عن طريق القنوات الخطي الاغاروز لدراسة Published: November 26, 2016 doi: 10.3791/54892

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Xiao Sun¹, Ellie S. Heckscher^1,2

¹Committee on Development, Regeneration, and Stem Cell Biology, University of Chicago, ²Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

Summary

يرقة ذبابة الفاكهة هو نظام نموذج قوي لدراسة التحكم العصبي في السلوك. يصف هذا المنشور استخدام القنوات الاغاروز خطية للحصول نوبات متواصلة من الزحف والأساليب الخطية لقياس ديناميكية هياكل اليرقات خلال سلوك الزحف المتكرر.

Abstract

ذبابة الفاكهة الزحف اليرقات يبرز بوصفه نموذجا قويا لدراسة التحكم العصبي في السلوك الحسي. ومع ذلك، سلوك الزحف اليرقات على أسطح مستوية معقدة، بما في ذلك: التوقف، وتحول، والتعرجات. هذا التعقيد في جعبته من حركة يعوق تحليل مفصل للأحداث التي تحدث خلال دورة الزحف خطوة واحدة. للتغلب على هذه العقبة، أدلى قنوات الأغاروس الخطية التي تقيد سلوك اليرقات على التوالي، مستمرة، الزحف الإيقاعي. من حيث المبدأ، لأن قنوات الأغاروس والجسم اليرقات ذبابة الفاكهة على حد سواء واضحة بصريا، يمكن رصد حركة هياكل اليرقات وصفت من قبل تحقيقات الفلورسنت المشفرة وراثيا في حالها، التي تتحرك بحرية اليرقات. في الماضي، وضعت اليرقات في القنوات الخطية والزحف على مستوى الحي كله، الجزء، وتم تحليل العضلات ^1. في المستقبل، اليرقات الزحف في قنوات يمكن أن تستخدم في التصوير الكالسيوم لمراقبة العصبيةالنشاط نال. وعلاوة على ذلك، وهذه الأساليب يمكن استخدامها مع يرقات أي الوراثي ومع أي قناة مصممة الباحث. وهكذا بروتوكول الواردة أدناه لا ينطبق على نطاق واسع للدراسات باستخدام يرقة ذبابة الفاكهة نموذجا لفهم التحكم في المحركات.

Introduction

ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو دراسة ذبابة الفاكهة الزحف اليرقات في التفاصيل. وقد لعبت التجارب على الحركة دورا هاما في تطوير واختبار النظريات حول التحكم في المحركات ^2. تقليديا وقد تمت دراسة الحركة في الحيوانات المائية (على سبيل المثال، علقة، امبرى، الشرغوف) ^3. وقد سمح للطبيعة المتكررة للتنقل في هذه الحيوانات لدراسة rhythmogenesis، لتحليل الأحداث الفيزيائية الحيوية تحرك القيادة، ورصد أنماط اطلاق العصبية التي ترافق الحركة.

استخدام يرقات ذبابة الفاكهة لدراسات الحركة يقدم مزيجا فريدا من المزايا أكثر من النظم نموذج الأخرى: علم الوراثة السطحية والتنمية تتميز جيدا، والهيئة التي هي واضحة بصريا في الأطوار الأولى والثانية، والمستمر انتقال الإلكترون إعادة الإعمار المجهري كامل الجهاز العصبي ^4-6. ومع ذلك، ذبابة الفاكهة اليرقات مقامالحركة على أسطح مستوية معقدة إلى حد ما بما في ذلك توقف، تتحول، والتعرجات يزحف ^7. يقدم هذا الكتاب وسيلة لاستخدام قنوات الاغاروز الخطية لتوجيه ذبابة الفاكهة السلوك الحركي اليرقات مثل أن اليرقات يقمن مستمرة، على التوالي، والسلوك الزحف الإيقاعي.

