Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

2D- og 3D-matriser for å studere lineær invadosomdannelse og aktivitet

Published: June 2, 2017 doi: 10.3791/54911
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,3,4, 2, 2, 1, 1
1INSERM U1053, 2Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Tisch Cancer Institute, 3Faculté de Médecine, Casablanca, Université Mohammed 6 des Sciences de la Santé (UM6SS), 4Laboratoire National de Référence
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan du skal lage en 2D blandet matrise, bestående av gelatin og kollagen I, og en 3D kollagen I-plugg for å studere lineære invadosomer. Disse protokollene tillater studier av lineær invadosomdannelse, matriksdegradasjonsaktivitet og invasjonsegenskapene til primære celler og kreftcellelinjer.

Abstract

Celleadhesjon, migrasjon og invasjon er involvert i mange fysiologiske og patologiske prosesser. For eksempel, under metastaseformasjon, må tumorceller krysse anatomiske barrierer for å invadere og migrere gjennom det omkringliggende vevet for å nå blod eller lymfatiske kar. Dette krever samspillet mellom celler og den ekstracellulære matriksen (ECM). På mobilnivå kan mange celler, inkludert de fleste kreftceller, danne invadosomer, som er F-aktinbaserte strukturer som er i stand til å nedbryte ECM. Invadosomer er fremspringende aktinstrukturer som rekrutterer og aktiverer matrise metalloproteinaser (MMPs). Den molekylære sammensetning, tetthet, organisering og stivhet av ECM er avgjørende for regulering av invadosomdannelse og aktivering. In vitro er en gelatinestudie standardanalysen som brukes til å observere og kvantifisere invadosomedbrytningsaktivitet. Gelatin, som er denaturert kollagen I, er imidlertid ikke en fysiologisk matrise element. En ny analyse med bruk av type I kollagenfibriller ble utviklet og brukt til å demonstrere at denne fysiologiske matrisen er en potent induktor av invadosomer. Invadosomer som danner langs kollagenfibriller er kjent som lineære invadosomer på grunn av deres lineære organisering på fibrene. Videre viste molekylær analyse av lineære invadosomer at discoidin-domene-reseptoren 1 (DDR1) er reseptoren involvert i deres dannelse. Disse dataene viser tydelig viktigheten av å bruke en fysiologisk relevant matrise for å forstå de komplekse interaksjonene mellom celler og ECM.

Introduction

Ekstracellulær matrise (ECM) remodeling oppstår under fysiologiske og patologiske prosesser, som angiogenese og tumorcelle invasjon. I fysiologiske forhold kan mange celletyper, hovedsakelig fra hematopoietisk stamme, nedbryte ECM-elementer. For eksempel er makrofager i stand til å krysse anatomiske barrierer for å nå vev, og osteoklaster nedbryter beinmatrise for å sikre kalsiumhemostase. Mer globalt, forny alle matriser i kroppen for å opprettholde sine fysiske og kjemiske egenskaper. I kreftvev endres tumormikromiljøsammensetningen. For eksempel i bryst- og lungekreft er type I kollagen overuttrukket og akkumuleres rundt svulsten. Videre er denne akkumuleringen forbundet med økt risiko for utvikling av metastase 1 , 2 . Kreftmetastase er avhengig av kreftcellernes evne til å nedbryte ECM og invadere tilstøtende vev.

