Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין מטריצה מעורבת 2D, המורכב של ג 'לטין קולגן אני, קולגן 3D אני תקע ללימוד invadosomes ליניארי. פרוטוקולים אלה מאפשרים את המחקר של היווצרות invadosome ליניארי, פעילות מטריקס השפלה, ויכולות הפלישה של תאים ראשוניים שורות תאים סרטניים.
Abstract
הדבקה תאית, הגירה ופלישה מעורבים בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים. לדוגמה, במהלך היווצרות גרורות, תאים סרטניים צריכים לחצות מחסומים אנטומיים כדי לפלוש ולהעביר דרך הרקמה הסובבת כדי להגיע דם או כלי הלימפה. זה דורש את האינטראקציה בין תאים מטריצה תאיים (ECM). ברמה התאית, תאים רבים, כולל רוב תאי הסרטן, מסוגלים ליצור אינבאדוזומים, שהם מבנים המבוססים על F-actin המסוגלים להשפיל ECM. Invadosomes הם המבנים אקטין פולשנית כי לגייס ולהפעיל metalloproteinases מטריצה (MMPs). ההרכב המולקולרי, הצפיפות, הארגון והקשיחות של ה- ECM הם קריטיים בוויסות של היווצרות ואינדואדום. במבחנה , assay ג'לטין הוא assay תקן המשמש להתבונן לכמת פעילות השפלה invadosome. עם זאת, ג'לטין, שהוא קולגן מפוגל, אני לא מטריצה פיזיולוגית ה. Assay הרומן באמצעות סוג אני fibrils קולגן פותחה והשתמשו כדי להוכיח כי זה מטריצה פיזיולוגית הוא inducer חזק של invadosomes. Invadosomes טופס לאורך fibrils קולגן ידועים כמו invadosomes ליניארי בשל הארגון ליניארי שלהם על הסיבים. יתר על כן, ניתוח מולקולרי של אינבדוזום ליניארי הראה כי קולטן תחום discoidin 1 (DDR1) הוא הקולטן המעורבים היווצרות שלהם. נתונים אלה ממחישים בבירור את החשיבות של שימוש במטריצה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית על מנת להבין את האינטראקציות המורכבות בין התאים לבין ה- ECM.
Introduction
מטריקס תאיים (ECM) שיפוץ מתרחשת במהלך תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים, כגון אנגיוגנזה ותאי הפלישה של תאים. בתנאים פיזיולוגיים, סוגי תאים רבים, בעיקר מן השושלת ההמטופויטית, מסוגלים להשפיל אלמנטים של ECM. לדוגמה, מקרופאגים מסוגלים לחצות מחסומים אנטומיים להגיע רקמות, ו osteoclasts לבזות מטריקס עצם כדי להבטיח הומיאוסטזיס סידן. יותר גלובלי, כל המטריצות בגוף מתחדשות כדי לשמור על התכונות הפיסיקליות והכימיות שלהן. ברקמות סרטן, הרכב microenvironment הגידול משתנה. לדוגמה, בסרטן השד והריאות, הקלד אני קולגן overexpressed ו מצטבר סביב הגידול. יתר על כן, הצטברות זו קשורה בסיכון מוגבר לפתח גרורות 1 , 2 . גרורות סרטן תלויה ביכולתם של תאים סרטניים להשפיל את ה- ECM ולפלוש לרקמות סמוכות.
הפעילות פולשנית של תאים מיוחסת מבנים עשירים אקטין מיוחדים הידועים בשם invadosomes. מונח זה כולל podosomes ו invadopodia, אשר נמצאים, בהתאמה, בתאי סרטן נורמלי ( למשל, מקרופאגים, תאי האנדותל, תאים סרטניים כגון MDA-MB-231 תאי סרטן השד). במבחנה , invadosomes יכול להתארגן לצורות שונות: נקודות, אגרגטים, או שושנות 3 . באופן קלאסי, אינבדוזומים מורכבים מליבה F- אקטין המכילה מספר חלבונים, כגון חלבון הפיגום Tks5 וקורטקטין, המקיפים מולקולות פלאק של הדבקה, כגון אינטגרינים ווינקולין 4 . לאחרונה, הוכח כי Tks5 ואת RhoGTPase Cdc42 יכול לשמש כחתימה מולקולרית מינימלית עבור invadosomes תפקודית 5 . מבנים אלה מסוגלים להשפיל את ECM באמצעות גיוס והפעלה של חלבונים metalloprotease ספציפיים, כגון MT1-MMP ו MMP-2 6. במחקר קודם, דיווחנו כי האינטראקציה בין סיבי קולגן מסוג 1 לבין קולטן דסקוידין 1 (DDR1), קולטן ספציפי מסוגי סיבי קולגן מסוג 1, מוביל להיווצרותו של סוג חדש של אינבדוזומים, הנקראים אינבאדומים ליניאריים. Infadosomes ליניארי נוצרות לאורך סוג אני fibrils קולגן 7 . מבנים אלה מסוגלים לבזות סוג אני קולגן fibrils באמצעות גיוס והפעלה של MT1-MMP / MMP2. יתר על כן, היווצרות שלהם תלויה Tks5 ו Cdc42 5 . במבחנה , הפגינו את קיומם של אינבדוזומים ליניאריים ומעורבות DDR1 בהיווצרותם ובפעילותם 8 באמצעות אסטרטגיות שונות המורכבות משילוב של אלמנטים מטריקס שונים, ביניהם: i) פלורסנט מצופה ג 'לטין coverslips, II) סוג פלואורסצנטי אני קולגן fibril מצופה coverslips, ו iii) סוג 3D אני קולגן plugs. בשל השימוש במטריצות שונות, הצלחנו ללמוד ולאפייןIze היווצרות invadosome לינארי ואת פעילות השפלה שלהם 7 , 8 .
