यूरॉन्स में व्यक्त GFP (elav-Gal4 / +; यूएएस MYR-GFP / +) लार्वा दर्ज की गई और गतिशील क्रॉल चक्र से अधिक तंत्रिका कॉर्ड में प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन नजर रखी। हम बताते हैं कि सीएनएस लार्वा सिर और पूंछ (चित्रा -4 ए-बी) के रूप में आगे बढ़ता रहता है पर लगभग एक ही समय। मांसपेशियों के संकुचन की एक लहर शरीर धुरी के साथ गुजरता है, सीएनएस में चलता रहता है और ध्यान के विमान से बाहर तंत्रिका कॉर्ड के प्रतिदीप्ति के कारण (चित्रा 4) बदलने के लिए। चान यों कई जानवरों में कई प्रगति के लिए तंत्रिका कॉर्ड प्रतिदीप्ति तीव्रता में GES हम एक ध्रुवीय समन्वय स्थापित साजिश (चित्रा 4C) पर डेटा का प्रतिनिधित्व किया। ध्रुवीय समन्वय के भूखंडों पर डेटा की साजिश रचने से पता चलता है कि प्रगति चक्र से अधिक तंत्रिका कॉर्ड प्रतिदीप्ति की गतिशीलता एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पैटर्न प्रकार है।

चित्रा 1: रैखिक चैनल के डिजाइन गाइड करने के लिए ड्रोसोफिला लार्वा रेंगने व्यवहार (ए) microfluidic रेखीय agarose चैनलों बनाने के लिए इस्तेमाल किया उपकरण के डिजाइन दिखाया गया है।। इस डिवाइस में चैनलों की चौड़ाई 50 माइक्रोन की वेतन वृद्धि से 100-300 माइक्रोन से बदलती हैं। गहराई 150 मीटर है। (बी) एक ड्रोसोफिला लार्वा एक agarose चैनल में भरी हुई है। एक पृष्ठीय दृश्य सही करने के लिए पूर्वकाल (सिर) के साथ दिखाया गया है। स्केल बार = 200 माइक्रोन।4892 / 54892fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2:। आरेख दृष्टांत एक चैनल में एक लार्वा लोड करने के लिए कैसे देखें विवरण के लिए प्रोटोकॉल धारा 3 के लिए यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3: क। Fluorescently लेबल ड्रोसोफिला लार्वा निरंतर करता है, लयबद्ध, रैखिक रेंगने जब एक agarose चैनल पर में रखा छोड़ दिया, एक लार्वा सभी न्यूरॉन्स (elav> GFP) दिखाया गया है में GFP व्यक्त करने का एक योजनाबद्ध। एक बॉक्स क्षेत्र है जहां तंत्रिका कॉर्ड के प्रतिदीप्ति तीव्रता (द्वारा प्रतिष्ठित चलता इसकीलम्बी आकृति विज्ञान) मापा जा सकता है। सही में एक लार्वा एक दूसरे के अंतराल पर एक चैनल के माध्यम से रेंगने का एक उदाहरण है। एक पृष्ठीय दृश्य पूर्वकाल के साथ दिखाया गया है। तीर एक छलाँग की दीक्षा संकेत मिलता है। स्केल बार = 200 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4: तंत्रिका कॉर्ड में प्रतिदीप्ति परिवर्तन क्रॉल चक्र से अधिक की गतिशीलता ध्रुवीय पर प्रस्तुत कर रहे भूखंड समन्वय (ए) के एक भी प्रगति का एक चित्र।। प्रतिशत प्रगति चक्र का प्रतिशत पूरा करने के लिए देखें। सम्मेलन पूंछ, सिर, और इस तरह के सीएनएस के रूप में आंतरिक अंगों के आगे आंदोलन से एक छलाँग (या प्रगति चक्र के 0%) की दीक्षा के निशान। ध्यान दें कि सीएनएस (सफेद) आगे और पीछे की ओर ले जाता है, ऊपर और नीचे के रूप में भी। एक पक्ष होड़डब्ल्यू सही करने के लिए पूर्वकाल के साथ दिखाया गया है। (बी) के एक kymograph सिर, पूंछ, और सीएनएस के आंदोलन से पता चलता है। ध्यान दें कि प्रगति चक्र के दौरान तंत्रिका कॉर्ड के प्रतिदीप्ति तीव्रता गतिशील है। (सी) एक ध्रुवीय समन्वय स्थापित साजिश प्रगति चक्र से अधिक तंत्रिका कॉर्ड की सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता में गतिशील परिवर्तन दिखाता है। प्रत्येक डॉट एक भी समय बिंदु (एन = 3 लार्वा, 3 प्रगति प्रत्येक) पर एक भी लार्वा की एक सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

एक microfluidic युक्ति रेखीय agarose चैनलों कि ड्रोसोफिला लार्वा को समायोजित कर सकते हैं (चित्रा 1) बनाने के लिए बनाया गया था। ड्रोसोफिला लार्वा इन रैखिक agarose चैनलों में रखा जाता है जब उनके व्यवहार प्रदर्शनों की सूची रेंगने, जो क्रॉल चक्र पर लार्वा संरचनाओं की गतिशीलता का विस्तृत अवलोकन के लिए अनुमति देता है तक सीमित है।

