ACT-PRESTO (aktiv klarhet teknikk trykk relaterte effektiv og stabil overføring av makromolekyler i organer) muliggjør rask, effektiv, men billig vev clearing og raske antistoff penetrasjon inn ryddet vev ved passiv diffusjon eller press-assistert levering. Ved hjelp av denne metoden, kan et bredt spekter av vev skal tømmes, immunolabeled av flere antistoffer, og volum avbildes.
Identifiseringen og utforskning av den detaljerte organiseringen av organer eller av hele kroppen på cellenivå er grunnleggende utfordringer i biologi. Overgangs metoder krever en betydelig mengde av tid og krefter på å skaffe en 3D-bilde og med seksjonering av intakt vev, immunolabeling, og avbildning serielt kåret vev, som frembringer et tap av informasjon på hvert trinn i prosessen. I nylig utviklet metoder for høyoppløselig avbildning innen intakt vev, har molekylær karakterisering vært begrenset til merking av proteiner. Men for tiden tilgjengelige protokoller for orgel clearing krever en betydelig lang prosess tid, noe som gjør det vanskelig å gjennomføre vev clearing teknikker i laboratoriet. Vi har nylig etablert en rask og svært reproduserbare protokoll kalt ACT-PRESTO (a ctive c regularitet t echnique- p rykk r opprømt e fficient og s bord t ransferav makromolekyler i o rgans), som gjør det mulig for vev klaring i løpet av flere timer. Videre gjør ACT-PRESTO rask immunolabeling med konvensjonelle metoder og akselererer antistoff penetrasjon inn i den dype lag av tett-formet, tykke prøvene ved å legge press eller konveksjon flyt. Vi beskriver hvordan å forberede vev, hvordan å rydde av lipid fjerning ved hjelp av elektroforese, og hvordan du Immuno-flekke av en trykkassistert levering. Den hurtighet og konsistens av protokollen vil fremskynde utviklingen av 3D histologisk forskning og volumbaserte diagnoser.
En av utfordringene i nevrovitenskap er visualisering av nevronale kretsen og individuelle celler i intakte hjernevev. Inntil nylig, viser forbindelsene mellom nerveceller på denne måten kreves 1) serie seksjonering av vev; 2) Molekyl merking av spesifikke mål, så som axoner eller proteiner; og 3) visualisering av 3D-rekonstruksjon av hele hjernen via beregnings registrering eller justering av 2D seriebilder 1. Disse trinnene er arbeidskrevende, krever mye tid, og er ansvarlig for å miste informasjon under seksjonering og merking, noe som gjør nevronale nettverk kartlegging svært vanskelig. Imidlertid har mange metoder som tillater for visualisering av intakt vev uten seksjonering blitt utviklet. Biologisk vev kan gjøres optisk transparent av vev-clearing teknikker 2-10. En av de viktigste metodene er å redusere brytningsindeks-forskjeller mellom intakt vev og nedsenking oppløsningen i rekkefølgefor å redusere lysspredning i intakt vev, og gjør således vevet transparent og muliggjør observasjon av dype strukturer. Noen typer redningsløsninger har hydrofobe egenskaper, som resulterer i rask fluorescerende slukke under dehydrering prosedyren. Derfor er disse metodene er ikke kompatible med fluoriserende bilde over en lang tidsperiode 11,12. I stedet for hydrofobe reagenser, andre metoder benytte hydrofile reagenser for vev lysning, slik som SeeDB 4 og Sca l e 6, som opprettholder den strukturelle informasjonen og fluorescensen av det biologiske vev 4,6,8. Imidlertid makromolekyler, inkludert antistoffer, kan ikke nå kjernen i intakt vev ved diffusjon alene. Derfor er den pre-merking av målmolekyler i dype områder av tett-pakket vev teknisk utfordrende.
