Summary
果蝇幼虫是研究行为的神经控制功能强大的模型系统。该出版物描述了使用线性琼脂糖通道引发线性爬行和方法的持续发作期间重复爬行行为量化幼虫结构的动力学。
Abstract
的果蝇幼虫爬行正在成为一个强大的模型来研究感觉神经行为的控制。然而，在平开面幼虫爬行行为是复杂的，其中包括：暂停，车削和蜿蜒。这种复杂性在运动的剧目阻碍单个抓取步幅循环期间发生的事件的详细分析。为了克服这一障碍，线性琼脂糖渠道所做的限制幼虫的行为直，持续，有节奏地爬行。原则上，由于琼脂糖频道和果蝇幼虫体都是光学透明的，由遗传编码荧光探针标记的幼虫结构的运动可以在完整的，可自由移动的幼虫监测。在过去，幼虫放置在直线通道，并在整个生物体，段的水平爬行和肌肉进行分析1。在未来，幼虫在通道抓取可用于钙成像以监测神经最终活动。此外，这些方法可与任何基因型的幼虫，并与任何研究者设计的信道可以使用。因此，下面提出的协议是广泛适用于使用果蝇幼虫为模型，以了解电机控制的研究。
Introduction
这种方法的总体目标是详细研究果蝇幼虫爬行。在运动实验已经起到了开发和电机控制2测试理论具有重要作用。传统的运动进行了研究水生动物（ 如水蛭，七鳃鳗，蝌蚪）3。运动，在这些动物中的重复性质已经允许节律的研究中，生物物理事件驱动运动的分析，以及用于监测伴随运动神经放电模式。
对于运动的研究使用果蝇幼虫的呈现比其他模型系统的优点的独特组合：轻便遗传学，良好表征的发展，一个机构，是在第一和第二龄光学透明，并且整个的持续透射电镜重建神经系统4-6。然而， 的果蝇幼虫机车在平开运动的表面是有些复杂，包括暂停，打开和蜿蜒爬行7。本刊物使用线性琼脂糖渠道，引导的果蝇幼虫自发行为，幼虫进行持续的，直的，有节奏的爬行行为的方法。
研究果蝇幼虫行为在琼脂糖频道，而不是在平面开口面的行为，具有几个优点。首先，它可以让研究人员专门选择从众多运动是幼虫行为艺术的一部分爬行行为。第二，通过调节通道与幼虫体尺寸的宽度，爬行速度可以调整。三，渠道允许从背，腹，或侧面取决于幼虫如何加载和通道内面向查看的幼虫。这种多功能性幼虫方向允许任何利益结构要爬行过程中不断地可见。第四，信道是适合于与各种显微镜和目标的用途。例如，线性通道可用于在明场立体镜和/或用于旋转盘共焦显微镜1高分辨率成像低分辨率影像。第五，这种方法可以结合使用以任何遗传背景光遗传学/ thermogenetic神经元的操作。最后，因为无论是幼虫体（在第一和第二龄）和琼脂糖渠道光学透明，渠道可以学习动态运动，或由基因编码的荧光探针标记幼虫结构的荧光强度变化时使用。
所描述的方法适用于第一和第二龄果蝇幼虫行为详细运动学研究。该出版物分析向前爬行幼虫过程中CNS的荧光强度的动态变化来演示使用渠道，并为先导，以NEURonal公司钙成像。
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Protocol
1.幼虫的制备
- 一个星期录制的行为之前，成立了一个跨（25处女和5男最小值）。保持在25℃，所有的十字架和后代。
注：培养条件的温度可以改变，但下面描述的时间线将需要进行调整，以帐户为发育速度的变化。 - 录制时，在早晨的第一件事前5天，将交叉成一个集笼琼脂/果汁盖和酵母泥中的琼脂/果汁盖中央的DAB（0.5-1毫升）。
- 为了使集合笼，万佛洞成6盎司方形的聚乙烯瓶果蝇 。
- 为了使琼脂/果汁瓶盖，在一个锥形瓶中混合18克用600毫升的水琼脂。在用200毫升的苹果汁单独的烧瓶中混合20克蔗糖。微波直到固体溶解。结合并搅拌，使混合物冷却至60℃。加20含10％甲基对羟基苯甲酸在95％的乙醇，并搅拌。添加〜7ml至35×10毫米的圆形培养皿的底部一半。允许琼脂/果汁巩固在室温1小时。保存在4℃。
- 使酵母膏，按体积干酵母和水添加等份。保存在4℃。
- 检查幼虫藏品的健康。
- 在早晨，记录前4天和3天，除去帽，并放置在笼子新鲜帽。每天在同一时间更换瓶盖拿到鸡蛋24小时收集和刚孵出的幼虫。
- 每个帽取下后，请检查看跨多少鸡蛋铺设。 500-2,000鸡蛋之间的期望。调节成人的数量，如果需要的话。
注：几个鸡蛋应该已经孵化成幼虫，以及新孵幼虫会发现从酵母泥之遥。 - 老化每个盖帽24小时。重新审视帽确定幼虫是否健康。
注意：大多数蛋应该孵化成幼虫，而幼虫应该已经爬进你们AST粘贴。身体不好的症状包括大量未孵化的卵，幼虫死者尸体从酵母泥远，幼虫腹部显著暗斑，表明免疫反应。如果幼虫是不健康的，改变笼，让新鲜帽/酵母泥，并检查基因型。 - 废弃旧帽子。