לבסוף, כדי להבין טוב יותר את הביולוגיה של תאים פולשניים, שילוב של רכיבי ECM בשתי מערכות 2D ו 3D תרבות שימשו, מחקה את המורכבות של הרכב microenvironment הגידול. להלן פרוטוקולים coverslips ציפוי עם ג'לטין / סוג קולגן אני במערכות התרבות 2D ו 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: לפני קיבוע, כל השלבים הושלמו על מכסה המנוע זרימה סטרילית למינרית.
1. מטריצה דו מימדית
הערה: מטריצות דו-ממדיות משמשות לקביעת אחוז התאים המרכיבים את הפלאדוזומים ואת אזור ההידרדרות של המטריצה לכל תא.
איור 1: פרוטוקול. סיכום הפרוטוקול המשמש להכנת ג'לטין קולגן אני מטריצות. ניתן להפוך את מטריקס ג'לטין בלבד או ג'לטין קולגן אני מטריצה מעורבת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
- מטריקס ג 'לטין
הערה: מטריצות ג 'לטין פלואורסצנט משמשים לכמת השפלה מטריקס, ופלואורסצנטי ג' לטין משמש לקידום הידבקות קולגן אני סיבים. מחצלת ג'לטין פלואורסצנטיRices משמשים גם podosome ו invadopodia מחקרים (ראה איור 1 ).- מתחת למכסה המנוע זרימה סטרילית למינרית, במקום חתיכת parafilm (20 ס"מ x 15 ס"מ) על אזור העבודה לחטא אותו עם אתנול 70%.
- Aliquot 20 טיפות μL של 1 מ"ג / מ"ל ג'לטין בשורה, ברווחב כ 1 ס"מ זה מזה; עיין בתרשים 1 עבור ארגון טיפות.
- כיסוי כל 20 טיפה μL ג'לטין עם coverslip זכוכית autoclaved (12 מ"מ קוטר).
- לדגור על 20 דקות בטמפרטורת החדר. אם הג'לטין הוא פלואורסצנטי, הגן עליו מפני האור.
- Aliquot 40 טיפות μL של 0.5% glutaraldehyde ב 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) בשורה, כל המרווח כ 1 ס"מ מתחת לקו coverslips מ שלב 1.1.3.
זהירות: Glutaraldehyde הוא סוכן מקבע רעילים. השתמש כפפות ולא שואפים. - באמצעות מלקחיים jeweled, להעביר כל ג 'לטין מצופה coverslip כדי טיפה glutaraldehyde.
הערה: זההוא נורמלי כי טיפת ג 'לטין קטן נשאר על parafilm. אל תעשה שימוש חוזר בניסוי זה. - דגירה של 40 דקות בטמפרטורת החדר. עבור coverslips ניאון, להגן עליהם מפני האור.
- קח 24 גם צלחת תרבות התא ולמלא כל טוב עם 500 μL של 1x סטרילי PBS. מניחים את coverslips, בצד ג'לטין למעלה, לתוך כל טוב.
- לשטוף פעמיים 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד.
הערה: בשלב זה, coverslips ניתן להשתמש עבור ניסויים או מאוחסן 1x PBS ב 4 ° C. Non- פלורסנט coverslips ניתן לאחסן במשך שבוע אחד, coverslips ניאון ניתן לאחסן במשך 48 שעות.