دراسة ذبابة الفاكهة سلوك اليرقات في قنوات الأغاروس، بدلا من السلوك على أسطح مستوية، لديها العديد من المزايا. أولا، فإنه يسمح للباحثين لتحديد على وجه التحديد الزحف السلوك من العديد من الحركات التي هي جزء من الذخيرة السلوكية اليرقات. ثانيا، عن طريق ضبط عرض القناة مقابل حجم الجسم اليرقات، سرعة الزحف يمكن تعديلها. ثالثا، تسمح القنوات لليرقة ليتم عرضه من ظهري، بطني، أو الجانب الوحشي اعتمادا على كيفية تحميل يرقة وتوجها داخل القناة. هذا براعة في التوجه اليرقات يسمح لأي هيكل تهم تكون مرئية بشكل مستمر خلال الزحف. رابعا،قنوات قابلة للاستخدام مع مجموعة واسعة من المجاهر والأهداف. على سبيل المثال، وقنوات خطية يمكن استخدامها لمنخفضة الدقة التصوير على المجسامات مشرق الميدان و / أو عالية الدقة التصوير على القرص الغزل المجاهر مبائر ^1. خامسا، هذه الطريقة يمكن استخدامها في تركيبة مع / التلاعب العصبية توليد الحرارة علم البصريات الوراثي في ​​أي خلفية وراثية. وأخيرا، لأن كلا من الجسم اليرقات (في الطور الأول والثاني) وقنوات الأغاروس واضحة بصريا، وقنوات يمكن استخدامها عند دراسة الحركات الديناميكية، أو التغيرات في كثافة الفلورسنت هياكل اليرقات وصفت من قبل تحقيقات الفلورسنت المشفرة وراثيا.

وصف الأسلوب المناسب للدراسات حركية مفصلة من الأول والثاني الطور ذبابة الفاكهة سلوك اليرقات. هذا المنشور يحلل التغيرات الديناميكية في كثافة الفلورسنت من الجهاز العصبي المركزي خلال الزحف اليرقات إلى الأمام للتدليل على استخدام القنوات وتمهيدا لنويالتصوير الكالسيوم رونالد.

Protocol

1. إعداد يرقات

1. قبل أسبوع واحد تسجيل السلوك، وإنشاء الصليب (لا يقل عن 25 من الحور العين و 5 ذكور). الحفاظ على جميع الصلبان وآله عند 25 درجة مئوية.
   ملاحظة: درجة الحرارة من الظروف والثقافة يمكن أن تتغير، إلا أن خط الزمن هو موضح أدناه تحتاج إلى تعديل لمراعاة التغيرات في سرعة النمو.
2. 5 أيام قبل التسجيل، وأول شيء في الصباح، ووضع الصليب في قفص جمع مع غطاء أجار / عصير والداب (0.5-1 مل) من عجينة الخميرة في وسط غطاء أجار / عصير.
   1. لجعل قفص جمع وكزة ثقوب في أوقية 6. البولي ايثيلين مربع ذبابة الفاكهة زجاجة.
   2. لجعل القبعات أجار / عصير، خلط 18 غراما من أجار بالماء 600 مل في دورق مخروطي. في منفصلة مزيج قارورة 20 غرام السكروز مع 200 مل من عصير التفاح. وحل الميكروويف حتى المواد الصلبة. الجمع بين ويحرك، والسماح الخليط ليبرد إلى 60 درجة مئوية. إضافة 20 مل 10٪ ميثيل ف hydroxybenzoate في 95٪ من الإيثانول، ويقلب. إضافة ~ 7مل إلى النصف السفلي من 35 × 10 ملم جولة طبق بتري. السماح للاجار / عصير ليصلب لمدة 1 ساعة على RT. تخزينها في 4 درجات مئوية.
   3. لجعل عجينة الخميرة، إضافة أجزاء متساوية من حيث الحجم الخميرة الجافة والمياه. تخزينها في 4 درجات مئوية.
3. تحقق من صحة مجموعات اليرقات.
   1. في الصباح، قبل 4 أيام و 3 تسجيل، وإزالة الغطاء ووضع سقف جديد على القفص. تغيير القبعات في نفس الوقت كل يوم للحصول على جمع 24 ساعة من البيض واليرقات حديثة الفقس.
   2. بعد إزالة كل كأب، وفحصها لمعرفة عدد البيض الصليب هو زرع. توقع بين 500-2،000 البيض. ضبط عدد من البالغين، إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: يجب أن تحاك عدد قليل من البيض إلى يرقات، وسيتم العثور على اليرقات حديثة الفقس بعيدا من معجون الخميرة.
   3. العمر كل غطاء لمدة 24 ساعة. إعادة النظر في الحد الأقصى لتحديد ما إذا اليرقات السليمة.
      ملاحظة: يجب أن تحاك معظم البيض إلى يرقات، واليرقات يجب أن زحف إلى انتم معجون است. وتشمل علامات سوء الحالة الصحية لعدد كبير من البيض لم يفقس والهيئات اليرقات الميتة بعيدا عن عجينة الخميرة، واليرقات مع بقع داكنة كبيرة في البطن، مما يشير إلى رد فعل جهاز المناعة. إذا اليرقات غير صحية، تغيير القفص، جعل القبعات جديدة / معجون الخميرة، والتحقق من النمط الجيني.
   4. تجاهل قبعات القديمة.
4. جمع اليرقات للتسجيلات السلوكية.
   1. في كل من 2 و 1 يوم قبل تسجيل، وإزالة الغطاء واستبدالها مع غطاء جديد.
   2. تسمية كل غطاء إزالة والحفاظ على درجة حرارة 25 درجة مئوية. هذا وسوف تنتج سلسلة مراحل اليرقات للتسجيلات السلوكية. اليرقات من حديثا دبرت (0-4 ساعة posthatch) من خلال الطور الثاني (24-48 ساعة posthatch) يمكن استخدامها في القنوات. حفظ القبعات للتسجيلات في أيام متتالية.
   3. تجاهل كل مباراة دولية بعد 48 ساعة.
   4. إذا لزم الأمر، كرر الخطوات 1.4.1-1.4.3 لمدة تصل إلى 5 د إضافية. بعد أن أقل وتنتج البويضات المخصبة.