- 收集行为记录幼虫。
- 在记录之前既2和第1天，去除盖子和用新鲜帽替换。
- 每个标签取下盖子，并保持在25℃。这将产生行为记录一个上演一系列的幼虫。幼虫从刚孵出的（0-4小时posthatch）通过第二龄期（24-48小时posthatch）所用的信道可以使用。除连续两天录音帽。
- 丢弃后48小时全部大写。
- 如果需要，重复步骤1.4.1-1.4.3长达5个附加Ð。后更少受精卵产生。
- 制备线性通道的PDMS（聚二甲基硅氧烷，硅氧烷弹性体）铸造模具（ 图1A）。 PDMS压铸模具是请直接从赫克歇尔实验室。
- 清洁用异丙醇铸模。空气干燥，DAB用干抹布实验室，或使用压缩空气。
- 的铸模放入一个10cm培养皿盖子或其它容器。
- 准备倒入琼脂糖溶液。
- 使水通过微波直至完全溶解3％的琼脂糖溶液（3克在100毫升）。
- 冷却至55℃，使气泡上升到表面。
- 倒入琼脂糖混合物到含有铸模使得模具刚好覆盖的培养皿。让琼脂糖设置，直至凝固。
- 移除铸模琼脂糖频道。用刀片修剪琼脂糖盘的边缘。
- 把通道S IN一个10cm培养皿浸入水中。它们可保持在4℃下7天。
3.装载幼虫进入通道到记录行为
注：如果存放在4℃的渠道，允许使用行为记录之前渠道来RT。
- 使用干净的刀片切割的那些步骤2（ 图2A）制备一个单一信道。
- 用一对镊子来放置通道上的玻璃盖玻片（ 图2B）开槽朝上。盖玻片的大小和厚度取决于用于成像的具体范围。
- 用细镊子从步骤1制备琼脂/果汁瓶盖选择幼虫并放入切通道（ 图2C）。
- 不要挤幼虫。与钳齿尖轻轻把它捡起来。另外，也可以操纵幼虫与用细点画笔。
注意：这是重要的，因为幼虫很仙sitive触摸。如果不小心处理，伤害性反应可能会在实验的第一几秒钟内支配自己的行为。 - 在水淹没简单地洗他们的幼虫。
- 将幼虫到切通道后，使用镊子尖的尖端幼虫轻轻挑逗进入通道树林。
注：对于大多数应用幼虫的宽度和沟道的宽度应该匹配。幼虫在不同发展阶段的平均宽度如下：0小时posthatch - 140微米，24小时posthatch - 180微米，48小时posthatch - 320微米，72小时posthatch - 500微米，96小时posthatch - 750微米8。通道来在以下宽度：100，150，200，250，和300微米，所有通道150微米深。 - 使用镊子齿或画笔的尖端来调整通道内的幼虫的位置。它可以在任何方向导向：腹侧起来，腹侧向下，腹面一侧，这取决于结构是将被成像。
- 不要挤幼虫。与钳齿尖轻轻把它捡起来。另外，也可以操纵幼虫与用细点画笔。
- 使用镊子，轻轻翻转通道上，使得幼虫现在是在盖玻璃上。放置的水的一个或两滴在通道的端部，以便它用水（ 图2D）填充。
- 轻轻提起信道的两侧，以除去任何气泡。
- 调整幼虫的方向。要做到这一点，轻轻轻推渠道，但不是玻璃盖滚幼虫。如果不改变方向，取下盖板玻璃和调整幼虫的位置。幼虫已准备好进行成像。
- 图片频道/上倒置显微镜盖玻片。如果一个堂堂正正的显微镜成像，只需反转通道/盖玻片。
4.行为记录感兴趣的测量功能
- 对于感兴趣的结构（ 例如 ，尾，中枢神经系统），测量的感兴趣特征（ 例如，荧光强度，位置）随时间。
注：结构如头部和尾部可以手动注释。例如，头部可以被识别为包含暗H形口钩，和尾部可以被识别为含有后气管spiricles。本文侧重于神经线。使用神经GAL4线ELAV-GAL4来驱动UAS-MYR-GFP转基因的（ELAV> GFP）9,10荧光标记中枢神经系统（CNS）。中枢神经系统包含连接到神经索，其延伸至后（ 图3）二前脑叶。 - 测量每个时间点（T）的神经线（F（NC））的像素强度。下面介绍一个人工标注的做法，但是这一步可以自动化。
- 在斐济（或类似软件）在“分析”菜单中的“设置测量...”对话框报告的平均灰度值和SLICË位置。
- 在神经索的在电影（ 图3）的第一帧的中心手动绘制框。此步骤也可以与图像分割和配准算法自动化。
- 在“分析”菜单中的“测量”命令在感兴趣的地区盒装报告的平均像素强度。这会产生一个“结果”窗口。
- 在下一帧中，手动重新放置框而不使用箭头键调整。再次使用“测量”命令。更新后的结果将在“结果”窗口中。重复此步骤为每个感兴趣的帧。
- 保存从文件菜单中的“结果”使用“另存为...”命令。结果将导出为.xls文件。
5.分析测量
- 规范化每个F（NC）值0和1之间（Z（T值）</ EM>）。