DeInvasiv aktivitet av celler tilskrives spesialiserte aktinrike strukturer kjent som invadosomer. Dette begrepet omfatter podosomer og invadopodier, som er til stede i henholdsvis normale og kreftceller ( f.eks. Makrofager, endotelceller og kreftceller som MDA-MB-231 brystkreftcellelinjen). In vitro kan invadosomer organisere i forskjellige former: prikker, aggregater eller rosettes 3 . Klassisk er invadosomer sammensatt av en F-aktinkjerne som inneholder flere proteiner, slik som stillasproteinet Tks5 og cortactin, omgitt av adhesjonsplakkmolekyler, så som integriner og vinculin 4 . Nylig ble det vist at Tks5 og RhoGTPase Cdc42 kan brukes som en minimumsmolekylær signatur for funksjonelle invadosomer 5 . Disse strukturene er i stand til å nedbryte ECM via rekruttering og aktivering av spesifikke metalloprotease proteiner, som MT1-MMP og MMP-2 6. I en tidligere studie rapporterte vi at samspillet mellom type I kollagenfibriller og discoidin domene receptor 1 (DDR1), en spesifikk reseptor av type I kollagenfibriller, fører til dannelsen av en ny klasse invadosomer, kalt lineære invadosomer. Lineære invadosomer dannes langs type I kollagenfibriller 7 . Disse strukturene er i stand til å nedbryte type I kollagenfibriller via rekruttering og aktivering av MT1-MMP / MMP2. Videre er deres dannelse avhengig av Tks5 og Cdc42 5 . In vitro demonstrerte vi eksistensen av lineære invadosomer og involvering av DDR1 i deres dannelse og aktivitet 8 ved hjelp av forskjellige strategier bestående av en kombinasjon av forskjellige matrikselementer, inkludert: i) fluorescerende gelatinebelagte dekklister, ii) fluorescerende type I kollagenfibril -belagte dekselglass, og iii) 3D type I kollagenplugger. På grunn av bruken av forskjellige matriser, var vi i stand til å studere og karakterereIze lineær invadosomdannelse og deres nedbrytningsaktivitet 7 , 8 .

Til slutt, for bedre å forstå biologien til invasive celler, ble en kombinasjon av ECM-komponenter i begge 2D- og 3D-kultursystemer brukt, etterlikner kompleksiteten av tumormikro-miljø-sammensetningen. Nedenfor er protokoller for beleggbelegg med gelatin / type I kollagen i 2D- og 3D-kultursystemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Før fiksering, er alle trinnene fullført i en steril laminarstrømshett.

1. 2D matrise

MERK: 2D-matriser brukes til å bestemme prosentandelen celler som danner invadosomer og matrisedbrytningsområdet per celle.

