Summary
Drosophila larve er en kraftfuld modelsystem til at studere neurale styring af adfærd. Denne publikation beskriver brugen af lineære agarose kanaler til at fremkalde vedvarende anfald af lineær gennemgang og metoder til at kvantificere dynamikken i larver strukturer under gentagne kravle adfærd.
Abstract
Drosophila larvestadiet gennemgang fremstår som en kraftfuld model til at studere neurale styring af sensomotoriske adfærd. Men larver crawling adfærd på flade åbne flader er komplekst, herunder: pause, drejning, og bugtende. Denne kompleksitet i repertoire af bevægelsen hindrer detaljeret analyse af de begivenheder, der opstår under en enkelt crawl skridtlængde cyklus. For at overvinde denne hindring, blev lineære agarose kanaler gjort at begrænse larve adfærd til lige, vedvarende, rytmisk gennemgang. I princippet fordi agarose kanaler og Drosophila larvestadiet kroppen er begge optisk klare, kan overvåges bevægelsen af larvestadium strukturer mærket med genetisk indkodede fluorescerende prober i intakt, frit bevægelige larver. I fortiden, blev larverne placeret i lineære kanaler og kravle på niveau med hele organismen, segment, og muskel blev analyseret 1. I fremtiden kan larver gennemsøgning i kanaler bruges til calcium imaging at overvåge neuronal aktivitet. Desuden kan disse metoder anvendes med larver af enhver genotype og med enhver forsker-designet kanal. Således protokollen nedenfor er bredt anvendelig til undersøgelser under anvendelse af Drosophila larve som model for at forstå motorstyring.
Introduction
Det overordnede mål med denne metode er at studere Drosophila larvestadiet gennemgang i detaljer. Forsøg med bevægelse har spillet en vigtig rolle i at udvikle og afprøve teorier om motorisk kontrol 2. Traditionelt bevægelse er blevet undersøgt i vanddyr (f.eks igle, lampret, Tadpole) 3. Den repetitive karakter af bevægelse i disse dyr har tilladt for studiet af rhythmogenesis, til analyse af de biofysiske begivenheder drivende bevægelse, og til at overvåge de neurale fyring mønstre, der ledsager bevægelse.
Anvendelsen af Drosophila larver til studier af bevægelse er en enestående kombination af fordele i forhold til andre modelsystemer: overfladiske genetik, velkarakteriseret udvikling, et organ, der er optisk klar ved første og anden instars, og en igangværende transmission elektronmikroskopisk rekonstruktion af hele nervesystem 4-6. Imidlertid Drosophila larvestadiet locobevægelse på flade åbne flader er noget kompleks, herunder pauser, vender, og bugtende kravler 7. I denne publikation præsenteres en metode til at bruge lineære agarose-kanaler til at guide Drosophila larve bevægeapparatet adfærd således at larver udføre vedvarende, lige, rytmisk gennemgang adfærd.
Studere Drosophila larvestadiet adfærd i agarose-kanaler, i stedet for adfærd på flade åbne overflader, har flere fordele. For det første giver forskerne specifikt vælge kravle adfærd fra de mange bevægelser, der er en del af den larver adfærdsmæssige repertoire. For det andet, ved at justere bredden af kanalen versus larvernes kropsstørrelse, kravlende hastighed kan justeres. Tredje, kanaler tillader larven kan ses fra dorsal, ventrale eller laterale side, afhængigt af hvordan larven er indlæst og orienteret i kanalen. Denne alsidighed i larvernes orientering muliggør en struktur af interesse at være konstant synlige under kravle. Fjerde,kanaler er medgørlige til anvendelse med en lang række forskellige mikroskoper og mål. For eksempel kan lineære kanaler bruges til lav-opløsning billeddannelse på lyse-field stereoscopes og / eller for høj opløsning billeddannelse på spinning-disk konfokale mikroskoper 1. For det femte kan denne metode anvendes i kombination med optogenetic / thermogenetic neuronale manipulationer i enhver genetisk baggrund. Endelig fordi både larvestadiet legeme (ved første og anden instars) og agarose kanaler er optisk klare, kanaler kan bruges, når man studerer de dynamiske bevægelser eller ændringer i fluorescerende intensitet larval strukturer mærket med genetisk kodede fluorescerende prober.