- 在电子表格（或其他程序），打开Results.xls文件。该文件将有一个代表帧号和平均荧光强度两列。
- 创建一个新列，并使用公式Z（T）= F（NC [T]）-min（F [NC]）/ MAX（F [NC]）-min（F [NC]）生成标准化的荧光值对应于每个时间点。
- 确定在记录各个步幅的步幅时间。
注：一个箭步周期正向重复全身运动单元（和反向）爬行。按照惯例一大步向前开始（和结束）同尾，头和其他内脏器官的向前运动，如肠道或中枢神经系统1。- 手动检查行为记录和记录每个步幅的开始时间（I）（I（步幅周期[N]））。
注意：在下面的例子中，前向运动CNS的作为步幅循环的开始，使用（ 图3）。 - 对于每个步幅计算期间：ΔT（跨越周期）= I（步幅周期[N + 1]）-i（ 步幅周期[N]）。
- 手动检查行为记录和记录每个步幅的开始时间（I）（I（步幅周期[N]））。
- 计算经过用于记录的每一个时间点的步幅周期的百分比。
- 使代表从一个箭步周期（C）开始经过时间的电子表格文件的附加列。设定的时间，因为在每一步幅的开始步幅开始到零（ 三（步周期[n]的）= 0）。因此开始后调整时间。
- 使在电子表格文件一个附加列代表百分之步幅周期已过（％步幅周期 ）通过步幅期间除以调整时间和乘以100，以转换为步幅周期的百分比经过：％步幅周期 =（C（步周期[n]的））/（ΔT（跨越周期）* 100）。
6.生成极坐标图在抓取周期代表的利益结构的动力
- 在MATLAB中，使用“导入数据”对话框中的选项卡导入更新Results.xls。
- 创建一个新阵“西塔”包含％的步幅周期值（％步幅循环 ）。 （“西塔= VAR1”，其中VAR1代表％步幅循环 ）。
- 创建一个新阵“卢”含有荧光强度值（Z（T））。 （“卢= VAR2”，其中VAR2代表Z（T））。
- 使用'polarplot'命令来使极坐标曲线与百分之步幅周期作为角度，和荧光为半径（“polarplot（西塔，卢）”）。
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Representative Results
本文介绍了指导琼脂糖渠道的果蝇幼虫的行为和通过抓取周期测定幼虫结构动力学的方法。幼虫在直线渠道进行有节奏的爬行（ 图3）持续发作。因为这两个幼虫和渠道光学透明，渠道可以表达的幼虫在任何感兴趣的结构表达荧光探针可以使用。我们记录幼虫在所有神经元表达GFP（ELAV-Gal4的/ +; UAS-MYR-GFP / +）和监测在荧光强度中的神经索在爬行循环的动态变化。我们表明，在CNS向前移动在几乎相同的时间作为幼虫的头部和尾部（ 图4A-B）。作为肌肉收缩的波沿着主体轴线穿过，中枢神经系统移动进出焦点的平面引起的神经索的荧光改变（ 图4）。为了量化瓒在神经索荧光强度GES在几个动物数进展我们表示上的极坐标图（ 图4C）中的数据。标绘在极坐标图中的数据表明，该神经索荧光超过步幅循环的动力学遵循可重复的图案。
图1：线性通道的设计指导果蝇幼虫爬行行为 （A）所示用来做线性琼脂糖渠道的微流体装置的设计。在该装置中的通道的宽度从100-300微米通过50微米的增量变化。的深度为150微米。 （B） 果蝇幼虫被装入琼脂糖通道。一个背视图显示与前（头）的权利。比例尺= 200微米。4892 / 54892fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图2：示出如何加载幼虫进入通道详见协议第3条，请点击此处查看该图的放大版本。
图3：荧光标记的果蝇幼虫进行持续的，有节奏，直线爬行时放入琼脂糖通道左侧，在（ELAV> GFP）显示所有神经元表达GFP幼虫的示意图。一个框显示了神经线的荧光强度（按区分该地区的细长形态）可以被测量。在右边是一个幼虫通过一个信道以一秒的间隔爬行的一个例子。一个背视图显示与前了。箭头指示了一大步的开始。比例尺= 200微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：荧光变化的神经索在抓取周期的动态呈现极地坐标图 （A）一个步幅的示意图。百分比是指完成步幅周期的百分之一。尾巴，头部和内脏器官，如中枢神经系统的惯例向前运动标志着一个箭步（或步幅周期的0％）的开始。需要注意的是在CNS（白色）向前和向后，以及向上和向下。 A面争夺w被示出与前方的右侧。 （B）kymograph显示头部，尾部，以及中枢神经系统的运动。注意，步幅循环期间神经索的荧光强度是动态的。 （C）极坐标图显示在超过步幅周期的神经索的标准化荧光强度的动态变化。每个点代表在单个时间点（N = 3幼虫，每3步）单幼虫的归一化荧光强度。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