- סוג קולגן Fibrillar אני מטריקס
הערה: סוג קולגן Fibrillar אני מטריצה משמש ללימוד היווצרות לינארי ליניארי ואת השפלה מטריקס הקשורים. שילוב של קולגן ניאון אני ולא fluororescent coverslips ג 'לטין משמש colocalize סמנים invadosome עם סיבי קולגן ( למשל, F-actin אניN ערוץ אדום רחוק, קולגן אני בערוץ האדום, Tks5 בערוץ ירוק, צבע Hoechst כתם גרעיני). מצד שני, שילוב של קולגן שאינם פלואורסצנטי אני עם coverslips לא פלואורסצנטי ג 'לטין משמש כדי למקסם את מספר סמנים invadosome מוכתמים ( למשל, F- אקטין בערוץ אדום רחוק, קורטקטין בערוץ האדום, Tks5 ב את הערוץ הירוק, ואת צבע Hoechst כתם גרעיני). לבסוף, שילוב של קולגן שאינם פלורסנט אני עם coverslips ג 'לטין ניאון משמש לכמת את השפלה הקשורים ג' לטין ( למשל, F- אקטין בערוץ אדום רחוק, Tks5 בערוץ האדום, בערוץ הירוק, ואת צבע Hoechst עבור כתם גרעיני) (ראה איור 1). צבע Hoechst משמש הכתם הגרעין, וזה גם בודק זיהום mycoplasma, בנוסף בדיקה PCR נעשה באופן קבוע על שורות תאים בשימוש.- קולגן פלואורסצנטי אני
- השתמש קולגן מסחרי אני חילוץ מן הזנב חולדה גיד ב 0.02 N Acetic aceticד. לשבור את כמות הקולגן אני הכרחי כדי להכין 500 μL של פתרון לכל coverslip בריכוז סופי של 0.4 מ"ג / מ"ל של קולגן I.
- הוסף 5-carboxy x rhodamine succinimidyl אסתר בריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל, מחושב עבור נפח סופי של קולגן אני הפתרון (500 ננומטר μL).
- מערבבים את הפתרון על ידי pipetting למעלה ולמטה ו דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני האור.
- לדלל את נפח הסופי עם DXBCco של פוספט 1X שנאגרו מלוחים (DPBS) המכיל סידן ומגנזיום, ולהשתמש ישירות.
- קולגן Fibrillar אני coverslip
- השתמש הלא fluorescent או פלואורסצנטי ג 'לטין coverslips שהוכן בעבר בשלב 1.1.
- הכן פתרון של קולגן פלואורסצנטי או שאינם פלואורסצנטי אני בריכוז סופי של 0.4 מ"ג / מ"ל 1X DPBS המכיל סידן ומגנזיום.
- הוסף 500 μL של קולגן פלורסנט או שאינם פלואורסצנטי אני פתרון לכלCoverslip ב 24 גם צלחת תרבות התא.
- לדגור על 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עבור קולגן אני פילמור.
- לאחר הדגירה, להסיר את קולגן עודף אני על ידי הטיה צלחת pipetting בצד הבאר (לא ישירות על coverslip) כדי למנוע פגיעה במטריצה.
הערה: לא ניתן לאחסן מטריצה זו. זרע את התאים מיד לאחר הסרת עודף קולגן I.
- קולגן פלואורסצנטי אני
2. זריעת תאים, זמן של תרבות, וקיבוע
- בהתאם לסוג התא, להכין את התאים במדיום התרבות המתאימה ולהוסיף תאים עבור נפח סופי של μL 500 לכל טוב.
- כדי לאפיין את היכולת של קו התא כדי ליצור invadosomes ליניארי כדי להשפיל את המטריצה, צלחת התאים במשך 4 שעות, 12 שעות ו 24 שעות על קולגן אני מטריצה כדי לקבוע את הקינטיקה של היווצרות invadosome ליניארית ואת פעילות השפלה הקשורים.
הערה: טבלה 1 מכילה דוגמאות של שורות תאיםנבדק במעבדה.
טבלה 1: זריעת תאים וזמני הדגירה. טבלה זו מציגה רשימה לא ממצה של שורות תאים המשמשים לחקר אינבדוזום ליניארי. זה מציין את מספר התאים לזרוע על המטריצה, הזמן הדרוש כדי לצפות invadosomes ליניארי, ואת הזמן הדרוש כדי לבחון את השפלה מטריקס הקשורים. לינאדוסים לינאריים יש חיים קצרים. כדי להיות מסוגל לצפות invadosomes ליניארי במספר המרבי של תאים, התאים צריך להיות במגע עם המטריצה קולגן אני לתקופה קצרה של זמן. מצד שני, כדי להיות מסוגלים לדמיין את השפלת הג'לטין שדווחו, התאים חייבים להיות בקשר עם המטריצה אני קולגן במשך תקופה ארוכה יותר של אלה המפורטים לעיל.קו טלפון מספר תאים לכל coverslip זמן המגע עם מטריצה לכימות אינבאדוסית ליניארית זמן מגע עם מטריצה לכימות של פעילות ליניארית של השפלה ליניארית מד"א 231 40,000 4 שעות 12 שעות HUH7 40,000 12 שעות 24 h HEP 3B 40,000 12 שעות 24 h 398 40,000 12 שעות 24 h NIH 3T3 src 30,000 4 שעות 12 שעות A431 50,000 6 שעות 24 h A549 40,000 12 שעות 24 h &# 160; גלם 40,000 12 שעות 12 שעות PAE 40,000 12 שעות 12 שעות - לאחר הסרת המדיום תרבית תאים,לתקן את coverslips במשך 10 דקות μL 500 של paraformaldehyde 4% 1X PBS.
