Summary
A larva Drosophila é um sistema poderoso modelo para estudar o controle neural do comportamento. Esta publicação descreve o uso de canais de agarose lineares para provocar surtos sustentados de rastreamento e métodos linear para quantificar a dinâmica das estruturas de larvas durante o comportamento rastejando repetitivo.
Abstract
Drosophila rastreamento larval está emergindo como um modelo poderoso para estudar controle neural do comportamento sensório-motor. No entanto, comportamento de rastreamento larval em superfícies planas e abertas é complexo, incluindo: pausa, girando, e sinuoso. Esta complexidade no repertório do movimento dificulta uma análise detalhada dos eventos que ocorrem durante um único ciclo de rastreamento passo. Para superar esse obstáculo, os canais de agarose lineares foram feitas, que restringem o comportamento das larvas para, sustentada, rastreamento rítmica reta. Em princípio, pois os canais de agarose e o corpo de larvas de Drosophila são ambos opticamente clara, o movimento das estruturas de larvas rotulados por sondas fluorescentes geneticamente codificados podem ser monitorizadas em larvas intacta, livremente em movimento. No passado, as larvas foram colocados em canais lineares e rastejando ao nível do organismo inteiro, segmento, e músculo foram analisados 1. No futuro, as larvas rastejar nos canais podem ser usados para imagiologia de cálcio para monitorar neuroatividade nal. Além disso, estes métodos podem ser utilizados com larvas de qualquer genótipo e com qualquer canal concebido-investigador. Assim, o protocolo apresentado abaixo é amplamente aplicável para estudos utilizando a larva de Drosophila como um modelo para compreender o controlo do motor.
Introduction
O objetivo geral deste método é estudar Drosophila rastreamento larval em detalhe. Experimentos em locomoção têm desempenhado um papel importante no desenvolvimento e teste de teorias sobre o controle motor 2. Tradicionalmente locomoção foi estudado em animais aquáticos (por exemplo, sanguessuga, lampreia, girino) 3. A natureza repetitiva de locomoção nestes animais foi permitido para o estudo de rhythmogenesis, para análise dos eventos biofísicas locomoção de condução, e para monitorizar os padrões de disparo neurais que acompanham a locomoção.
O uso de larvas de Drosophila para estudos de locomoção apresenta uma combinação única de vantagens sobre outros sistemas modelo: genética fáceis, o desenvolvimento bem caracterizada, um corpo que é opticamente clara no primeiro e segundo estádios e uma reconstrução de microscopia eletrônica de transmissão contínua de toda a sistema nervoso 4-6. No entanto, Drosophila larval locomovimento sobre superfícies planas e abertas é um pouco complexo, incluindo pausas, voltas, e sinuoso rasteja 7. Esta publicação apresenta um método para usar os canais de agarose lineares para guiar o comportamento locomotor larval Drosophila tal que larvas executar sustentado, comportamento de rastreamento em linha reta, rítmica.
Estudando o comportamento das larvas de Drosophila em canais de agarose, em vez de comportamento sobre superfícies planas e abertas, tem várias vantagens. Primeiro, ele permite que os pesquisadores para selecionar especificamente rastejando comportamento dos muitos movimentos que fazem parte do repertório comportamental larval. Em segundo lugar, ajustando a largura do canal em relação ao tamanho do corpo das larvas, rastejando velocidade pode ser ajustada. Em terceiro lugar, os canais para permitir que a larva para ser visto a partir dorsal, ventral, ou lateral, dependendo de como a larva é carregado e orientada no interior do canal. Esta versatilidade na orientação das larvas permite a qualquer estrutura de interesse a ser continuamente visível durante o rastreamento. Quarto,canais são passíveis de utilização com uma vasta variedade de microscópios e objectivos. Por exemplo, os canais lineares pode ser usado para geração de imagens de baixa resolução em stereoscopes de campo brilhante e / ou para imagens de alta resolução sobre a fiação de disco microscópios confocal 1. Em quinto lugar, este método pode ser usado em combinação com manipulações neuronais optogenetic / termogênico em todo o fundo genético. Finalmente, porque tanto o corpo larval (em primeiro e segundo estádios) e canais de agarose são opticamente clara, canais podem ser usados quando se estuda os movimentos dinâmicos, ou mudanças na intensidade da fluorescência das estruturas larval rotulados por sondas fluorescentes geneticamente codificados.