一种微流体装置建成，使线性琼脂糖渠道，可容纳果蝇幼虫（ 图1）。当果蝇幼虫被放置在这些线性琼脂糖渠道其行为库限于爬行，其允许在抓取周期幼虫结构的动力学的详细观察。
当幼虫进行一系列有节奏的步伐（ 图3）进行了一次成功的记录。如果这没有发生，检查喜欢在通道中的气泡障碍，并检查幼虫的身体健康。一个成功的记录的另一个重要因素是，幼虫被最佳地定向以可视化的利益的结构。如果幼虫不正确的方向，或者如果幼虫爬出来的通道，只需删除盖玻片并重新安装幼虫。根据我们的经验，幼虫〜20％最初安装的产量优良行为记录withouŤ调整。
在过去，测量是幼虫结构的位置的如口腔钩，肠，和爬行行为期间腹段。为了形象化这些结构在爬行步幅循环运动，产生了极坐标图。在本文中，神经索的荧光强度进行测定，并使用极坐标图上的爬行步幅周期（ 图4）以可视化的荧光的动态。有几个优点表示在极坐标图中的数据：它消除爬行速度作为一个变量，它可以总结从许多动物和许多进步数据，并允许两者总趋势和在数据11变化可视化。值得注意的是，它是可以测量的任何感兴趣的荧光标记的结构的动态。原则上，这种分析是适用于追踪发生在一个爬行周期的任何类型的动态变化。 有一个宽的在本文中所描述的方法的应用程序阵列。在过去，线性琼脂糖通道已被用于在整个生物体，段和单个肌肉级1到记录幼虫的行为。这些数据表明，幼虫用于正向一个“内脏-腔内的窜动”机制和反向爬行，并且它们允许的神经肌肉机构进驱动两个和反向爬行待定1。今后，研究人员可以利用渠道来研究不同遗传背景爬行。另外，它应该是可能使用的通道来分析抓取期间使用钙成像幼虫的神经元的活性。这应导致该神经元激发与爬行周期的特定阶段运动的理解。最后，没有理由认为信道必须按照本文提出的线性设计;使用不同尺寸的渠道无疑将有助于回答一个变种有关的果蝇幼虫运动和电机控制作为一个整体问题iety。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 oz square Drosophila bottle | Scimart | DR-103 | |
| agar | sigma | A1296 | |
| sucrose | sigma | S9378 | |
| apple juice | not from concentrate | ||
| Tegosept | Fisher | T2300 | methyl-p-hydroxybenzoate |
| 35 x 10 mm round petri dish | Fisher | 351008 | |
| baker's yeast | |||
| PDMS casting mold | FlowJem | can be requested from authors | |
| Isopropyl alcohol | Fisher | A417-1 | |
| laboratory wipes | Fisher | 06-666-11 | |
| canned air | Fisher | 18-431 | |
| 10 cm petri dish | BioPioneer | GS82-1473-001 | |
| agarose | Fisher | 50-444-176 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| forceps | FST | 11241-40 | |
| 22 x 40 cover glass, #1.5 | Fisher | 50-365-605 | |
| Fiji (version 1.51d) | NIH | fiji.sc | |
| Excel 2016 | Microsoft | www.microsoftstore.com | |
| MATLAB R2016 | Mathworks | www.mathworks.com |
References
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