- לשטוף פעמיים עם 1x PBS.
- חנות ב 4 ° C, מוגן מפני האור.
3. Immunofluorescence
- Permeabilize התאים במשך 10 דקות עם פתרון מוכן טרי של 0.2% Triton X-100 ב 1x PBS. אל תשתמש מחדש בפתרון זה.
- לשטוף את coverslips פעמיים עם 1x PBS.
- מניחים חתיכת parafilm (20 ס"מ על 15 ס"מ) על הספסל.
- לדלל את הנוגדן העיקרי 4% אלבומין בסרום שור (BSA) ב 1x PBS, כמתואר בטבלה חומרים .
- Aliquot 50 טיפות μL של הפתרון נוגדן ראשוני בשורה, כל המרווח כ 1 ס"מ זה מזה.
- מניחים כל coverslip על טיפה.
- דגירה של 40 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני האור.
- לאחר תקופת הדגירה, לשטוף פעמיים עם 1x PBS.
- לדלל את נוגדנים משני, phalloidin, וצבע Hoechst ב 4% BSA ב 1xPBS.
- Aliquot 50 טיפות μL של התערובת, כל המרווח כ 1 ס"מ מתחת לקו הראשון של coverslips, כפי שנעשה בעבר.
- מניחים כל coverslip על טיפה.
- דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני האור.
- לאחר הדגירה, לשטוף פעמיים עם 1x PBS.
- לשטוף פעם אחת עם מים מזוקקים כדי להסיר את המלחים.
- הר coverslips על שקופית זכוכית עם פולימר הרכבה גובר.
- בואו coverslips יבש לילה בטמפרטורת החדר, מוגן מפני האור, לפני מיקרוסקופ.
4. כימות
איור 2: כימות Invadosome לינארי. המאקרו דורש תמונות confocal של F- אקטין ו Tks5 מכתים (פורמט: 1,024 x 1,024). ( א ) ראשית, לפתוח את התמונה F- אקטין ולעשות מסכה. ( ב ) ואז, פתוחתמונה Tks5 וסף זה. החל את המאקרו. ( C ) תוצאות ניתוח תופיע בשני טבלאות. מספר הפלאדוזומים הליניאריים לכל תא ומידע אחר, כגון אחוז האחוזים הנמצאים בשימוש על ידי אינבדוזום ליניארי בתא, יהיה בטבלה סיכום. הגודל של כל invadosome ליניארי יהיה בטבלה תוצאות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
- אחוז התאים המייצרים אינבדוזום ליניארי
- לספור את התאים יצירת invadosomes ליניארי, כ 100 תאים לכל coverslip (שימוש טכנית triplicates). לכמת לפחות 300 תאים לכל n, עם n = 3.
- חישוב אחוז התאים יצירת invadosomes ליניארי על ידי לקיחת הממוצע של שלושה ניסויים עצמאיים, וכתוצאה מכך 900 תאים לכמת.
- גודל invadosome לינארי ומספר לכל תא
- השתמש ImageJ עם מאקרו משלים.
- השתמש שלושה coverslips לכל תנאי.
- קח 30 תמונות לכל coverslip של ג 'לטין פלואורסצנטי גרעינים מוכתמים Hoechst.
- השתמש בתוכנת ImageJ כמתואר ב- Martin KH et al. 9 .
5. 3D קולגן הפלישה Assay
איור 3: סכימה assay פלישה. סיכום של פרוטוקול assay הפלישה. קולגן אני חוצה מקושר עם צבע succinimidyl אסתר ו polymerized עבור 1 שעה ב 37 ° C. תאים מתווספים בינוני ללא סרום על גבי קולגן אני תקע. הכנס ממוקם בינוני wi10% FBS. קולגן אני תקעים קבועים 1 שעות לאחר זריעת התא בשליטה ו 3 ימים לאחר זריעת תאים במצב ניסיוני כדי לקבוע את יכולת הפלישה של התאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
- קולגן אני מכין הכנה
- לעשות קורס זמן של 4 שעות, 12 שעות, 24 שעות, 48 שעות, ו 72 שעות עבור הניסוי הראשון כדי לקבוע את הקינטיקה של הפלישה לתוך ג'ל על פי סוג התא. עבור כל ניסוי, הוסף נקודת זמן של שעה אחת כנקודת זמן התייחסות כאשר לא מתרחשת פלישה.