O método descrito é apropriado para estudos cinemáticos detalhadas de primeiro e segundo instar Drosophila comportamento larval. Esta publicação analisa as mudanças dinâmicas na intensidade de fluorescência do CNS durante o rastreamento larval para a frente para demonstrar o uso de canais e como um precursor para NeuImagem de cálcio ronal.
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Protocol
1. Preparação de larvas
- Uma semana antes de gravar comportamento, configurar uma cruz (mínimo de 25 virgens e 5 machos). Manter todos os cruzamentos e filhos a 25 ° C.
NOTA: A temperatura de condições de cultura pode ser alterado, mas a linha de tempo descrito abaixo iria necessitar de ser ajustada para considerar as alterações na velocidade de desenvolvimento. - 5 dias antes da gravação, a primeira coisa na parte da manhã, colocar a cruz em uma gaiola coleção com uma tampa de agar / suco e um dab (0,5-1 ml) de pasta de levedura no centro da tampa agar / suco.
- Para fazer uma gaiola de recolha, criar buracos em um 6 oz. polietileno quadrado garrafa de Drosophila.
- Para fazer tampões de agar / suco, misturar 18 g de agar com água de 600 ml num balão de Erlenmeyer. Em um separado frasco de mistura de 20 g de sacarose com 200 ml de suco de maçã. Micro-ondas até os sólidos estarem dissolvidos. Combinar e agita-se, permitindo que a mistura arrefecer até 60 ° C. Adiciona-se 20 ml de 10% de metil-p-hidroxibenzoato de metilo em 95% de etanol, e agita-se. Adicionar ~ 7ml para a metade inferior de uma placa de Petri rodada 35 x 10 mm. Permitir ágar / suco a solidificar durante 1 h à TA. Armazenar a 4 ° C.
- Para fazer a pasta de levedura, adicione partes iguais em volume de fermento seco e água. Armazenar a 4 ° C.
- Verifique a saúde das coleções de larvas.
- Na parte da manhã, 4 e 3 dias antes da gravação, retire a tampa e coloque uma nova tampa na gaiola. Mudar as tampas, ao mesmo tempo todos os dias para obter uma coleção de 24 horas de ovos e larvas recém-nascidas.
- Depois de cada tampa é removida, examiná-lo para ver quantos ovos cruz está colocando. Esperar entre 500-2.000 ovos. Ajustar o número de adultos, se necessário.
NOTA: Alguns ovos devem ter eclodido em larvas, e as larvas recém-eclodidas será encontrada longe da pasta de levedura. - Envelhecemos cada tampa, durante 24 horas. Re-examinar a tampa para determinar se as larvas são saudáveis.
NOTA: A maioria dos ovos deveriam ter chocado em larvas, e as larvas devem ter rastejado para o yepaste ast. Os sinais de má saúde incluem um grande número de ovos não eclodidos, corpos de larvas mortas distância da pasta de levedura, e larvas com manchas escuras significativas no abdómen, indicando uma reacção imunitária. Se as larvas são insalubres, mudar a gaiola, fazer tampas frescas / colar fermento, e verificar o genótipo. - Descartar as velhas caps.
- Recolha larvas para gravações comportamentais.
- Em ambos os dias 2 e 1 antes da gravação, retire a tampa e substituir com uma tampa fresca.
- Etiquetar cada tampa retirada e manter a 25 ° C. Isto irá produzir uma série encenado de larvas para gravações comportamentais. Larvas de recém eclodidos (0-4 h pós-eclosão) através de segunda instar (24-48 h pós-eclosão) pode ser usado nos canais. Salve tampas para gravações em dias consecutivos.
- Descarte todos os tampões depois de 48 horas.
- Se necessário, repita os passos 1.4.1-1.4.3 para até 5 d adicional. Depois que menos ovos fertilizados são produzidos.