I en nylig utviklet vev-clearing metode, CLARITY tre, en hydrogel-embedded biologisk vev is dannes med akrylamid, og lipidene blir fjernet ved elektroforese i henhold natriumdodecylsulfat (SDS) -holdig oppløsning. Prøven blir deretter nedsenket i en løsning med en samsvarende reflekterende indeks for å redusere lysspredning 3. Den lipid fjerning systemet ble senere endret i avansert CLARITY 13 og PACT (passiv klarhet teknikk) 10. Etter polymerisering, akrylamid kjeder crosslink med proteiner, danner hydrogel-vev. Lipid-komponenter kan ikke crosslink med akrylamid; således kan lipidene bli eliminert ved elektroforese i henhold til SDS-holdig buffer. Gjennom aktiv eliminering av lipider, øker hjernevev markert i åpenhet 9. Men disse metodene ikke ta det umulige i deep-merking av fri diffusjon. For å overvinne denne begrensningen, er teknikker for aktiv transport av reagenser inn i de dypeste delene av tykke vev nødvendig.
Selv CLARITY tillater vev clearing og dype vevvisualisering, er det ikke en lett eller hurtig prosedyre. Det kan ta flere uker å tømme en hel musehjerne 7,14. Rapid clearing av vev er avgjørende for anvendelsen av slike metoder for grunnleggende eller klinisk laboratorium innstillinger for life science forskning eller volum diagnose. Den nåværende protokollen gir en forenklet prosess for biologisk vev klarering og påfølgende protein deteksjon av trykk-assistert levering immunofarging. Det er egnet for høy oppløsning volum avbildning av store arkivert og 3D databehandlingssystemer gjennom kombinasjon med avbildningsmetoder.
Dårlig fiksering eller hydrogel nedsenking inn i vev kan føre til tap av proteiner og forvrengning av vevet i løpet av vev clearing prosessen. Hele voksen musehjerne bør inkuberes i 4% paraformaldehyd over natten, etterfulgt av nedsenking i et minimalt volum 20 ml hydrogel monomer løsning i 12 – 18 timer med forsiktig risting. For store vev, inkludert humant vev så som hjerneskiver og ryggmargen, utvidet soaking tid i hydrogelen monomerløsningen er nødvendig. ACT-protokollen er lett anvendelig til clearing av faste vev fordi vev fiksering og polymer infusjons trinn er separert. Etter vev clearing, menneskelig vev var godt farget med flere antistoffer. Legg merke til at ACT clearing teknikken er ikke kompatibel med alkohol fiksativ, slik som etanol og metanol.
Vevet-hydrogel polymerisasjonstrinn er også avgjørende for å produsere god kvalitet vev etter clearing prosessen. Fordioksygen hemmer polymeriseringen av akrylamid, bør det fjernes ved avgassing av vev-inneholdende oppløsning under en nitrogengass-infusjonssystem. Alternativt kan de-oksygenering utføres ved hjelp av et vakuumkammer med en varmeblokk i 23 timer.
Clearing hastighet er avhengig av en rekke faktorer, blant annet orgel størrelse, innholdet av lipider eller ECM fibrøse proteiner, tilstanden til fiksering, etc. De fleste voksne mus vev kan rettes opp av ETC over natten. Men det er en fare for unødvendig over-clearing og vev hevelse; dermed forskjellene i clearing tid er av viktig faktor. Tissue-clearing forhold bør bestemmes empirisk. Viktigere, kan innholdet i ECM påvirke utseendet av det klargjorte vev. Fargen på vev forblir hvit eller ugjennomsiktig, selv etter at ACT i ETC buffer, fordi ACT ikke løser tette protein fiber. Imidlertid, når disse organene ble neddykket i RI samsvarende løsning, deny ble gjennomsiktig.
Hastigheten av vev svellingen synes å være avhengig av ECM-innholdet i vev, og myke organer, slik som hjerne, oppviser en større svelling forhold enn tette organer. Fordi økt vev hevelse vil hjelpe vev-clearing prosedyre, ACT rutinemessig benytter destillert vann-basert buffer i de fleste tilfeller. I noen tilfeller, når vev hevelse eller forbigående misdannelse er ikke ønskelig, for eksempel i embryoer, buffer som inneholder 0.1x PBS kan brukes for høy oppløsning bildebehandling. Det bør også bemerkes at høyere saltkonsentrasjon i bufferen kan føre til krymping av vev.