Den beskrevne fremgangsmåde er egnet til detaljerede kinematiske studier af første og andet stadium Drosophila larvestadiet adfærd. Denne publikation analyserer de dynamiske ændringer i fluorescerende intensitet i CNS under frem larve gennemgang at demonstrere brugen af kanaler og som en forløber for Neuronal calcium imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af larver
- En uge før optagelse adfærd, nedsat en cross (minimum 25 jomfruer og 5 hanner). Bevar alle kors og afkom ved 25 ° C.
BEMÆRK: Temperaturen af dyrkningsbetingelser kan ændres, men den nedenfor beskrevne tid linje ville skulle justeres for at tage højde for ændringer i udviklingsmæssig hastighed. - 5 dage før optagelse, første ting om morgenen, skal du placere indlæg ind en samling bur med en agar / saft hætte og en DAB (0,5-1 ml) af gær pasta i midten af agar / saft cap.
- For at gøre en samling bur, stikke huller i en 6 ounce square polyethylen Drosophila flaske.
- For at gøre agar / juice caps, blandes 18 g agar med 600 ml vand i en konisk kolbe. I en separat kolbe mix 20 g sucrose med 200 ml æblejuice. Mikrobølgeovn indtil faste stoffer opløses. Kombiner og rør, hvilket tillader blandingen afkøle til 60 ° C. Tilsæt 20 ml 10% methyl-p-hydroxybenzoat i 95% ethanol, og der omrøres. Tilføj ~ 7ml til den nederste halvdel af en 35 x 10 mm runde petriskål. Tillad agar / saft at størkne i 1 time ved stuetemperatur. Opbevares ved 4 ° C.
- For at gøre gær pasta, tilføje lige dele volumen tørgær og vand. Opbevares ved 4 ° C.
- Tjek sundhed larver samlinger.
- I morgen, 4 og 3 dage før optagelse, fjerne hætten og placere en ny hætte på buret. Skift hætterne på samme tidspunkt hver dag for at få en 24 timers samling af æg og nyklækkede larve.
- Efter hver cap er fjernet, undersøge den for at se, hvor mange æg korset er æglæggende. Forvent mellem 500-2000 æg. Justere antallet af voksne, hvis det er nødvendigt.
BEMÆRK: Et par æg burde have klækket til larver, og den nyligt udklækkede larver vil blive fundet væk fra gæren pasta. - Alder hver cap i 24 timer. Re-undersøge hætten for at afgøre, om larver er sunde.
BEMÆRK: De fleste æg burde have klækket til larver og larverne burde have kravlet ind i Iast pasta. Tegn på dårligt helbred omfatter et stort antal uklækkede æg, døde larval kroppe væk fra gæren pasta, og larver med betydelige mørke pletter i maven, hvilket indikerer en immunreaktion. Hvis larver er usundt, ændre buret, gør friske caps / gær pasta, og tjek genotypen. - Kassér de gamle hætter.
- Saml larver for adfærdsmæssige optagelser.
- På både 2 og 1 dag før optagelse, fjerne hætten og erstatte med en frisk hætte.
- Mærk hver fjernet hætte og holde ved 25 ° C. Dette vil frembringe en trinvis serie af larver for adfærdsmæssige optagelser. Larver fra nyudklækkede (0-4 timer posthatch) gennem andet stadium (24-48 timer posthatch) kan anvendes i kanalerne. Gem kasketter til optagelser på hinanden følgende dage.
- Kassér alle hætter efter 48 timer.
- Hvis det er nødvendigt, skal du gentage trin 1.4.1-1.4.3 for op til 5 ekstra d. Efter at færre fremstilles befrugtede æg.
- Forbered Lineærrenden PDMS (polydimethylsiloxan en silikoneelastomer) støbeform (figur 1A). PDMS støbeforme er tilgængelige fra Heckscher laboratoriet efter anmodning.
- Rengør støbeform med isopropylalkohol. Air tør, ising tør med laboratorie klude, eller bruge dåse luft.
- Placer støbeformen i en 10 cm petriskål låg eller en anden beholder.
