ACT-PRESTO (aktiv klarhed teknik-pres relateret effektiv og stabil overførsel af makromolekyler i organer) muliggør hurtig, effektiv, men billig væv clearing og hurtig antistof indtrængen i ryddet væv ved passiv diffusion eller tryk-assisteret levering. Under anvendelse af denne fremgangsmåde, kan en lang række væv blive ryddet, immunolabeled af flere antistoffer, og volumen-afbildes.
Identifikation og udforskning af den detaljerede organisering af organer eller af hele kroppen på celleniveau er grundlæggende udfordringer i biologi. Overgangsbestemmelser metoder kræver en betydelig mængde tid og kræfter på at opnå et 3D-billede og med sektionering den intakte væv, immunolabeling, og billedbehandling serielt-delt væv, der producerer et tab af information på hvert trin i processen. I nyligt udviklede metoder til høj opløsning billeddannelse inden intakt væv, er molekylær karakterisering været begrænset til mærkning af proteiner. Men aktuelt tilgængelige protokoller for orgel clearing kræve en betydeligt lang procestid, hvilket gør det vanskeligt at gennemføre væv clearing teknikker i laboratoriet. Vi etablerede for nylig en hurtig og yderst reproducerbar protokol betegnes ACT-PRESTO (en ctive c rigtighed t echnique- p ressure r opstemt e fficient og s tabel t ransferaf makromolekyler i o rgans), som giver mulighed for væv clearance løbet af nogle timer. Desuden ACT-PRESTO muliggør hurtig immunolabeling med konventionelle metoder og accelererer antistof indtrængen i det dybe lag af tæt-formede, tykke prøver ved at anvende pres eller konvektion flow. Vi beskriver hvordan man forbereder væv, hvordan at rydde ved lipid fjernelse ved hjælp af elektroforese, og hvordan man immun-pletten ved et tryk-assisteret levering. Den hurtighed og konsekvens af protokollen vil fremskynde udførelsen af 3D histologisk forskning og volumenbaserede diagnoser.
En af udfordringerne i neurovidenskab er visualiseringen af neuronal kredsløb ledninger og individuelle celler i intakt hjernevæv. Indtil for nylig, viser forbindelserne mellem neuronerne på denne måde kræves en) seriel sektionering af væv; 2) molekylær mærkning af specifikke mål, såsom axoner eller proteiner; og 3) visualisering af 3D-rekonstruktion af hele hjernen via beregningsmæssige registrering eller tilpasning af 2D serielle billeder 1. Disse trin er besværlig, kræver en hel del tid, og risikerer at miste information under sektionering og mærkning, hvilket gør neuronal netværk mapping overordentlig vanskelig. Men mange metoder, der tillader visualisering af intakt væv uden sektionering blevet udviklet. Biologiske væv kan gøres optisk transparent ved væv-clearing teknikker 2-10. En af de store metoder er at reducere brydningsindeks forskelle mellem det intakte væv og el opløsningen forat reducere lysspredning i det intakte væv, hvilket således gør vævet gennemsigtig og muliggør observation af dybe strukturer. Nogle typer af nedsænkning løsninger har hydrofobe egenskaber, som resulterer i hurtig fluorescerende quenching under tørringen procedure. Derfor disse metoder er ikke kompatible med fluorescerende billeddannelse over en lang tidsperiode 11,12. I stedet for hydrofobe reagenser, andre fremgangsmåder anvender hydrofile reagenser til væv clearing, såsom SeeDB 4 og Sca l e 6, der bevarer de strukturelle information og fluorescens af det biologiske væv 4,6,8. Imidlertid makromolekyler, herunder antistoffer, ikke kan nå kernen i intakt væv ved diffusion alene. Derfor er den før-mærkning af målmolekyler i dybe områder af tætpakket væv er teknisk udfordrende.