= "jove_title"> 2. إعداد القنوات

1. إعداد PDMS قناة الخطية (ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان، والمطاط الصناعي السيليكون) قالب الصب (الشكل 1A). تتوفر PDMS قوالب الصب من المختبر Heckscher عند الطلب.
   1. تنظيف العفن الصب مع ايزوبروبيل. الهواء الجاف والجاف الداب مع مناديل المختبر، أو استخدام الهواء المعلب.
   2. وضع قالب الصب إلى 10 سم بيتري غطاء الطبق أو حاوية أخرى.
2. إعداد وتصب حل الاغاروز.
   1. جعل حل 3٪ الاغاروز في الماء (3 غ في 100 مل) من خلال الميكروويف حتى يذوب تماما.
   2. بارد إلى 55 درجة مئوية، مما يسمح فقاعات ان يصعد الى السطح.
   3. يصب الخليط الاغاروز في طبق بتري تحتوي على صب القالب بحيث تغطي القالب فقط. السماح مجموعة الاغاروز حتى عزز.
3. إزالة القنوات الأغاروس من صب القالب. تقليم حواف القرص الاغاروز بشفرة حلاقة.
   1. وضع القناةالصورة في طبق بتري 10 سم مغمورة في الماء. ويمكن أن تظل عند 4 درجة مئوية لمدة 7 أيام.

3. تحميل اليرقة إلى قناة لسلوك سجل

ملاحظة: إذا تخزين القنوات في 4 درجات مئوية، تسمح القنوات للمجيء إلى RT قبل استخدام لتسجيل السلوكي.