- Forberede og hæld agaroseopløsning.
- Foretag en 3% agaroseopløsning i vand (3 g i 100 ml) ved mikrobølgeopvarmning indtil fuldt opløst.
- Afkøl til 55 ° C, så boblerne til at stige til overfladen.
- Hæld agarose blandingen i petriskål indeholdende støbeformen, således at formen blot er dækket. Lad agarose sæt indtil størknede.
- Fjern de agarose kanaler fra støbeformen. Trim kanterne af agarose disk med et barberblad.
- Sætte kanalens i en 10 cm petriskål nedsænket i vand. De kan opbevares ved 4 ° C i 7 dage.
3. Indlæsning af en Larve i en kanal til Optag Behavior
BEMÆRK: Hvis lagring af kanaler ved 4 ° C, tillader kanaler til at komme til RT, før du bruger for adfærdsmæssige optagelse.
- Brug en ren barberblad til at skære en enkelt kanal fra dem fremstillet i Trin 2 (figur 2A).
- Brug en pincet til at placere kanalen rillede side opad på et dækglas (figur 2B). Størrelsen og tykkelsen af dækglasset afhænger af det særlige anvendelsesområde anvendes til billeddannelse.
- Brug fine tænger til at vælge en larve fra agaren / saft cap fremstillet i trin 1 og anbringes i snittet kanal (figur 2C).
- Du må ikke presse larve. Saml det op forsigtigt med spidsen af tang tand. Det er også muligt at manipulere larve med en pensel med en fin spids.
BEMÆRK: Dette er vigtigt, da larver er meget sensomt at røre ved. Hvis de ikke håndteres med omhu, kan nociceptive reaktioner dominerer deres adfærd i de første par sekunder af eksperimentet. - Vask larverne ved kort nedsænkning i vand.
- Efter placering af larve på cut-kanal, skal du bruge spidsen af pincet tand til forsigtigt drille larve i kanalen lund.
BEMÆRK: Til de fleste anvendelser bredden af larve og bredden af kanalen skal matche. Den gennemsnitlige bredde af larver på forskellige stadier af udvikling følger: 0 t posthatch - 140 um, 24 timers posthatch - 180 um, 48 timers posthatch - 320 um, 72 timer posthatch - 500 um, 96 t posthatch - 750 um 8. Kanaler kommer i følgende bredder: 100, 150, 200, 250 og 300 um, og alle kanaler er 150 um dyb. - Brug spidsen af en pincet tine eller pensel til at justere positionen af larve i kanalen. Det kan orienteres i alle retninger: ventraleop, ventrale ned, ventrale til den ene side, afhængigt af hvilken struktur der skal afbildes.
- Du må ikke presse larve. Saml det op forsigtigt med spidsen af tang tand. Det er også muligt at manipulere larve med en pensel med en fin spids.
- Med pincet, forsigtigt flip kanalen over en så at larven er nu på dækglasset. Placere en eller to dråber vand ved enderne af kanalen, så den fyldes med vand (figur 2D).
- Løft forsigtigt siderne af kanalen for at fjerne eventuelle luftbobler.
- Juster orienteringen af larve. For at gøre dette, forsigtigt skubbe kanalen, men ikke dækglasset at rulle larve. Hvis dette ikke ændre retningen, fjern dækslet glas og justere larvernes position. Larven er klar til at blive afbildet.
- Billede kanalen / dækglas på et omvendt mikroskop. Hvis billeddannelse på en opretstående mikroskop, skal du blot vende den kanal / dækglas.
4. Mål Feature af Interesse for Behavioral optagelse
- For en struktur af interesse (f.eks hale, CNS), måle en funktion af interesse (f.eks, Fluorescensintensitet, placering) over tid.
BEMÆRK: Strukturer såsom hoved og hale kan manuelt kommenteret. For eksempel kan hovedet kan identificeres som indeholdende mørke H-formede mund kroge, og halen kan identificeres som indeholdende posterior luftrør spiricles. Dette papir fokuserer på nerve ledningen. Brug den neuronale GAL4 line elav-GAL4 at drive et UAS-myr-GFP transgen (elav> GFP) 9,10 til fluorescens mærke centralnervesystemet (CNS). CNS indeholder to forreste hjerne lapper fastgjort til nerven snor, som strækker sig til den bageste (figur 3). - Mål pixel intensitet nerve ledning (f (NC)) ved hvert tidspunkt (t). Nedenfor beskriver en manuel anmærkning tilgang, men dette trin kunne automatiseres.