I et nyligt udviklet væv-clearing metode, CLARITY 3, en hydrogel-indlejret biologisk væv is dannet med acrylamid, og lipider fjernes ved elektroforese under natriumdodecylsulfat (SDS) holdig opløsning. Prøven nedsænkes derefter i en opløsning med en matchende reflekterende indeks til at reducere lys spredning 3. Det lipid fjernelse system blev senere ændret i avanceret CLARITY 13 og PACT (passiv klarhed teknik) 10. Efter polymerisering acrylamid kæder tværbinde med proteiner, der danner hydrogel-væv. Lipidbestanddele kan ikke tværbinder med acrylamid; således kan lipider fjernes ved elektroforese under SDS-holdig buffer. Gennem aktiv fjernelse af lipider, hjernevæv markant øger gennemsigtighed 9. Men disse metoder ikke løse umuligheden af dyb-mærkning ved fri diffusion. For at overvinde denne begrænsning, er teknikker til den aktive transport af reagenser i de dybeste dele af tykke væv kræves.
Selvom CLARITY tillader væv clearing og dybt vævvisualisering, er det ikke en let eller hurtig procedure. Det kan tage flere uger at rydde en hel musehjerne 7,14. Hurtig rydning af væv er afgørende for anvendelsen af disse metoder til grundlæggende eller klinisk laboratorie indstillinger for life science forskning eller volumen diagnose. Den nuværende protokol giver en forenklet proces for biologisk væv clearance og efterfølgende protein detektion ved tryk-assisteret levering immunfarvning. Den er velegnet til høj opløsning volumen billeddannelse af store arkiveret og 3D databehandlingssystemer gennem kombination med billeddiagnostiske metoder.
Dårlig fiksering eller hydrogel nedsænkning i væv kan forårsage tab af proteiner og fordrejning af væv under vævet clearingen. Hele den voksne musehjerne inkuberes i 4% paraformaldehyd natten over, efterfulgt af nedsænkning i et minimalt volumen på 20 ml hydrogel monomer opløsning i 12 – 18 timer med forsigtig omrystning. For store væv, herunder humant væv såsom hjernen skiver og rygmarv, forlænget neddypning tid i hydrogelen monomeropløsningen er påkrævet. ACT-protokollen er let anvendelig til rydning af faste væv, fordi vævet fiksering og polymer infusionssæt trin adskilles. Efter væv clearing blev humane væv well-farvet med flere antistoffer. Bemærk, at ACT Skrabningsteknikken er ikke kompatibel med alkohol fikseringsmidler, såsom ethanol og methanol.
Vævet-hydrogel polymeriseringstrin er også kritisk at producere god kvalitet væv efter clearingprocessen. Fordioxygen hæmmer polymerisation af acrylamid, bør den fjernes ved afgasning af væv-holdige opløsning under en infusion nitrogengas system. Alternativt kan de-oxygenering udføres under anvendelse af en vakuumkammer med en varmeblok i 23 timer.
Den clearing sats er afhængig af en lang række faktorer, herunder orglet størrelse, indholdet af lipider eller ECM fibrøse proteiner, tilstanden af fiksering mv De fleste voksne mus væv kan ryddes ved ETC natten over. Der er imidlertid en risiko for unødvendig over-clearing og væv hævelse; således er forskellene i clearing tid er af vigtig overvejelse. Tissue-clearing betingelser skal være empirisk. Vigtigt er det, kan indholdet af ECM påvirke udseendet af den blokerede væv. Farven på væv forbliver hvide eller uigennemsigtig, selv efter ACT i ETC buffer, fordi ACT ikke afhjælper tætte proteinfibre. Hvis disse organer blev nedsænket i RI matching opløsning, deny blev gennemsigtigt.
Hastigheden af væv hævelse synes at være afhængig af ECM indholdet af væv og bløde organer, såsom hjernen, udviser en større kvældningsgrad end tætte organer. Fordi øget væv hævelser vil hjælpe væv-clearing procedure, ACT rutinemæssigt udnytter destilleret vand-baserede buffer i de fleste tilfælde. I nogle tilfælde, når væv ekspandering eller forbigående deformitet er ikke ønskeligt, såsom i embryoner, buffer, der indeholder 0,1 x PBS kan anvendes til høj opløsning billeddannelse. Det bør også bemærkes, at højere koncentrationer salt i bufferen kan forårsage krympning af væv.