- הכן את הפתרון קולגן אני על הקרח מתחת למכסה המנוע סטרילי זרימה למינרית. הכן 500 μL של פתרון עבור 3 מוסיף החדר Boyden.
- לשאוב 1 מ"ג של חולדה מסחרי זנב קולגן אני להכין פתרון עם ריכוז סופי של 2 מ"ג / מ"ל קולגן I.
- הוסף 5-carboxy x Rhodamine succinimidyl אסתר בריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל, מחושב עבור נפח סופי של קולגן אני הפתרון (במקרה זה, 500 μL).
- מערבבים היטב דגירה 5 דקות על הקרח מתחת למכסה המנוע זרימה סטרילית למינרית, מוגן מפני האור.
- הוסף 50 μL של קר, מסונן 10X PBS ו 6.25 μL של קר כקרח 1 הידרוקסיד נתרן M (NaOH).
- הוסף מים סטריליים על פי הנוסחה 443.75 - x μL של קולגן I.
- הוסף 100 μL של פתרון לכל להכניס לחדר Boyden.
- לדגור על 1 שעה ב 37 ° C כדי לאפשר פילמור.
- הוסף בינוני תרבות התא מועשר עם בסרום שור עוברית (FBS) לתוך בארות חדשות; מקום לתוך הבארות האלה.
- זרע 30,000 תאים על גבי קולגן אני תקע בינוני FBS ללא.
- לאחר culturing התאים ב 37 ° C, לתקן את קולגן אני תקע במשך 30 דקות ב paraformaldehyde 4% 1x PBS.
- השלם immunofluorescence כמו בשלב 3, למעט השלבים הבאים: permeabiliZe עם 0.2% Triton X-100 ב 1x PBS במשך 30 דקות, לא 10 דקות; דגירה עם פתרונות נוגדן ראשוניים ומשניים עבור 1.5 שעות כל אחד, במקום 40 דקות ו 30 דקות, בהתאמה. כתם עבור F- אקטין או גרעינים כדי למקם את התאים.
- לאחר immunofluorescence, להשתמש אזמל לחתוך סביב הממברנה של הכנס בזהירות להעביר את קולגן אני תקע לתחתית זכוכית התחתונה. ודא כי החלק העליון של קולגן אני תקע הוא במגע עם הזכוכית. שמור את הממברנה להוסיף המצורפת לתחתית קולגן אני תקע כדי לשמור על שלמות התקע.
הערה: התקע קולגן אני נשאר שלם בתחתית זכוכית. העומק בין תחתית הזכוכית לבין הפלסטיק המקיף את תחתית הזכוכית שווה לעובי התקע. - מניחים coverslip על קולגן אני תקע הר עם המדיום גובר polymerizing כדי למנוע את התקע מ ייבוש החוצה.
- השתמש מיקרוסקופ confocal הפוך לתמונה קולגן אני תקע; החלק העליון שלהתקע נמצא במגע עם משטח הזכוכית של המנה.
- לרכוש z- מחסנית מלמעלה למטה לתחתית קולגן אני תקע לדמיין הפלישה התא. לקבוע את עובי z- מחסנית ידי בחינת עד כמה עמוק לתאים לפלוש לשדה הדמיה. לבצע רכישות עם המטרה 40X שמן בפורמט 512 x 512 עם גודל צעד z של 0.25 מיקרומטר.
הערה: עבור התייחסות, הממוצע z- מחסנית עבור MDA-MB-231 תאים 3 ימים לאחר זריעת הוא 30 מיקרומטר.
- לרכוש z- מחסנית מלמעלה למטה לתחתית קולגן אני תקע לדמיין הפלישה התא. לקבוע את עובי z- מחסנית ידי בחינת עד כמה עמוק לתאים לפלוש לשדה הדמיה. לבצע רכישות עם המטרה 40X שמן בפורמט 512 x 512 עם גודל צעד z של 0.25 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות שילוב של שני סוגים של מטריצות, ג'לטין וסוג קולגן I ( איורים 1 ו -4 ), יש לנו הדגישו סוג חדש של invadosome, המכונה invadosomes ליניארי. תיוג של מטריצות אלה מאפשר תצפית של היווצרות invadosome ליניארית לאורך קולגן אני סיבים של יכולות השפלה שלהם ( איור 5 ). מספר המבנים הפולשניים ניתן לכמת על ידי המאקרו שתואר לעיל (שלב 4.2), ואת פעילות השפלה ניתן גם לקבוע באמצעות תוכנת ImageJ, כפי שתואר על ידי Martin et al. ו Diaz et al. 9 , 10 . המטריצה המעורבת מאפשרת אפיון של אינאדוזומים ליניאריים על ידי הגדרת DDR1 כקולטן הנחוץ ליצירת וינידות לינאריות ליניארית ( איור 6 ).