Figur 1
Figur 1: Protokoll. Sammendrag av protokollen som brukes til å fremstille gelatin og kollagen I matriser. Det er mulig å lage gelatinematrisen alene eller en gelatin og kollagen I blandet matrise. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Gelatinmatrise
    MERK: Fluorescerende gelatinmatriser brukes til å kvantifisere matriksdegradering, og ikke-fluorescerende gelatin brukes til å fremme adhesjonen av kollagen I-fibre. Fluorescerende gelatinematteRice brukes også til podosome og invadopodia studier (se figur 1 ).
    1. Under en steril laminarflatehette, sett et parafilm (20 cm x 15 cm) på arbeidsområdet og desinfiser det med 70% etanol.
    2. Aliquot 20 μl dråper med 1 mg / ml gelatin i en linje, fordelt ca. 1 cm fra hverandre; Referer til figur 1 for dråpeorganisasjon.
    3. Dekk hver 20 μl gelatinedropp med et autoklavert glassdeksel (12 mm i diameter).
    4. Inkuber i 20 minutter ved romtemperatur. Hvis gelatinen er fluorescerende, beskyt den mot lys.
    5. Aliquot 40 μl dråper med 0,5% glutaraldehyd i 1x fosfatbuffert saltvann (PBS) i en linje, hver på avstand ca. 1 cm under linjen av dekselglass fra trinn 1.1.3.
      FORSIKTIG: Glutaraldehyd er et giftig fikseringsmiddel. Bruk hansker og ikke inhaler.
    6. Bruk jeweled pincett, overfør hver gelatincoated deksel til en glutaraldehyddråpe.
      MERK: DetDet er normalt at en liten gelatinedropp forblir på parafilmen. Ikke bruk dette til et annet eksperiment.
    7. Inkuber i 40 minutter ved romtemperatur. For fluorescerende dekselbeskytter, beskytt dem mot lys.
    8. Ta en 24-brønn cellekulturplate og fyll hver brønn med 500 μL steril 1x PBS. Legg dekselglassene, gelatin side opp i hver brønn.
    9. Vask to ganger i 1x PBS i 5 minutter hver.
      MERK: På dette trinnet kan dekselet brukes til eksperimentering eller lagres i 1x PBS ved 4 ° C. Ikke-fluorescerende dekselglass kan lagres i en uke, og lysrør kan lagres i 48 timer.
  2. Fibrillær kollagen type I matriks
    MERK: Fibrillær kollagen type I matrise brukes til å studere lineær invadosomdannelse og tilhørende matrisedbrytning. En kombinasjon av fluorescerende kollagen I og ikke-fluorescerende gelatine dekselglass brukes til å kolokalisere invadosommarkører med kollagenfibre ( f.eks. F-aktin iN den farrøde kanalen, kollagen I i den røde kanalen, Tks5 i den grønne kanalen, og Hoechst fargestoffer for en atomfarge). På den annen side brukes en kombinasjon av ikke-fluorescerende kollagen I med ikke-fluorescerende gelatine dekselglass for å maksimere antall invadosomarkører som er farget ( f.eks. F-aktin i den farrøde kanalen, kortaktin i den røde kanalen, Tks5 i Den grønne kanalen og Hoechst-fargestoffet for en atomfarge). Endelig brukes en kombinasjon av ikke-fluorescerende kollagen I med fluorescerende gelatine dekselglass til å kvantifisere den gelatinassosierte nedbrytningen ( f.eks. F-aktin i den farrøde kanalen, Tks5 i den røde kanalen, i den grønne kanalen og Hoechst-fargestoffet For en atomfarge) (se figur 1). Hoechst-fargestoffet brukes til å plette kjernen, og det kontrollerer også for mycoplasmaforurensning, i tillegg til en PCR-test gjort regelmessig på de anvendte cellelinjer.
    1. Fluorescerende kollagen I
      1. Bruk kommersielt kollagen I ekstrahert fra rottehalsepen i 0,02 N eddiksyred. Ta ut mengden kollagen som er nødvendig for å fremstille 500 ul løsning per deksel i en sluttkonsentrasjon på 0,4 mg / ml kollagen I.
      2. Tilsett 5-karboksy x rhodaminsuccinimidylester i en sluttkonsentrasjon på 10 μg / ml beregnet for sluttvolumet av kollagen I-løsning (nx 500 μl).
      3. Bland oppløsningen ved pipettering opp og ned og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur, beskyttet mot lys.
      4. Fortynn til sluttvolum med 1X Dulbecco's fosfatbuffert saltløsning (DPBS) som inneholder kalsium og magnesium, og bruk direkte.
    2. Fibrillær kollagen I deksel
      1. Bruk de ikke-fluorescerende eller fluorescerende gelatine dekselene som tidligere ble fremstilt i trinn 1.1.
      2. Lag en løsning av fluorescerende eller ikke-fluorescerende kollagen I ved en sluttkonsentrasjon på 0,4 mg / ml i 1X DPBS som inneholder kalsium og magnesium.
      3. Tilsett 500 μL fluorescerende eller ikke-fluorescerende kollagen I løsning perCoverlip i en 24-brønn cellekulturplate.
      4. Inkuber i 4 timer ved 37 ° C for kollagen I-polymerisering.
      5. Etter inkubering, fjern overflødig kollagen I ved å vippe platen og pipetteringen på siden av brønnen (ikke direkte på dekselet) for å unngå å skade matrisen.
        MERK: Denne matrisen kan ikke lagres. Sæd cellene umiddelbart etter fjerning av overskytende kollagen I.