ACT metode kan klarlægge hele organer og endda hele kroppen af en mus 14. Imidlertid dybtliggende væv billeddannelse af gennemsigtige væv kræver særlige mikroskoper og mål. Således hjernevæv 1- til 2 mm tykt er mest effektiv for billeddannelse med en konventionel konfokal mikroskop. I vores hænder, fjernelse af etikettened antistoffer fra ACT-forarbejdede væv er antistof-afhængig, og runder af forskellige antistof mærkning anbefales ikke. Adskillige antistoffer, såsom TH og GFAP, fungeret specielt godt for hel-hjerne immunolabeling 14. På den anden side er nogle antistoffer, såsom TUJ1 eller Map2, ofte mærket kun overfladen af vævet. Dette kan forbedres ved andre metoder, såsom SWITCH 15. En anden potentiel begrænsning er, at det kan være vanskeligt at bevare fine proteinstrukturer i ACT-forarbejdede væv på grund af vævet hævelse og krympning under vævs-clearing trin.
Presto teknik er anvendelig til en bred vifte af væv-mærkning teknikker. For eksempel i vævs-transparente metoder under anvendelse af præ-mærkede væv, såsom SeeDB 4 og iDISCO 7, immunmærkning af tæt væv kræver inkubationsperioder længere end adskillige dage til uger. Imidlertid kan PRESTO forkorte inkubationstiden til flere timer, eKTIVERING færdiggørelsen af hele processen inden for en dag med 1 mm tyk tætte væv. PRESTO kan øge effektiviteten af dyb-mærkning tykt, tætte væv, eller endda un-clearede tykke væv. Fordi PRESTO bruger en bordplade centrifuge eller sprøjtepumpe og ikke kræver særligt udstyr, er det relativt let at implementere denne teknik med rutinemæssige lab procedurer.
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).
4% Paraformaldehyde | Lugen SCI | LGB-1175-4B | sample fixation |
Acrylamide | Affymetrix | 75820 | Hydrogel monomer solution |
2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries | VA-044 | Hydrogel monomer solution |
Boric acid | Affymetrix | 76324 | ETC buffer |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 18220 | ETC buffer |
Sodium hydroxide pellets | Junsei chemical | 1310-73-2 | ETC buffer |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323A | Immunolabeling |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Immunolabeling |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Immunolabeling |
Collagen type Ⅳ | Abcam | AB6586 | Antibody/immunolabeling |
Tyrosine hydroxylase (TH) | Millipore | AB152 | Antibody/immunolabeling |
Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | Secondary antibody/ immunolabeling |
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Life Technologies – Molecular Probes | A21206 | Secondary antibody/ immunolabeling |
Confocal dish | SPL lifesciences | 101350 | Imaging |
Confocal microscope | Leica | SP8 | Imaging |
Sucrose | Junsei chemical | 31365-0301 | CUBIC-mount solution |
Urea | Affymetrix | 23036 | CUBIC-mount solution |
N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma-Aldrich | 122262 | CUBIC-mount solution |
ECT chamber | Logos Biosystems, Inc. | C10101 | ETC system |
ECT chamber controller | Logos Biosystems, Inc. | C10201 | ETC system |
Temperature probe | Logos Biosystems, Inc. | C12101 | ETC system |
Peristatic pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | YZ1515X | ETC system |
Buffer reservoir | Logos Biosystems, Inc. | C10401 | ETC system |
Tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12001 | ETC system |
Container holder for 1 tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12002 | ETC system |
Mouse brain slice holder | Logos Biosystems, Inc. | C12004 | ETC system |
Whole rat brain holder | Logos Biosystems, Inc. | C12007 | ETC system |
Peristaltic pump tubing | Logos Biosystems, Inc. | C12104 | ETC system |
Tabletop-centrifuge | Hanil science industrial Co., Ltd | MICRO 12 | c-PRESTO |
Syringe pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | LSP02-1B | s-PRESTO |
Syringe (20 ml) | Korea vaccine Co., Ltd. | KV-S20 | s-PRESTO |
3-way stopcock | Hyupsung medical Co.,Ltd. | HS-T-01N | s-PRESTO |