"כדי להבין את קיבולת פולשנית של תאים, פיתחנו גם סוג 3D אני קולגן assay plug ( איורים 3 ו -7 ). Assay זה מאפשר לנו לקבוע את מספר התאים אשר פלשו לתוך קולגן אני תקע, כמו גם את המרחק נסע, באמצעות z- מחסנית השחזורים.
איור 4: השוואה של ג'לטין ו ג'לטין קולגן אני מטריצות מעורבות באמצעות מיקרוסקופיה confocal. ייצוג סכמטי המראה את הארגון של coverslips ג'לטין ניאון על הלוח העליון. ( א ) Confocal Z- מחסנית שחזור ממחיש כי מטריקס ג 'לטין פלואורס יוצר שכבה דקה אחידה המכסה את כל השטח של coverslip. ( ב ) מטריצה מעורבת, לאחר בתצהיר של ג'לטין ניאון על coverslips, הקלד אני קולגן fibrilsלפלמר על גבי. קולגן אני fibrils הם מוכתמים באדום. קולגן אני מטריצה הוא עבה הטרוגנית על coverslip. התפלגות הקולגן אני סיבים תלויה פילמור של קולגן אני α שרשראות. סולם בר = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: השפעת ג 'לטין ו ג' לטין קולגן אני מטריצות על היווצרות invadosome ופעילות. התאים המשמשים אלה מבחני הם MDA-MB-231 תאים סרטניים השד. ( א ) ייצוג סכמטי מראה תאים seeded על coverslip ג 'לטין ניאון על הלוח העליון. אזורים השפלה דמיינו בשחור בשל הפחתת הקרינה. מכתים Tks5 שימש כסמן invadosome. על ג 'לטין, את invאדונוזות כי טופס מאורגנים כמו נקודות. ( ב ) ייצוג סכמטי מראה תאים זרע על מטריצה מעורבת של ג'לטין קולגן I. קולגן אני מסומן באדום; תוספת של סיבי קולגן מסוג I מגבירה את יכולתו של התא לשבש את הג'לטין. מעניין, את הסמן invadosome Tks5 הוא מאורגן מחדש, ואת הנקודות מוחלפים על ידי מבנים לינאריים המייצגים invadosom ליניארי. אזורים השפלה דמיינו בשחור בשל הפחתת הקרינה. סולם בר = 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: ניתוח מיקרוסקופיה confocal של הרכב מולקולרית וארגון של invadosomes בשני תנאי ג'לטין מעורב מטריקס. ( א ) ב gמצב האלטין, invadosomes מאורגנים נקודות, ו- F- אקטין (אדום) שיתוף co-localizes עם Tks5 (ירוק, לוח תחתון), אבל לא עם DDR1 (ירוק, הלוח העליון). אלה הם invadosomes קלאסית. סולם ברים = 5 מיקרומטר. ( ב ) ב קולטן ג 'לטין אני מעורב מצב מטריקס, DDR1 (ירוק, הלוח העליון) colocalizes עם קולגן אני fibrils (אדום, פאנל העליון), Tks5 (ירוק, לוח תחתון), ו- F- אקטין (אדום, תחתון לוּחַ). סוג אני fibrils קולגן לגרום להיווצרות של invadosomes ליניארי. סולם ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7: assay הפלישה התא של MDA-MB-231 תאים קולגן אני תקע. 1 שעות לאחר זריעת התאים, מוסיף שולטים קבועים ומוכתמים. ( א ) z- מחסנית ארכישה של קולגן אני תקע מבוצעת באמצעות מיקרוסקופיה confocal. התאים לא לפלוש קולגן אני תקע בנקודת זמן זו; במקום זאת, הם נשארים על גבי קולגן אני תקע. לכן, זה משמש נקודת שליטה כאשר לא מתרחשת פלישה. הפעלת MMP הוא הכרחי עבור התאים לפלוש קולגן אני תקע בצפיפות זו. ( ב ) שלושה ימים לאחר זריעת, כמה תאים לפלוש קולגן אני תקע. Assay זה מאפשר תצפית וכימות של הפלישה התא. בנוסף, ניתן להשתמש בו כדי ללמוד את ההשפעה של תרופות שונות או siRNAs, למשל. סולם בר = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
באופן קלאסי, invadosomes נלמדים במבחנה ללא קשר microenvironment ואת המטריצה שבה התאים מצופים. כמה סוגים של מטריצות משמשים כיום, כולל ג'לטין, פיברונקטין, vitronectin, או בצפיפות גבוהה פיברילר קולגן (HDFC) 7 , 11 ; עם זאת, אלה הם לעתים קרובות לא נציג של microenvironment שבו תאים מתגוררים אינם רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. הנה, סוג חדש של מטריצה, אשר מורכב של הקשר בין ג 'לטין ו פיברילר סוג אני קולגן, שימש. השימוש בסוגי סיבי קולגן מסוג 1 מאפשר לנו להדגיש סוג חדש של אינבאדוזומים, הידועים כאינדואדומים ליניאריים, אשר יוצרים באופן ספציפי על קולגן 1 בארכיטקטורה הפיזיולוגית שלה. תיוג קולגן אני מאפשר לנו לצפות invadosomes ליניארי לאורך הסיבים וכמת היווצרות שלהם באמצעות סמנים סלולריים כגון Tks5 ו קורטקטין. שימוש miXed מטריקס, זיהינו קולטן חדש, קולטן דסקוידין דומיין 1 (DDR1), המעורבים היווצרות של invadosomes ליניארי 8 .