1. استخدام شفرة حلاقة نظيفة لقطع قناة واحدة من تلك التي أعدت في الخطوة 2 (الشكل 2A).
2. استخدام زوج من ملقط لوضع قناة مخدد جنبا حتى على الزجاج ساترة (الشكل 2B). حجم وسمك ساترة يعتمد على نطاق محدد المستخدمة في التصوير.
3. استخدام ملقط غرامة لتحديد اليرقة من الحد الأقصى للاجار / عصير أعدت في الخطوة 1 ووضع في قناة قطع (الشكل 2C).
   1. لا تضغط على يرقة. يستلم بلطف مع غيض من طينة ملقط. ومن الممكن أيضا للتلاعب يرقة مع الرسام مع غرامة نقطة.
      ملاحظة: هذا أمر مهم لأن اليرقات صن جداsitive للمس. إذا لم يتم التعامل معها بحذر، قد تهيمن الردود مسبب للألم سلوكهم خلال الثواني القليلة الأولى من التجربة.
   2. غسل اليرقات التي غمر بها لفترة وجيزة في الماء.
   3. بعد وضع اليرقة على قناة قطع، استخدم غيض من طينة ملقط لندف بلطف اليرقة إلى بستان القناة.
      ملاحظة: بالنسبة لمعظم التطبيقات يجب أن يتطابق مع عرض لليرقة وعرض القناة. متوسط العرض من اليرقات في مراحل مختلفة من التنمية يلي: 0 ساعة posthatch - 140 ميكرون، 24 ساعة posthatch - 180 ميكرون، 48 ساعة posthatch - 320 ميكرون، 72 ساعة posthatch - 500 ميكرون، 96 ساعة posthatch - 750 ميكرون ^8. قنوات تأتي في الاعراض التالية: 100، 150، 200، 250، و 300 ميكرون، وجميع القنوات هي 150 ميكرون عميقة.
   4. استخدام غيض من طينة ملقط أو الفرشاة لضبط الموقف من اليرقة داخل القناة. ويمكن أن تكون موجهة في أي اتجاه: بطنيتصل، أسفل بطني، الجانب بطني واحد، اعتمادا على ما هو هيكل للتصوير.
4. باستخدام ملقط، والوجه بلطف القناة على مثل تلك اليرقة هي الآن على الغطاء الزجاجي. مكان واحد أو اثنين من قطرات من الماء في نهايات القناة بحيث تملأ بالماء (الشكل 2D).
   1. رفع بلطف على جانبي القناة لإزالة أي فقاعات الهواء.
   2. ضبط اتجاه اليرقة. للقيام بذلك، دفع بلطف القناة ولكن ليس غطاء زجاجي للفة اليرقة. إذا كان هذا لا يغير من اتجاه، وإزالة الغطاء الزجاجي وضبط الموقف اليرقات. اليرقة هي جاهزة للتصوير.
   3. صورة قناة / ساترة على مجهر مقلوب. إذا التصوير على المجهر تستقيم، ببساطة عكس قناة / ساترة.

4. قياس الميزة الاهتمام في تسجيل السلوكي

1. لبنية من الفائدة (على سبيل المثال، والذيل، CNS)، وقياس سمة من الفائدة (على سبيل المثالوكثافة مضان، الموقع) مع مرور الوقت.
   ملاحظة: لمحات عن مثل الرأس والذيل ويمكن المشروح يدويا. على سبيل المثال، يمكن التعرف على الرأس والتي تحتوي على الظلام على شكل H السنانير الفم، ويمكن التعرف على الذيل كما تحتوي على spiricles القصبة الهوائية الخلفية. وتركز هذه الورقة على الحبل العصبي. استخدام الخلايا العصبية خط GAL4 elav-GAL4 لقيادة التحوير UAS-MYR-GFP (elav> GFP) ^9،10 لتسمية fluorescently الجهاز العصبي المركزي (CNS). الجهاز العصبي المركزي يحتوي على اثنين من فصوص المخ الأمامية تعلق على الحبل العصبي، التي تمتد إلى الخلفي (الشكل 3).
2. قياس كثافة بكسل من الحبل العصبي (و _(NC)) في كل نقطة زمنية (ر). يصف أدناه نهج الشرح اليدوي، ولكن يمكن أن يكون آليا هذه الخطوة.
   1. في فيجي (أو برامج مماثلة) في القائمة "تحليل" استخدام "القياسات تعيين ..." مربع الحوار لتقرير قيمة رمادي متوسط ​​وSLICه موقف.
   2. رسم يدويا مربع في وسط الحبل العصبي في الإطار الأول من الفيلم (الشكل 3). ويمكن أيضا أن يكون آليا هذه الخطوة مع تجزئة الصور وتسجيل الخوارزميات.
   3. استخدام "القياس" الأمر في قائمة 'تحليل' للإبلاغ عن متوسط ​​كثافة بكسل في المنطقة محاصر من الفائدة. هذا يولد "نتائج" نافذة.
   4. في الإطار التالي، يدويا إعادة مربع دون تغيير حجم باستخدام مفاتيح الأسهم. استخدام "القياس" الأمر مرة أخرى. وسيتم عرض نتائج المحدثة في إطار "نتائج". كرر هذه الخطوة لكل إطار من الفائدة.
   5. حفظ "نتائج" باستخدام "حفظ باسم ..." الأوامر من القائمة ملف. وسيتم تصدير النتائج على النحو ملف .xls.