2. Cellsåing, tid for kultur og fiksering

  1. Avhengig av celletypen, lagre cellene i riktig dyrkningsmedium og tilsett celler for et sluttvolum på 500 μl per brønn.
  2. For å karakterisere evnen til en cellelinje til å danne lineære invadosomer og å nedbryte matrisen, plater cellene i 4 h, 12 h og 24 h på kollagen I-matriks for å bestemme kinetikken for lineær invadosomdannelse og den tilhørende nedbrytningsaktivitet.
    MERK: Tabell 1 inneholder eksempler på cellelinjerTestet i laboratoriet.
    Cellelinje Antall celler per deksel Tidspunkt for kontakt med matrisen for lineær invadosom kvantifisering Tidspunkt for kontakt med matrisen for kvantifisering av lineær invadosomedbrytningsaktivitet
    MDA MB 231 40000 4 timer 12 timer
    Huh7 40000 12 timer 24 timer
    HEP 3B 40000 12 timer 24 timer
    SNU 398 40000 12 timer 24 timer
    NIH 3T3 src 30000 4 timer 12 timer
    A431 50000 6 timer 24 timer
    A549 40000 12 timer 24 h &# 160;
    RÅ 40000 12 timer 12 timer
    PAE 40000 12 timer 12 timer
    Tabell 1: Cellsåpning og inkubasjonstid referanse. Tabellen presenterer en ikke-uttømmende liste over cellelinjer som brukes til å studere lineære invadosomer. Det indikerer antall celler til frø på matrisen, tiden som er nødvendig for å observere lineære invadosomer, og tiden som er nødvendig for å observere den tilhørende matrisedannelse. Lineære invadosomer har kort levetid. For å kunne observere lineære invadosomer i det maksimale antall celler, må cellene være i kontakt med kollagen I-matrisen i en kort periode. På den annen side, for å kunne visualisere den rapporterte gelatinedbrytningen, må cellene være i kontakt med kollagen I-matrisen i en lengre periode enn de som er nevnt ovenfor.
  3. Etter fjerning av cellekulturmediet,Fest dekselglassene i 10 minutter i 500 μl 4% paraformaldehyd i 1X PBS.
  4. Vask to ganger med 1x PBS.
  5. Oppbevares ved 4 ° C, beskyttet mot lys.

3. Immunofluorescens

  1. Permeabiliser cellene i 10 minutter med en ny tilberedt løsning Av 0,2% Triton X-100 i 1x PBS. Ikke bruk denne løsningen igjen.
  2. Vask dekselene to ganger med 1x PBS.
  3. Legg et stykke parafilm (20 cm x 15 cm) på benken.
  4. Fortynn primærantistoff i 4% bovint serumalbumin (BSA) i 1x PBS, som beskrevet i Materialetabellen .
  5. Aliquot 50 μl dråper av primær antistoffoppløsning i en linje, hver avstand på omtrent 1 cm fra hverandre.
  6. Legg hver deksel på en dråpe.
  7. Inkuber i 40 minutter ved romtemperatur, beskyttet mot lys.
  8. Etter inkuberingsperioden vaskes to ganger med 1x PBS.
  9. Fortynn sekundær antistoff, phalloidin og Hoechst fargestoff i 4% BSA i 1xPBS.
  10. Aliquot 50 μl dråper av blandingen, hver avstand ca 1 cm under den første linjen av deksel, som tidligere gjort.
  11. Legg hver deksel på en dråpe.
  12. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur, beskyttet mot lys.
  13. Etter inkubering, vask to ganger med 1x PBS.
  14. Vask en gang med destillert vann for å fjerne saltene.
  15. Monter dekslene på en glidelås med polymeriseringsmonteringsmedium.
  16. La dekselplatene tørke over natten ved romtemperatur, beskyttet mot lys, før mikroskopi.

4. Kvantifiseringer

Figur 2
Figur 2: Lineær invadosom kvantifisering. Makroen krever konfokale bilder av F-aktin og Tks5-farging (format: 1,024 x 1,024). ( A ) Først åpner du F-actin-bildet og lager en maske. ( B ) Åpne deretterTks5-bildet og terskelen det. Bruk makroen. ( C ) Analyserte resultater vises i to tabeller. Antall lineære invadosomer per celle og annen informasjon, som prosentandelen som benyttes av lineære invadosomer i cellen, vil være i Sammendragstabellen. Størrelsen på hver lineær invadosom vil være i Resultat-tabellen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Prosentandel av celler som danner lineære invadosomer
    1. Telle cellene danner lineære invadosomer, ca. 100 celler per dekselglass (bruk tekniske treplater). Kvantifiser minst 300 celler per n, med n = 3.
    2. Beregn prosentandelen celler som danner lineære invadosomer ved å ta gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter, noe som resulterer i 900 kvantifiserte celler.
  2. Lineær invadosomstørrelse og antall pr. Celle
  3. Bruk ImageJ med tilleggsmakroen.
  • Nedbrytning per celle
    1. Bruk tre deksler per tilstand.
    2. Ta 30 bilder per deksel av fluorescerende gelatin og Hoechst-farget kjerne.
    3. Bruk ImageJ-programvaren som beskrevet i Martin KH et al. 9 .