- I Fiji (eller lignende software) i menuen 'Analyser' bruge "Set Målinger ..." dialog boksen for at rapportere middelværdien grå værdi og SKIVEe position.
- Manuelt trække en boks i centrum af nerve ledningen i det første billede i filmen (figur 3). Dette trin kan også automatiseres med billede segmentering og registrering algoritmer.
- Brug kommandoen "Mål" i "Analyser" menuen for at indberette de gennemsnitlige pixel intensitet i indrammede område af interesse. Dette skaber en "Results" vinduet.
- I den næste ramme, manuelt flytte kassen uden at ændre størrelse ved hjælp af piletasterne. Brug kommandoen "Measure" igen. De ajourførte resultater vil blive vist i "Results" vinduet. Gentag dette trin for hver ramme af interesse.
- Gem "Results" ved hjælp af "Gem som ..." kommando i menuen Filer. Resultaterne vil blive eksporteret som en .xls-fil.
5. Analyser Målinger
- Normalisere hver f (NC) værdi til en værdi mellem 0 og 1 (z (t) </ Em>).
- I regneark (eller et andet program), åbn Results.xls filen. Denne fil vil have to kolonner repræsenterer ramme nummer og gennemsnitlig fluorescensintensitet.
- Lav en ny kolonne og bruge formlen z (t) = f (NC [t]) -min (f [NC]) / max (f [NC]) -min (f [NC]) for at generere en normaliseret fluorescens-værdi svarende til hvert tidspunkt.
- Bestem skridtlængde periode for hvert skridt i optagelsen.
BEMÆRK: En skridtlængde cyklus er den enhed af gentagne hele kroppen forslag til frem (og tilbage) kravle. Ved konvention en fremgreb starter (og slutter) med den fremadrettede bevægelse af halen, hoved, og andre indre organer, såsom tarmen eller CNS 1.- Manuelt inspicere adfærdsmæssige optagelse og optage initiation gange (i) for hvert skridt (i (Stride Cycle [n])).
BEMÆRK: I eksemplet nedenfor, fremadrettet bevægelseaf CNS som indledningen af en skridtlængde cyklus blev anvendt (Figur 3). - For hvert skridt beregne periode: Δ t (Stride cyklus) = i (Stride Cycle [n + 1]) -i (Stride Cycle [n]).
- Manuelt inspicere adfærdsmæssige optagelse og optage initiation gange (i) for hvert skridt (i (Stride Cycle [n])).
- Beregn procentdel af skridtlængde cyklus forløbet for hvert tidspunkt for optagelsen.
- Gøre en ekstra søjle i regnearksfilen repræsenterer tiden forløbet siden starten af en skridtlængde cyklus (c). Indstil tid siden skridtlængde initiering til nul ved indledningen af hvert skridt (c (Stride Cycle [n]) = 0). Juster gange efter initiering tilsvarende.
- Lav en ekstra kolonne i regnearket fil repræsenterer procent skridtlængde cyklus forløbet (% skridtlængde cyklus) Divider justerede gange af skridtlængde periode og gange med 100 for at konvertere til en procentdel af skridtlængde cyklus forløbet:.% Skridtlængde cyklus = (c (Stride Cycle [n] )) / (Δ t (Stride cyklus) * 100).
6. Generer Polar Koordinere Plots at repræsentere Dynamics of Structures Interessante over Crawl Cycle
- I MATLAB, bruge 'Importér data "dialog på fanen Startside for at importere den opdaterede Results.xls.
- Lav en ny array "Theta" indeholder procent skridtlængde cyklus værdier (% skridtlængde cyklus). ( "Theta = Var1" hvor Var1 repræsenterer% skridtlængde cyklus).
- Lav en ny array "Rho" indeholder normaliserede fluorescens værdier (z (t)). ( "Rho = Var2" hvor Var2 repræsenterer z (t)).