5. تحليل القياسات

1. تطبيع كل و _(NC) القيمة إلى قيمة تتراوح بين 0 و 1 (ض _(ر) </ م>).
   1. في جدول (أو برنامج آخر)، فتح ملف Results.xls. سيكون هذا الملف واثنين من أعمدة تمثل عدد الإطار ومتوسط ​​كثافة مضان.
   2. جعل عمود جديد واستخدام ض صيغة _(ر) = و _{(NC [ر])} -min _{(و [NC])} / ماكس _{(و [NC])} -min _{(و [NC])} لإنشاء قيمة مضان تطبيع المقابلة لكل نقطة زمنية.
2. تحديد فترة اسعة لكل خطوة في التسجيل.
   ملاحظة: دورة خطوة هي وحدة المتكررة حركة الجسم كله للأمام (والعكس) الزحف. من خلال اتفاقية ويبدأ إلى الأمام خطوة (وينتهي) مع حركة إلى الأمام من الذيل والرأس وغيرها من الأعضاء الداخلية مثل الأمعاء أو الجهاز العصبي المركزي ^1.
   1. تفقد يدويا تسجيل السلوكي وتسجيل الأوقات بدء (ط) من كل خطوة (ط _{(برايد دورة [ن])).}
      ملاحظة: في المثال التالي، حركة إلى الأماممن الجهاز العصبي المركزي كما تم استخدام بدء دورة خطوة (الشكل 3).
   2. لكل خطوة تحسب الفترة: ر Δ _{(دورة برايد) =} ط _{(برايد دورة [ن + 1])} -i _{(برايد دورة [ن]).}
3. حساب النسبة المئوية للدورة خطوة المنقضي للكل نقطة زمنية للتسجيل.
   1. جعل عمود إضافي في ملف جدول يمثل الوقت الذي انقضى منذ بداية دورة برايد (ج). ضبط الوقت منذ بدء خطوة خطوة من الصفر في بدء كل خطوة (ج _{(برايد دورة [ن])} = 0). ضبط مرات بعد بدء وفقا لذلك.
   2. جعل عمود إضافي في ملف جدول البيانات تمثل دورة في المئة خطوة انقضت (٪ دورة خطوة) تقسيم الأوقات المعدلة حسب الفترة خطوة وضرب من قبل 100 إلى اعتناق النسبة المئوية للدورة خطوة المنقضي: دورة٪ خطوة = (ج _{(برايد دورة [ن] ))} / (Δ ت ₍دورة برايد) * 100).

6. توليد القطبية تنسيق مؤامرات لتمثيل ديناميات الهياكل الاهتمام خلال دورة الزحف

1. في MATLAB، واستخدام الحوار "استيراد البيانات" في علامة التبويب الصفحة الرئيسية لاستيراد Results.xls المحدثة.
2. جعل مجموعة جديدة "ثيتا" التي تحتوي على المئة القيم دورة خطوة (٪ دورة خطوة). ( "ثيتا = VAR1" حيث يمثل VAR1 دورة خطوة٪).
3. جعل مجموعة جديدة "رو" تحتوي على قيم مضان تطبيع (ض _(ر)). ( "رو = Var2" حيث يمثل Var2 ض _(ر)).
4. استخدام 'polarplot "الأمر لجعل تنسيق المؤامرات القطبية مع دورة في المئة خطوة مثل زاوية، ومضان كما في دائرة نصف قطرها (" polarplot (ثيتا، رو) ").