- Prepare os PDMS canal lineares (polidimetilsiloxano, um elastômero de silicone) molde de fundição (Figura 1A). PDMS moldes de fundição estão disponíveis a partir do laboratório de Heckscher mediante pedido.
- Limpar o molde de fundição com álcool isopropílico. Ar seco, seque com toalhetes de laboratório ou use ar comprimido.
- Coloque o molde de fundição num prato de 10 centímetros tampa de Petri ou outro recipiente.
- Prepare e despeje solução de agarose.
- Adicione uma solução de 3% de agarose em água (3 g em 100 ml) por microondas até estarem completamente dissolvidos.
- Arrefecer até 55 ° C, permitindo que as bolhas sobem para a superfície.
- Verter a mistura de agarose em placa de petri contendo o molde de fundição de modo a que o molde é apenas coberto. Vamos conjunto de agarose até que solidificou.
- Remover os canais de agarose a partir do molde de fundição. Apara as bordas do disco de agarose com uma lâmina de barbear.
- Coloque o canals em uma placa de Petri de 10 centímetros imerso em água. Eles podem ser mantidas a 4 ° C durante 7 dias.
3. Colocar um Larva em um canal para registrar o comportamento
NOTA: Se canais de armazenamento a 4 ° C, permitem que os canais para chegar até à temperatura ambiente antes de o utilizar para a gravação do comportamento.
- Usar uma lâmina de barbear para cortar limpo num único canal daqueles preparado no Passo 2 (Figura 2A).
- Use uma pinça para colocar o canal sulcado-side-up em uma lamela de vidro (Figura 2B). O tamanho e espessura da lamela depende do âmbito específico usado para a imagem latente.
- Utilize uma pinça fina para seleccionar uma larva do tampão de agar / suco preparada no Passo 1 e colocar no canal de corte (Figura 2C).
- Não aperte a larva. Buscá-lo suavemente com a ponta do dente fórceps. É também possível manipular a larva com um pincel com uma ponta fina.
NOTA: Isto é importante porque as larvas são muito sensitive ao toque. Se eles não forem manuseados com cuidado, as respostas nociceptivas pode dominar o seu comportamento durante os primeiros segundos do experimento. - Lavar as larvas, submergindo-os rapidamente em água.
- Depois de colocar a larva para o canal de corte, use a ponta do dente pinça para provocar suavemente a larva no bosque canal.
NOTA: Para a maioria das aplicações, a largura da larva e a largura do canal deve corresponder. A largura média das larvas em diferentes fases de desenvolvimento a seguir: 0 h pós-eclosão - 140 um, 24 h pós-eclosão - 180 um, 48 h pós-eclosão - 320 uM, 72 h pós-eclosão - 500 mm, 96 h pós-eclosão - 750 uM 8. Canais entram nas seguintes larguras: 100, 150, 200, 250 e 300 um, e todos os canais são de 150 um de profundidade. - Utilize a ponta de um dente ou de uma pinça pincel para ajustar a posição da larva no interior do canal. Ele pode ser orientado em qualquer direcção: ventral-se, ventral para baixo, ventral para um lado, dependendo do que a estrutura está a ser trabalhada.
- Não aperte a larva. Buscá-lo suavemente com a ponta do dente fórceps. É também possível manipular a larva com um pincel com uma ponta fina.
- Utilizando uma pinça, levante o canal ao longo de modo que a larva está agora na tampa de vidro. Coloque uma ou duas gotas de água nas extremidades do canal para que ele se enche de água (Figura 2D).
- Suavemente levantar os lados do canal para remover quaisquer bolhas de ar.
- Ajustar a orientação da larva. Para fazê-lo, gentilmente cutucar o canal, mas não a tampa de vidro para rolar a larva. Se isso não mudar a orientação, remova a tampa de vidro e ajustar a posição larval. A larva está pronta para ser trabalhada.
- Imagem do canal / lamela em um microscópio invertido. Se imagens em um microscópio vertical, basta inverter o canal / lamela.
4. Meça Característica de Participação na gravação Behavioral
- Para uma estrutura de interesse (por exemplo, cauda, CNS), medir uma característica de interesse (por exemplo,, A intensidade de fluorescência, localização) ao longo do tempo.