- Brug 'polarplot "kommando til at gøre polære koordinere plots med procent skridtlængde cyklus som vinklen, og fluorescens som radius (" polarplot (Theta, Rho) ").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne artikel beskriver en metode til at styre Drosophila larvestadiet adfærd ved hjælp af agarose kanaler og til måling af dynamikken i larver strukturer over en kravle cyklus. Larver i lineære kanaler udføre vedvarende anfald af rytmisk gennemgang (figur 3). Fordi både larver og kanaler er optisk klar, kan kanaler bruges med larver udtrykker fluorescerende prober udtrykt i en struktur af interesse. Vi indspillede larver udtrykker GFP i alle neuroner (elav-Gal4 / +; UAS-myr-GFP / +) og overvåget de dynamiske ændringer i fluorescensintensitet i nerve ledningen over kravle cyklus. Vi viser, at CNS bevæger sig fremad på næsten samme tid som larve hoved og hale (figur 4A-B). Som en bølge af muskelkontraktion passerer langs legemet akse, CNS flytter ind og ud af fokusplanet forårsager fluorescens af nerven ledningen for at ændre (figur 4). For at kvantificere chan GES i nerve ledning fluorescensintensitet for flere fremskridt i flere dyr, vi repræsenterede data på en polær koordinat plot (figur 4C). Plotte data på polære koordinatsystem plots viser, at dynamikken i nerve ledningen fluorescens over skridtlængde cyklus følger en reproducerbar mønster.
Figur 1: Design af lineære kanaler til Guide Drosophila Larver Crawling Behavior (A) Udformningen af mikrofluid enhed, der bruges til at lave lineære agarose-kanaler vises.. Bredden af kanaler i denne enhed varierer fra 100 til 300 um i trin på 50 um. Dybden er 150 pm. (B) A Drosophila larve fyldes i en agarose-kanal. En dorsal view er vist med anterior (hoved) til højre. Scale bar = 200 um.4892 / 54892fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:., Der illustrerer hvordan du sætter et Larve i en kanal Se protokol afsnit 3 for detaljer Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. En fluorescens-mærket Drosophila Larver Udfører Vedvarende, Rytmisk, Lineær Crawling når den placeres i en agarose Channel På venstre, en skematisk af en larve udtrykker GFP i alle neuroner (elav> GFP) vises. En boks viser området, hvor fluorescensintensiteten af nerven ledningen (kendetegnet ved sinlangstrakt morfologi) kan måles. På højre er et eksempel på en larve kravler gennem en kanal hvert sekund. En dorsal view er vist med anterior up. Pile angiver indledningen af en skridtlængde. Scale bar = 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Dynamics of fluorescens Ændringer i Nerve Cord Over den Crawl Cycle præsenteres på Polar Koordinere Plots (A) Et diagram af en enkelt skridt.. Procenter henviser til procent af skridtlængde cyklus afsluttet. Konventionelt fremadgående bevægelse af halen, hovedet og indre organer såsom CNS markerer indledningen af en skridtlængde (eller 0% af skridtlængde cyklus). Bemærk, at CNS (hvid) bevæger sig fremad og tilbage, samt op og ned. En side view er vist med anterior til højre. (B) En kymograph viser bevægelsen af hoved, hale, og CNS. Bemærk, at fluorescensintensiteten af nerven ledningen under skridtlængde cyklus er dynamisk. (C) En polær koordinat plot viser de dynamiske ændringer i normaliseret fluorescensintensitet af nerven ledningen over skridtlængde cyklus. Hver prik repræsenterer en normaliseret fluorescens intensiteten af en enkelt larve på et enkelt tidspunkt (n = 3 larver, 3 skridt hver). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En mikrofluidapparat blev bygget til at gøre lineære agarose kanaler, der kan rumme Drosophila larver (figur 1). Når Drosophila larver er placeret i disse lineære agarose kanaler deres adfærdsmæssige repertoire er begrænset til at kravle, som giver mulighed for detaljeret observation af dynamikken i larver strukturer over kravle cyklus.