Representative Results

توضح هذه المقالة طريقة لتوجيه ذبابة الفاكهة سلوك اليرقات باستخدام قنوات الأغاروس ولقياس ديناميكية هياكل اليرقات خلال دورة الزحف. اليرقات في القنوات الخطية أداء نوبات متواصلة من الزحف الإيقاعي (الشكل 3). لأن كلا من اليرقات وقنوات واضحة بصريا، وقنوات يمكن استخدامها مع يرقات معربا عن تحقيقات الفلورسنت التي أعرب عنها في أي هيكل من الفائدة. سجلنا اليرقات معربا عن GFP في جميع الخلايا العصبية (elav-GAL4 / +، UAS-MYR-GFP / +) ورصد التغيرات الدينامية في كثافة مضان في الحبل العصبي خلال دورة الزحف. وتبين لنا أن يتحرك الجهاز العصبي المركزي إلى الأمام في نفس الوقت تقريبا على رأس اليرقات والذيل (الشكل 4A-B). ونتيجة لموجة من تقلص العضلات يمر على طول محور الجسم، ينتقل الجهاز العصبي المركزي ويخرجون من الطائرة من التركيز مما تسبب في مضان من الحبل العصبي لتغيير (الشكل 4). لتحديد تشان غيس في الحبل العصبي كثافة مضان لعدة خطوات واسعة في العديد من الحيوانات قمنا بتمثيل البيانات على القطبية تنسيق مؤامرة (الشكل 4C). بالتآمر البيانات على قطع القطبية تنسيق يدل على أن ديناميات مضان الحبل العصبي خلال دورة خطوة يتبع نمطا استنساخه.

الشكل 1: تصميم قنوات الخطي لتوجيه ذبابة الفاكهة اليرقات الزحف السلوك (أ) ويظهر تصميم الجهاز ميكروفلويديك تستخدم لجعل قنوات الاغاروز الخطية. تختلف الاعراض من القنوات في هذا الجهاز 100-300 ميكرون بزيادات من 50 ميكرون. عمق 150 ميكرون. يتم تحميل (ب) يرقة ذبابة الفاكهة في قناة الاغاروز. ويرد عرض الظهرية مع الأمامي (الرأس) إلى اليمين. شريط مقياس = 200 ميكرون.4892 / 54892fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: رسم بياني يوضح كيفية تحميل واليرقة إلى قناة قسم البروتوكول 3 لمزيد من التفاصيل راجع من فضلك انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3: هو يرقة ذبابة الفاكهة Fluorescently المسمى يؤدي أداء المستدام، إيقاعي، خطي الزحف عندما وضعت إلى الاغاروز القناة في اليسار، تخطيطي من يرقة معربا عن GFP في جميع الخلايا العصبية ويرد (elav> GFP). يظهر مربع في المنطقة حيث كثافة مضان من الحبل العصبي (تمييزها من قبل لمورفولوجيا ممدود) يمكن قياسها. على اليمين هو مثال على يرقة الزحف من خلال قناة واحدة في فترات الثانية. ويرد عرض الظهرية مع الأمامي حتى. تشير الأسهم إلى البدء في خطوة. مقياس شريط = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4): يتم عرض ديناميات التغيرات الإسفار في الحبل العصب خلال دورة الزحف على القطبية تنسيق مؤامرات (A) رسم تخطيطي لخطوة واحدة. النسب تشير إلى في المئة من دورة خطوة تكتمل. قبل اتفاقية الحركة إلى الأمام من الذيل والرأس والأعضاء الداخلية مثل الجهاز العصبي المركزي يصادف بدء خطوة (أو 0٪ من دورة خطوة). لاحظ أن الجهاز العصبي المركزي (أبيض) يتحرك إلى الأمام والخلف، وكذلك صعودا وهبوطا. والجانب تتنافسيظهر ث مع الأمامي إلى اليمين. (ب) ويظهر مخطاط التموج حركة الرأس والذيل، والجهاز العصبي المركزي. لاحظ أن كثافة مضان من الحبل العصبي خلال دورة خطوة الحيوية. معارض (C) مؤامرة القطبية تنسيق التغيرات الدينامية في كثافة مضان تطبيع من الحبل العصبي خلال دورة خطوة. وتمثل كل نقطة كثافة مضان تطبيع لليرقة واحدة عند نقطة زمنية واحدة (ن = 3 اليرقات، 3 خطوات لكل منها). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تم بناء جهاز ميكروفلويديك لجعل قنوات الاغاروز الخطية التي يمكن أن تستوعب يرقات ذبابة الفاكهة (الشكل 1). عندما توضع يرقات ذبابة الفاكهة في هذه القنوات الأغاروس الخطية ذخيرتهم السلوكي يقتصر على الزحف، والذي يسمح للمراقبة تفصيلية لديناميات هياكل اليرقات خلال دورة الزحف.