एक सफल रिकॉर्डिंग तब होता है जब एक लार्वा लयबद्ध प्रगति की एक श्रृंखला (चित्रा 3) प्रदर्शन करते हैं। यदि यह नहीं होती है, चैनल में एक हवाई बुलबुले की तरह बाधाओं के लिए जाँच, और लार्वा के स्वास्थ्य की जाँच करें। एक सफल रिकॉर्डिंग का एक अन्य महत्वपूर्ण तत्व है कि लार्वा बेहतर ब्याज की संरचनाओं कल्पना करने के लिए उन्मुख है। लार्वा सही ढंग से उन्मुख नहीं है, या यदि लार्वा चैनल से बाहर क्रॉल, बस coverslip हटाने और लार्वा गोड़ा। हमारे अनुभव में, ~ लार्वा के 20% के शुरू में उपज उत्कृष्ट व्यवहार रिकॉर्डिंग घुड़सवार withouटी समायोजन।

अतीत में, माप ऐसे मुंह हुक, पेट, और व्यवहार रेंगने के दौरान पेट क्षेत्रों के रूप में लार्वा संरचनाओं की स्थिति के लिए ले जाया गया। रेंगने प्रगति चक्र पर इन संरचनाओं के आंदोलन कल्पना, ध्रुवीय समन्वय के भूखंडों उत्पन्न किया गया। इस पत्र में, तंत्रिका कॉर्ड के प्रतिदीप्ति तीव्रता मापा गया था और ध्रुवीय समन्वय के भूखंडों रेंगने प्रगति चक्र (चित्रा 4) पर प्रतिदीप्ति की गतिशीलता कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया। ध्रुवीय समन्वय के भूखंडों पर डेटा का प्रतिनिधित्व करने के कई फायदे हैं: यह एक चर के रूप में क्रॉल गति समाप्त, यह कई जानवरों और कई कदम से डेटा संक्षेप में प्रस्तुत कर सकते हैं, और यह दोनों समग्र रुझान और ¹¹ आंकड़ों में भिन्नता के दृश्य की अनुमति देता। विशेष रूप से, यह ब्याज की किसी भी fluorescently लेबल संरचना की गतिशीलता को मापने के लिए संभव है। सिद्धांत रूप में, इस विश्लेषण गतिशील परिवर्तन के किसी भी प्रकार है कि एक क्रॉल चक्र पर होता है पर नज़र रखने के लिए लागू है। इस पत्र में वर्णित तरीकों के लिए आवेदनों की एक विस्तृत सरणी है। अतीत में, रैखिक agarose चैनलों पूरे जीव, खंड और व्यक्तिगत पेशी का स्तर ¹ पर लार्वा व्यवहार रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इन आंकड़ों से पता चला है कि लार्वा दोनों को आगे के लिए एक "आंत-pistoning" तंत्र का उपयोग करें और रेंगने रिवर्स, और वे neuromuscular तंत्र दोनों आगे ड्राइविंग और ¹ निर्धारित किया जाना रेंगने रिवर्स अनुमति दी। भविष्य में, शोधकर्ताओं ने विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि में रेंगने का अध्ययन करने के चैनलों का उपयोग कर सकते हैं। इसके अलावा, यह चैनलों का उपयोग करने के लिए रेंगने के दौरान कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग लार्वा न्यूरॉन्स की गतिविधियों का विश्लेषण करने के लिए संभव होना चाहिए। यह समझ जिनमें से न्यूरॉन्स क्रॉल चक्र की विशेष आंदोलनों के साथ चरण में आग के लिए नेतृत्व करना चाहिए। अंत में, वहाँ कोई कारण नहीं है कि चैनलों के इस अखबार में प्रस्तुत रैखिक डिजाइन का पालन करना चाहिए है; विभिन्न आयामों के साथ चैनलों का उपयोग कर कोई संदेह नहीं है में मदद मिलेगी एक वर का जवाबड्रोसोफिला लार्वा हरकत और एक पूरे के रूप में मोटर नियंत्रण के बारे में सवाल का iety।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 oz square Drosophila bottle	Scimart	DR-103
agar	sigma	A1296
sucrose	sigma	S9378
apple juice			not from concentrate
Tegosept	Fisher	T2300	methyl-p-hydroxybenzoate
35 x 10 mm round petri dish	Fisher	351008
baker's yeast
PDMS casting mold	FlowJem		can be requested from authors
Isopropyl alcohol	Fisher	A417-1
laboratory wipes	Fisher	06-666-11
canned air	Fisher	18-431
10 cm petri dish	BioPioneer	GS82-1473-001
agarose	Fisher	50-444-176
razor blade	Fisher	12-640
forceps	FST	11241-40
22 x 40 cover glass, #1.5	Fisher	50-365-605
Fiji (version 1.51d)	NIH		fiji.sc
Excel 2016	Microsoft		www.microsoftstore.com
MATLAB R2016	Mathworks		www.mathworks.com