NOTA: Estruturas como a cabeça ea cauda podem ser anotados manualmente. Por exemplo, a cabeça pode ser identificado como contendo ganchos em forma de H boca escura, e a cauda podem ser identificadas como contendo spiricles traqueal posterior. Este artigo centra-se no cordão nervoso. Utilizar a linha de GAL4 elav-GAL4 neuronal para conduzir um transgene-UAS-GFP MYR (elav> GFP) 9,10 fluorescente para rotular o sistema nervoso central (SNC). O SNC contém dois lobos cerebrais anteriores ligados ao cordão nervoso, que se prolonga para a parte posterior (Figura 3). - Medir a intensidade de pixel do cordão nervoso (F (NC)) em cada ponto de tempo (t). Abaixo descreve uma abordagem anotação manual, mas este passo pode ser automatizado.
- Em Fiji (ou software similar) no menu "Analisar" usar o "Definir Medidas ..." caixa de diálogo para relatar o valor de cinza média e slice posição.
- Desenhar manualmente uma caixa no centro do cordão nervoso no primeiro quadro do filme (Figura 3). Esta etapa também pode ser automatizada com segmentação de imagem e de registro algoritmos.
- Use o comando "Measure" no menu "Analisar" para relatar a intensidade média dos pixels na região encaixotado de interesse. Isso gera uma janela "Resultados".
- No próximo quadro, reposicionar manualmente a caixa sem redimensionar usando as teclas de seta. Use o comando "Measure" novamente. Os resultados atualizados serão mostrados no "Resultados" janela. Repita este passo para cada quadro de interesse.
- Salvar os "Resultados" usando o 'Salvar como ...' comando no menu Arquivo. Os resultados serão exportados como um arquivo .xls.
5. Analisar as Medidas
- Normalizar cada valor F (NC) para um valor entre 0 e 1 (z (t) </ Em>).
- Na planilha (ou outro programa), abra o arquivo Results.xls. Este arquivo terá duas colunas que representam o número do quadro e intensidade média de fluorescência.
- Fazer uma nova coluna e usar a fórmula Z (t) = f (NC [T]) min (F [NC]) / max (f [NC]) min (F [NC]) para gerar um valor de fluorescência normalizada correspondendo a cada ponto de tempo.
- Determinar o período passo para cada passo na gravação.
NOTA: Um ciclo passo é a unidade de toda repetitivo movimento do corpo para a frente (e reverso) rastreamento. Por convenção atacante começa stride (e termina) com o movimento de avanço da cauda, cabeça e outros órgãos internos, como o intestino ou CNS 1.- Inspecionar manualmente a gravação comportamental e registrar os tempos de iniciação (i) de cada passo (i (Stride Ciclo [n])).
NOTA: No exemplo abaixo, o movimento para a frentedo sistema nervoso central como o início de um ciclo do passo foi utilizado (Figura 3). - Para cada passo calcular o período: Δ t (ciclo Stride) = i (Stride Ciclo [n + 1]) -i (Stride Ciclo [n]).
- Inspecionar manualmente a gravação comportamental e registrar os tempos de iniciação (i) de cada passo (i (Stride Ciclo [n])).
- Calcular percentagem de ciclo de passo decorrido para cada ponto de tempo da gravação.
- Realizar uma coluna adicional no ficheiro de folha de cálculo que representa o tempo decorrido desde o início de um ciclo do passo (c). Tempo definido desde a iniciação passo a zero no início de cada passo (c (Stride Ciclo [n]) = 0). Ajustar os tempos após a iniciação em conformidade.
- Faça uma coluna adicional no arquivo de planilha que representa ciclo cento passo decorrido (% ciclo de stride) Divida vezes ajustados pelo período passo e multiplicar por 100 para converter a porcentagem do ciclo da passada decorrido:. Ciclo% stride = (c (Stride Ciclo [n] )) / (T Δ (Ciclo Stride) * 100).
6. Gerar Coordenadas Polares Terrenos para representar dinâmica das estruturas de interesse ao longo do ciclo de rastreamento
- No MATLAB, use o diálogo o "Importação de dados", na guia Início para importar o Results.xls atualizado.