En vellykket optagelse forekommer, når en larve udføre en række rytmiske skridt (figur 3). Hvis dette ikke sker, så tjek for forhindringer som en luftboble i kanalen, og tjek sundhed larve. Et andet vigtigt element i en vellykket optagelse er, at larven er orienteret optimalt at visualisere strukturer af interesse. Hvis larven ikke er orienteret korrekt, eller hvis larve kravler ud af kanalen, blot fjerne dækglasset og monter larve. Det er vores erfaring, ~ 20% af larver oprindeligt monterede udbytte fremragende adfærdsmæssige optagelser without justering.
Tidligere blev målinger af positionen af larver strukturer såsom munden krog, tarm, og abdominal segmenter under kravle adfærd. For at visualisere bevægelsen af disse strukturer i løbet af kravlende skridtlængde cyklus blev polære koordinere plots genereret. I dette papir, blev fluorescensintensiteten af nerven ledningen måles og polære koordinater plots anvendt til at visualisere dynamikken i fluorescens over gennemgangen skridtlængde cyklus (figur 4). Der er flere fordele ved at repræsentere data på polære koordinere plots: det fjerner kravle hastighed som en variabel, kan det opsummere data fra mange dyr og mange fremskridt, og det giver mulighed for visualisering af både generelle tendenser og variation i data 11. Især er det muligt at måle dynamikken i enhver fluorescens-mærkede struktur af interesse. I princippet denne analyse er anvendelig til at spore nogen form for dynamiske ændringer, der sker over en gennemgang cyklus. Der er en bred vifte af applikationer til de metoder, der er beskrevet i dette dokument. I fortiden, har lineære agarose kanaler blevet anvendt til at optage larvernes adfærd ved hele organismen, segment og individuel muskel niveau 1. Disse data viste, at larver bruger en "visceral-pistoning" mekanisme for både frem og bak kravle, og de tillod den neuromuskulære mekanisme køre både frem og bak kravle skal fastlægges en. I fremtiden kan forskerne bruge kanaler til at studere gennemsøgning i forskellige genetiske baggrunde. Desuden bør det være muligt at bruge kanaler til at analysere aktiviteten af larvestadium neuroner under anvendelse calcium imaging under gennemsøgning. Dette bør føre til en forståelse af hvilke neuroner brand i fase med bestemte bevægelser af gennemgangen cyklus. Endelig er der ingen grund til, at kanalerne skal følge den lineære design præsenteret i dette papir; hjælp kanaler med forskellige dimensioner vil uden tvivl hjælpe med at besvare et variety af spørgsmål om Drosophila larve bevægelse og motorisk kontrol som helhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 oz square Drosophila bottle | Scimart | DR-103 | |
| agar | sigma | A1296 | |
| sucrose | sigma | S9378 | |
| apple juice | not from concentrate | ||
| Tegosept | Fisher | T2300 | methyl-p-hydroxybenzoate |
| 35 x 10 mm round petri dish | Fisher | 351008 | |
| baker's yeast | |||
| PDMS casting mold | FlowJem | can be requested from authors | |
| Isopropyl alcohol | Fisher | A417-1 | |
| laboratory wipes | Fisher | 06-666-11 | |
| canned air | Fisher | 18-431 | |
| 10 cm petri dish | BioPioneer | GS82-1473-001 | |
| agarose | Fisher | 50-444-176 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| forceps | FST | 11241-40 | |
| 22 x 40 cover glass, #1.5 | Fisher | 50-365-605 | |
| Fiji (version 1.51d) | NIH | fiji.sc | |
| Excel 2016 | Microsoft | www.microsoftstore.com | |
| MATLAB R2016 | Mathworks | www.mathworks.com |
References
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Marder, E., Calabrese, R. L. Principles of rhythmic motor pattern generation. Physiol rev. 76 (3), 687 (1996).
- Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems. Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).
- Ohyama, T., et al. A multilevel multimodal circuit enhances action selection in Drosophila. Nature. 520 (7549), 633-639 (2015).
- Landgraf, M., Thor, S. Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology. Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).
- Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude. Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).
- Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae. Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).
- Graf, S. A., Sokolowski, M. B. Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation. J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Rebay, I., Rubin, G. M. Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway. Cell. 81 (6), 857-866 (1995).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Tufte, E. R. The visual display of quantitative information. , Graphics Press. Cheshire, CT. (2004).