מטריצה מעורבת 2D מאפשר לנו לכמת את פעילות השפלה מטריקס של אינבדיזומים ליניארית באמצעות zymography ב assay באתרו . Assay זה מדווח על פעילות proteolysis של MMPs על ידי ניתוח נוכחות של חורים שחורים בשכבת ג'לטין ניאון. מעניין, ארגון F- אקטין לתוך לינארי לינארי מגדיל את הפעילות השפלה מטריקס לעומת ג 'לטין בלבד 7 . מגבלה אחת של assay זה הוא כי הג 'לטין הוא מטריצה שאינם פיזיולוגיים, וזה הוכיח כי מטריצה פיזיולוגית יותר משנה את התגובה הסלולרית כדי microenvironment. מגבלה נוספת קיימת באופן שבו הפעילות MMP הוא לכמת על קולטן ג 'לטין אני מטריצות מעורבות. רק השפלה הג'לטין כי localizes תחת קולגן Iשכבת בריל ניתן לכמת; לכן, זוהי שיטה עקיפה לכמת קולגן אני השפלה מטריקס. שיטה חלופית לדמיין את פעילות השפלה של לינארי אינבזוזום היא תווית קולגן אני סיבים עם נוגדן ספציפי נגד אתרי מחשוף קולגן (Col1- 3/4 C, immunoglobulin). זה מאפשר הדמיה של סיבים מחורצים ידי immunofluorescence. עם זאת, בשל נדידת תאים, נוגדן זה אינו ספציפי מאוד ב 2 ד עבור השפלה עקב היווצרות invadosome לינארי. דרך נוספת לדמיין לכמת את פעילות השפלה של קולגן אני סיבים היא להשתמש במיקרוסקופ multiphoton ואת הדור השני הרמוני 8 . שיטה זו מאפשרת הדמיה של קולגן אני סיבים ללא כל מכתים.
השיטה שלנו של פולימר סוג קולגן אני שונה בהשוואה לשיטות אחרות בשימוש בספרות 12 , 13 . לדוגמה, Artym כדי לחקור את מעורבותם של invadosomes ליניארי הפלישה התא, קולגן 3D אני תקע assay שימש. קולגן 3D אני תקע כבר בשימוש על ידי הקהילה המדעית כדי ללמוד מבנים פולשניים או את מעורבותם של metalloproteinases בתהליך הפלישה 14 , 15 , 16 . אלה סוגים של 3D matrices יש מגבלות לגביקשיחות r - לדוגמה, קולגן 3D אני תקע הוא פחות נוקשה מאשר מטריקס 2D. יתר על כן, סוג ומקור קולגן אני חשוב גם לגבי ארגון שונים של סיבי קולגן ב vivo 17 . לבסוף, לגבי הרכב microenvironment ב vivo , רק מרכיב אחד של המטריצה תאיים, סוג אני קולגן, התמקדה. מחקר נוסף הוא הכרחי כדי לקבוע את הרלוונטיות של invadosomes ליניארי in vivo . בנוסף לחקר הפולשנים הלינאריים, ניתן להשתמש במטריצה המעורבת, המתוארת כאן, עם סוגים אחרים של רכיבי מטריקס, כגון פיברונקטין, ויטרוקטין וסוגי קולגן אחרים ( לדוגמה, קולגן מסוג IV). פרוטוקול זה יכול להיות מותאם, בהתאם לסוגי האלמנטים מטריקס כי הם עניין ותהליכים שיש ללמוד. עם זאת, ברור כי יצירת מטריצות מורכבות ופיזיולוגיות יאפשר זיהוי של neW נתיבים המעורבים הידבקות התא, הגירה, פלישה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
JDM נתמכה על ידי מלגת הדוקטורט מ- INSERM / Région Aquitaine ונתמכת כיום על ידי פוסט-דוקטורט של שותפות ARC ומכון הסרטן טיש בבית הספר לרפואה של הר סיני. EH נתמך על ידי דוקטורט מ Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. ZE נתמך על ידי פוסט דוקטורט מלגה מן הסוכנות הלאומית de la Recherche (ANR). CM נתמכת על ידי מכון טיש לסרטן בבית הספר לרפואה של הר סיני ו JJBC נתמך על ידי מענק NIH / NCI K22CA196750, TCI מדענים צעירים פרס הסרט JJR קרן, ואת מכון טיש סרטן בבית הספר הר סיני לרפואה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מ- ANR-13-JJC-JSV1-0005. FS נתמך על ידי "Ligue nationale contre le סרטן". VM ו- FS נתמכים על ידי מימון של "Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016" ו- Institut National du Cancer, INCA_8036 ו- PLBio2012.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin solution | Sigma | G1393 | Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml |
| Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate | Molecular probe life technologies | G13186 | 5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water |
| Microscope cover glasses | Marlenfeld GmbH & Co | 111520 | Ø12mm No.1 |