يحدث تسجيل ناجحة عندما يرقة تنفيذ سلسلة من الخطوات الإيقاعية (الشكل 3). إذا كان هذا لا يحدث، والتحقق من العقبات مثل فقاعة الهواء في القناة، والتحقق من صحة اليرقة. هناك عنصر آخر مهم من تسجيل الناجح هو أن اليرقة هو التوجه الأمثل لتصور هياكل الفائدة. إذا لم يتم الموجهة اليرقة بشكل صحيح، أو إذا كان يرقة يزحف خارج القناة، ببساطة إزالة ساترة وقم بإعادة تحميل يرقة. في تجربتنا، ~ 20٪ من اليرقات التي شنت في البداية العائد تسجيلات السلوكية ممتازة withouر التعديل.

في الماضي، أخذت قياسات في هياكل اليرقات مثل ربط الفم، القناة الهضمية، وشرائح البطن أثناء الزحف السلوك. لتصور الحركة من هذه الهياكل على مدى دورة خطوة الزحف، تم إنشاء القطبية تنسيق المؤامرات. في هذه الورقة، وقد تم قياس كثافة مضان من الحبل العصبي والقطبية تنسيق المؤامرات استخدامها لتصور ديناميات مضان خلال دورة خطوة الزحف (الشكل 4). وهناك العديد من المزايا لتمثيل البيانات في تنسيق المؤامرات القطبية: أنه يقضي على سرعة الزحف كمتغير، فإنه يمكن تلخيص البيانات من العديد من الحيوانات والعديد من خطوات، ويسمح التصور كل الاتجاهات العامة والاختلاف في البيانات ^11. والجدير بالذكر، أنه من الممكن لقياس ديناميكية من أي هيكل fluorescently المسمى من الفائدة. من حيث المبدأ، وهذا التحليل ينطبق على تتبع أي نوع من التغيرات الديناميكية التي تحدث خلال دورة الزحف. هناك مجموعة واسعة من التطبيقات لأساليب وصفها في هذه الورقة. في الماضي، استخدمت قنوات الأغاروس الخطية لتسجيل سلوك اليرقات في الحي كله، شريحة والعضلات الفردية مستويات ^1. وأظهرت هذه البيانات أن اليرقات تستخدم "الحشوية-pistoning" آلية لكل من الأمام وعكس الزحف، وسمحوا الآلية العصبية والعضلية القيادة على حد سواء إلى الأمام وعكس الزحف يتحدد ^1. في المستقبل، يمكن للباحثين استخدام القنوات لدراسة الزحف في خلفيات وراثية مختلفة. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه ينبغي أن يكون من الممكن استخدام القنوات لتحليل نشاط الخلايا العصبية اليرقات باستخدام التصوير الكالسيوم أثناء الزحف. ومن المتوقع أن يؤدي إلى فهم منها الخلايا العصبية النار في المرحلة مع حركات معينة من دورة الزحف. وأخيرا، لا يوجد سبب أن القنوات يجب أن تتبع تصميم خطي المقدمة في هذه الورقة. وذلك باستخدام قنوات ذات أبعاد مختلفة تساعد بلا شك الإجابة على فارiety من سؤال حول ذبابة الفاكهة تنقل اليرقات والتحكم في المحركات ككل.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 oz square Drosophila bottle	Scimart	DR-103
agar	sigma	A1296
sucrose	sigma	S9378
apple juice			not from concentrate
Tegosept	Fisher	T2300	methyl-p-hydroxybenzoate
35 x 10 mm round petri dish	Fisher	351008
baker's yeast
PDMS casting mold	FlowJem		can be requested from authors
Isopropyl alcohol	Fisher	A417-1
laboratory wipes	Fisher	06-666-11
canned air	Fisher	18-431
10 cm petri dish	BioPioneer	GS82-1473-001
agarose	Fisher	50-444-176
razor blade	Fisher	12-640
forceps	FST	11241-40
22 x 40 cover glass, #1.5	Fisher	50-365-605
Fiji (version 1.51d)	NIH		fiji.sc
Excel 2016	Microsoft		www.microsoftstore.com
MATLAB R2016	Mathworks		www.mathworks.com