- Faça uma nova matriz "Teta" valores do ciclo da passada contendo por cento (% ciclo da passada). ( "Theta = Var1", onde Var1 representa% do ciclo da passada).
- Faça uma nova matriz "Rho" contêm valores de fluorescência normalizada (z (t)). ( "Rho = Var2", onde Var2 representa z (t)).
- Use o comando 'polarplot' para fazer coordenadas polares parcelas com o ciclo cento passo como o ângulo, e a fluorescência como o raio ( "polarplot (Theta, Rho)").
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Representative Results
Este artigo descreve um método para guiar o comportamento da larva de Drosophila usando canais de agarose e para medir a dinâmica das estruturas larvais ao longo de um ciclo de rastreamento. Larvas em canais lineares executar ataques sustentados de rastreamento rítmica (Figura 3). Uma vez que tanto as larvas e os canais são opticamente transparentes, os canais podem ser usados com larvas expressando sondas fluorescentes expressas em qualquer estrutura de interesse. Gravamos larvas expressando GFP em todos os neurônios (elav-Gal4 / +; UAS-myr-GFP / +) e monitoradas as mudanças dinâmicas na intensidade de fluorescência no cordão nervoso ao longo do ciclo de rastreamento. Nós mostramos que o SNC se move para a frente quase ao mesmo tempo que a cabeça de larvas e cauda (Figura 4A-B). Como uma onda de contracção muscular passa ao longo do eixo do corpo, o CNS se move dentro e para fora do plano de focagem fazendo com que a fluorescência do cordão nervoso para alterar (Figura 4). Para quantificar Chan ges em cordão nervoso intensidade de fluorescência para vários avanços em vários animais, representando os dados em uma coordenada polar plot (Figura 4C). O desenho dos dados em gráficos polares coordenar mostra que a dinâmica da fluorescência cordão nervoso ao longo do ciclo da passada segue um padrão reprodutível.
Figura 1: Projeto de canais lineares para guiar Drosophila larval Crawling Comportamento (A) O design do dispositivo micro usado para fazer canais de agarose lineares é mostrado.. As larguras de canais deste dispositivo variar 100-300 uM em incrementos de 50 um. A profundidade é de 150 uM. (B) Uma larva de Drosophila é carregado para um canal de agarose. A vista dorsal é mostrado com anterior (cabeça) para a direita. Barra de escala = 200 pm.4892 / 54892fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Diagrama que ilustra como colocar um Larva em um canal Consulte a seção de protocolo 3 para mais detalhes Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. A fluorescência marcado Drosophila Zergling Executa sustentado, rítmica, Linear Crawling quando colocado em um Agarose Canal À esquerda, um esquema de uma larva expressando GFP em todos os neurônios (elav> GFP) é mostrado. A caixa mostra a região onde a intensidade de fluorescência do cordão nervoso (distingue pela suamorfologia alongada) pode ser medido. À direita é um exemplo de uma larva rastejar através de um canal em intervalos de um segundo. A vista dorsal é mostrado com anterior para cima. As setas indicam o início de um passo. Barra de escala = 200 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A dinâmica de fluorescência Mudanças no cordão nervoso ao longo do ciclo de rastreamento são apresentados em Coordenadas Polares Plots (A) Um diagrama de um único passo.. Percentagens referem-se a percentagem do ciclo da passada concluída. Por convenção movimento para a frente da cauda, cabeça e órgãos internos como o SNC marca o início de um passo (ou 0% do ciclo da passada). Note-se que o SNC (branco) se move para a frente e para trás, bem como para cima e para baixo. Um lado vieW é mostrado com o anterior para a direita. (B) Um quimógrafo mostra o movimento da cabeça, cauda e CNS. Note-se que a intensidade de fluorescência do cordão nervoso durante o ciclo de passo é dinâmico. (C) A coordenada polar gráfico mostra as mudanças dinâmicas na intensidade de fluorescência normalizada do cordão nervoso ao longo do ciclo da passada. Cada ponto representa uma intensidade de fluorescência normalizada de uma única larva em um único ponto do tempo (n = 3 larvas, 3 passos cada). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um dispositivo de microfluidos foi construído para fazer canais de agarose lineares que podem acomodar as larvas de Drosophila (Figura 1). Quando as larvas de Drosophila são colocados nestes canais de agarose lineares seu repertório comportamental é limitada para o rastreamento, o qual permite a observação detalhada da dinâmica de estruturas larvais ao longo do ciclo de rastreio.