| 2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4 | Electron microscopy science | 15960 | Dilute at 0.5 % in sterile water |
| 1x PBS pH 7.4 | Gibco by life technologies | 10010-015 | Use this PBS in all steps before fixation |
| Collagen I Rat tail | Corning | 354236 | |
| 5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester | Life technologies | C-6125 | |
| DPBS 1x + calcium + magnesium | Gibco by life technologies | 14040-091 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron microscopy science | 15710 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
| 10x PBS buffer pH 7.4 | Ambion | AM9625 | Dilute at 1X in water Use in steps after fixation |
| Tks5 antibody | Santa Cruz | sc-30122 | Invadosome markers Dilution : 1/100 |
| Cortactin 4F11 antibody | Millipore | 5180 | Invadosome markers Dilution :1/100 |
| DDR1 antibody | Cell signaling | 5583 | Linear invadosome receptor |
| Dilution :1/100 | |||
| Phalloidin FluoProbes | Interchim | FT-AZ0330 | Fibrillary actin marker Dilution :1/200 |
| Hoechst | Sigma | 33258 | Nucleus marker Dilution :1/200 |
| Secondary antibodies FluoProbes | Interchim | FP-488 FP-547H or FP-647H | |
| Albumin from bovine serum | Sigma | A2153 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Fluoromount G mounting medium | Interchim | FP 483331 | |
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| Cell culture insert | Corning | 353097 | 8.0µm pore size / 24 wells |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 221465 |
References
- Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-54 (2003).
- Gilkes, D. M., et al. Collagen prolyl hydroxylases are essential for breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 3285-3296 (2013).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 185-211 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Di Martino, J., et al. Cdc42 and Tks5: a minimal and universal molecular signature for functional invadosomes. Cell Adh. Migr. 8, 280-292 (2014).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. J. Cell Sci. 122, 3015-3024 (2009).
- Juin, A., et al. Physiological type I collagen organization induces the formation of a novel class of linear invadosomes. Mol. Biol. Cell. 23, 297-309 (2012).
- Juin, A., et al. Discoidin domain receptor 1 controls linear invadosome formation via a Cdc42-Tuba pathway. J. Cell Biol. 207, 517-533 (2014).
- Martin, K. H., et al. Quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts. J. Vis. Exp. , e4119 (2012).
- Diaz, B. Invadopodia detection and gelatin degradation assay. Bio-protocol. 3, 1-8 (2013).
- Artym, V. V., et al. Dense fibrillar collagen is a potent inducer of invadopodia via a specific signaling network. J. Cell Biol. 208, 331-350 (2015).
- Schachtner, H., et al. Megakaryocytes assemble podosomes that degrade matrix and protrude through basement membrane. Blood. 121, 2542-2552 (2013).
- Schoumacher, M., Glentis, A., Gurchenkov, V. V., Vignjevic, D. M. Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay. Methods Mol. Biol. 1046, 133-144 (2013).
- Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 102, 3262-3269 (2003).
- Geraldo, S., et al. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo? Eur. J. Cell Biol. 91, 930-937 (2012).
- Monteiro, P., et al. Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia. J. Cell Biol. 203, 1063-1079 (2013).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).