    • 5. 3D Kollagen Invasion Assay

    Figur 3
    Figur 3: Invasjonsanalyseskema. Sammendrag av invasjonsanalyseprøven. Kollagen I er kryssbundet med succinimidylesterfarve og polymerisert i 1 time ved 37 ° C. Celler tilsettes i serumfritt medium på toppen av kollagen I-pluggen. Innsatsen er plassert i medium wiTh 10% FBS. Kollagen I-plugger er fikset 1 time etter cellesedling i kontrollen og 3 dager etter celledøing i eksperimentell tilstand for å bestemme invasjonskapasiteten til cellene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

    1. Kollagen jeg plugger forberedelse
      1. Lag en tidskurs på 4 timer, 12 timer, 24 timer, 48 timer og 72 timer for det første eksperimentet for å bestemme kinetikken for invasjon i gelen i henhold til celletypen. For hvert forsøk legger du til et tidspunkt på 1 time som referansetidspunkt når ingen invasjon oppstår.
      2. Klargjør kollagen I-løsningen på is under en steril laminarstrømshett. Forbered 500 μL løsning for 3 Boyden kammerinnlegg.
      3. Aspirer 1 mg kommersielt rotterhale kollagen I for å fremstille en løsning med en sluttkonsentrasjon på 2 mg / ml kollagen I.
      4. Tilsett 5-karboksy x rhodaminsuccinimidylester vedEn sluttkonsentrasjon på 1 μg / mL beregnet for sluttvolumet av kollagen I-løsning (i dette tilfellet 500 μl).
      5. Bland godt og inkuber i 5 minutter på is under den sterile laminarstrømshetten, beskyttet mot lys.
      6. Tilsett 50 μl iskald, filtrert 10X PBS og 6,25 μL iskald 1 M natriumhydroksyd (NaOH).
      7. Tilsett sterilt vann i henhold til formelen 443,75 - x ul kollagen I.
      8. Tilsett 100 μL oppløsning per Boyden kammerinnsats.
      9. Inkuber i 1 time ved 37 ° C for å tillate polymerisering.
      10. Tilsett cellekulturmedium beriket med føtalt bovint serum (FBS) i nye brønner; Sett innsatsene i disse brønnene.
      11. Seed 30.000 celler på toppen av kollagenet Jeg plugger i FBS-fri medium.
      12. Etter dyrking av cellene ved 37 ° C, fikseres kollagen I-pluggen i 30 minutter i 4% paraformaldehyd i 1x PBS.
      13. Fullstendig immunfluorescens som i trinn 3, med unntak av følgende trinn: permeabiliZe med 0,2% Triton X-100 i 1x PBS i 30 minutter, ikke 10 minutter; Inkuber med primære og sekundære antistoffløsninger i henholdsvis 1,5 timer hver, i stedet for 40 min og 30 min. Flekk for F-aktin eller kjerner for å lokalisere cellene.
      14. Etter immunfluorescens, bruk en skalpell til å kutte rundt innsiden av membranen og forsiktig overføre kollagen-pluggen til en glassbunnsrett. Pass på at toppen av kollagenet jeg plugger er i kontakt med glasset. Hold innsatsen membran festet til bunnen av kollagen I pluggen for å opprettholde stikkets integritet.
        MERK: Kollagen-pluggen forblir intakt i glassbunnretten. Dybden mellom glassbunnen og plasten som omgir glassbunnen, tilsvarer tykkelsen på pluggene.
      15. Plasser en deksel på kollagenet jeg plugger og fest med polymeriserende monteringsmedium for å forhindre at pluggen tørker ut.
      16. Bruk et invertert konfokalmikroskop til å bilde kollagenet jeg plugger; Toppen avPluggen er i kontakt med glassbunnen av fatet.
        1. Skaff en z-stack fra toppen til bunnen av kollagenet jeg plugger for å visualisere celleinvasion. Bestem tykkelsen på z-stacken ved å undersøke hvor dypt cellene inntrer bildefeltet. Utfør oppkjøp med et 40X oljemål i et 512 x 512-format med en z-trinns størrelse på 0,25 μm.
          MERK: For referanse er den gjennomsnittlige z-stabelen for MDA-MB-231-celler 3 dager etter sådd 30 μm.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Ved å bruke en kombinasjon av to typer matriser, gelatin og type I kollagen ( Figur 1 og 4 ), har vi fremhevet en ny type invadosom, kjent som lineære invadosomer. Merkingen av disse matrices muliggjør observasjon av lineær invadosomdannelse langs kollagen I-fibre og deres nedbrytningskapasiteter ( figur 5 ). Antallet invasive strukturer kan deretter kvantifiseres av makroen beskrevet tidligere (trinn 4.2), og nedbrytningsaktiviteten kan også bestemmes ved hjelp av ImageJ-programvaren, som beskrevet av Martin et al. Og Diaz et al. 9 , 10 . Den blandede matrisen tillater karakterisering av lineære invadosomer ved å definere DDR1 som reseptor som er nødvendig for lineær invadosomdannelse og funksjonalitet ( Figur 6 ).