ACT metoden kan avklare hele organer og til og med hele kroppen av en mus 14. Men dypt vev avbildning av gjennomsiktig vev krever spesielle mikroskoper og målsettinger. Således er hjernevev 1 til 2 mm tykke mest effektive for avbildning med en konvensjonell konfokalt mikroskop. I våre hender, fjerning av etikettened antistoffer fra ACT-behandlet vev er antistoffavhengig, og runder med forskjellige antistoff merking anbefales ikke. Flere antistoffer, så som TH og GFAP, virket spesielt godt for hel-hjerne immunolabeling 14. På den annen side er det enkelte antistoffer, så som Tuj1 eller Map2, ofte kalt bare overflaten av vevet. Dette kan forbedres ved andre metoder, slik som SWITCH 15. En annen potensiell begrensning er at det kan være vanskelig å bevare gode proteinstrukturer i ACT-behandlet vev på grunn av vevet svelling og krymping under den vev-clearing trinn.
Presto teknikk er anvendbar på et bredt utvalg av vev-merkingsteknikker. For eksempel, i vev-gjennomsiktig metoder ved hjelp av pre-merket vev, slik som SeeDB 4 og iDISCO 7, immunolabeling av tett vev krever inkubasjonsperioder lengre enn flere dager til uker. Imidlertid PRESTO kan redusere inkubasjonstiden til flere timer, enabling gjennomføring av hele prosessen i løpet av en dag med 1 mm tykk tett vev. PRESTO kan forbedre effektiviteten av dyp-merking tykk, tett vev, eller til og med un-klarerte tykke vev. Fordi PRESTO bruker en bordsentrifuge eller sprøytepumpe og krever ikke noe spesielt utstyr, er det relativt enkelt å implementere denne teknikken med rutinemessige laboratorieprosedyrer.
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).
4% Paraformaldehyde | Lugen SCI | LGB-1175-4B | sample fixation |
Acrylamide | Affymetrix | 75820 | Hydrogel monomer solution |
2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries | VA-044 | Hydrogel monomer solution |
Boric acid | Affymetrix | 76324 | ETC buffer |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 18220 | ETC buffer |
Sodium hydroxide pellets | Junsei chemical | 1310-73-2 | ETC buffer |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323A | Immunolabeling |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Immunolabeling |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Immunolabeling |
Collagen type Ⅳ | Abcam | AB6586 | Antibody/immunolabeling |
Tyrosine hydroxylase (TH) | Millipore | AB152 | Antibody/immunolabeling |
Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | Secondary antibody/ immunolabeling |
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Life Technologies – Molecular Probes | A21206 | Secondary antibody/ immunolabeling |
Confocal dish | SPL lifesciences | 101350 | Imaging |
Confocal microscope | Leica | SP8 | Imaging |
Sucrose | Junsei chemical | 31365-0301 | CUBIC-mount solution |
Urea | Affymetrix | 23036 | CUBIC-mount solution |
N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma-Aldrich | 122262 | CUBIC-mount solution |
ECT chamber | Logos Biosystems, Inc. | C10101 | ETC system |
ECT chamber controller | Logos Biosystems, Inc. | C10201 | ETC system |
Temperature probe | Logos Biosystems, Inc. | C12101 | ETC system |
Peristatic pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | YZ1515X | ETC system |
Buffer reservoir | Logos Biosystems, Inc. | C10401 | ETC system |
Tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12001 | ETC system |
Container holder for 1 tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12002 | ETC system |
Mouse brain slice holder | Logos Biosystems, Inc. | C12004 | ETC system |
Whole rat brain holder | Logos Biosystems, Inc. | C12007 | ETC system |
Peristaltic pump tubing | Logos Biosystems, Inc. | C12104 | ETC system |
Tabletop-centrifuge | Hanil science industrial Co., Ltd | MICRO 12 | c-PRESTO |
Syringe pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | LSP02-1B | s-PRESTO |
Syringe (20 ml) | Korea vaccine Co., Ltd. | KV-S20 | s-PRESTO |
3-way stopcock | Hyupsung medical Co.,Ltd. | HS-T-01N | s-PRESTO |