Uma gravação bem sucedida quando ocorre uma larva de executar uma série de passos rítmicos (Figura 3). Se isso não ocorrer, verifique se há obstáculos como uma bolha de ar no canal, e verificar a saúde da larva. Outro elemento importante de uma gravação de sucesso é que a larva é orientada de forma óptima para visualização das estruturas de interesse. Se a larva não está orientado corretamente, ou se a larva rasteja para fora do canal, basta retirar a lamela e remontar a larva. Em nossa experiência, ~ 20% das larvas montado inicialmente produzir excelentes gravações comportamentais withouajuste t.
No passado, foram feitas medições da posição das estruturas de larvas, tal como o gancho boca, intestinos, e segmentos abdominais durante o rastreamento comportamento. Para visualizar o movimento dessas estruturas ao longo do ciclo da passada rastejando, coordenadas polares parcelas foram gerados. Neste papel, a intensidade de fluorescência do cordão nervoso foi medida e de coordenadas polares parcelas usado para visualizar a dinâmica da fluorescência ao longo do ciclo de passo de rastejamento (Figura 4). Existem várias vantagens para representar os dados em coordenadas polares parcelas: elimina a velocidade de rastreamento como uma variável, ele pode resumir dados de muitos animais e muitos passos, e permite a visualização de ambas as tendências globais e variação de dados 11. Nomeadamente, é possível medir a dinâmica de qualquer estrutura fluorescentemente marcado de interesse. Em princípio, esta análise é aplicável a rastrear qualquer tipo de mudanças dinâmicas que ocorre ao longo de um ciclo de rastreamento. Há uma grande variedade de aplicações para os métodos descritos neste artigo. No passado, os canais de agarose lineares têm sido utilizados para gravar o comportamento das larvas nos organismo inteiro, segmento e musculares individuais níveis 1. Estes dados mostraram que as larvas usar um mecanismo de "visceral-pistonamento" tanto para frente e verso, rastejando, e eles permitiram que o mecanismo neuromuscular dirigindo para a frente e inverter o rastreamento a ser determinado 1. No futuro, os pesquisadores podem usar os canais para estudar rastejando em diferentes origens genéticas. Além disso, deve ser possível utilizar canais para analisar a actividade de neurónios larvares usando imagiologia de cálcio durante o rastreamento. Isso deve levar à compreensão de que os neurônios disparam em fase com movimentos particulares do ciclo de rastreamento. Finalmente, não há razão para que os canais devem seguir o desenho linear apresentada neste documento; usando canais com diferentes dimensões, sem dúvida, ajudar a responder a um variety da pergunta sobre Drosophila locomoção das larvas e controle motor como um todo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 oz square Drosophila bottle | Scimart | DR-103 | |
| agar | sigma | A1296 | |
| sucrose | sigma | S9378 | |
| apple juice | not from concentrate | ||
| Tegosept | Fisher | T2300 | methyl-p-hydroxybenzoate |
| 35 x 10 mm round petri dish | Fisher | 351008 | |
| baker's yeast | |||
| PDMS casting mold | FlowJem | can be requested from authors | |
| Isopropyl alcohol | Fisher | A417-1 | |
| laboratory wipes | Fisher | 06-666-11 | |
| canned air | Fisher | 18-431 | |
| 10 cm petri dish | BioPioneer | GS82-1473-001 | |
| agarose | Fisher | 50-444-176 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| forceps | FST | 11241-40 | |
| 22 x 40 cover glass, #1.5 | Fisher | 50-365-605 | |
| Fiji (version 1.51d) | NIH | fiji.sc | |
| Excel 2016 | Microsoft | www.microsoftstore.com | |
| MATLAB R2016 | Mathworks | www.mathworks.com |
References
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