    figur 3 og 7 ). Denne analysen tillater oss å bestemme antall celler som har invadert i kollagen-pluggen, så vel som avstanden som er reist, ved hjelp av z-stack-rekonstruksjoner.

    Figur 4
    Figur 4: Sammenligning av gelatin og gelatinekollagen I blandede matriser ved bruk av konfokal mikroskopi. Skjematisk representasjon som viser organisasjonen av fluorescerende gelatineklips på toppanelet. ( A ) Confocal z-stack rekonstruksjon demonstrerer at den fluorescerende gelatin matrisen danner et tynt, jevnt lag som dekker hele overflaten av dekselet. ( B ) I den blandede matrisen, etter avsetning av fluorescerende gelatin på dekselglassene, skrives type I kollagenfibrillerPolymeriserer på toppen. Kollagenet jeg fibriller er farget i rødt. Kollagen I-matrisen er tykk og heterogen på dekselet. Fordelingen av kollagen I-fibrene er avhengig av polymerisasjonen av kollagen I a-kjeder. Skalbjelke = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

    Figur 5
    Figur 5: Virkning av gelatin og gelatinekollagen I matriser på invadosomdannelse og aktivitet. Cellene som brukes for disse analysene, er MDA-MB-231 brystkreftceller. ( A ) En skjematisk fremstilling viser celler sådd på en fluorescerende gelatine deksel på toppanelet. Nedbrytningsområder visualiseres i svart på grunn av reduksjon av fluorescens. Tks5-farging ble brukt som en invadosomarkør. På gelatin, invAdosomer som form er organisert som prikker. ( B ) En skjematisk fremstilling viser celler sådd på en blandet matriks av gelatin og kollagen I. Kollagen I er merket i rødt; Tilsetningen av type I kollagenfibriller øker cellens evne til å nedbryte gelatin. Interessant er den invadosome markøren Tks5 omorganisert, og punktene erstattes av lineære strukturer som representerer lineære invadosomer. Nedbrytningsområder visualiseres i svart på grunn av reduksjon av fluorescens. Skalbjelke = 5 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

    Figur 6
    Figur 6: Konfokal mikroskopi analyse av molekylær sammensetning og organisering av invadosomer i både gelatine og blandede matriksforhold. ( A ) I gElatin tilstand, invadosomer er organisert i prikker, og F-aktin (rød) samlokaliseres med Tks5 (grønt, bunnpanel), men ikke med DDR1 (grønt, topppanel). Dette er klassiske invadosomer. Skalestenger = 5 μm. ( B ) I gelatinekollagenet, blandet matriksbetingelse, kolokaliseres DDR1 (grønt, toppanel) med kollagen I-fibriller (rødt, toppanel), Tks5 (grønt, bunnpanel) og F-aktin panel). Type I kollagenfibriller induserer dannelsen av lineære invadosomer. Skalestenger = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

    Figur 7
    Figur 7: Cell-invasjonsanalyse av MDA-MB-231-celler i et kollagen-I-plugg. 1 time etter sådd av cellene er kontrollinnsatsene fikset og farget. ( A ) z-stack aOppsummering av kollagenet I pluggen utføres ved bruk av konfokal mikroskopi. Cellene invaderer ikke kollagenet jeg plugger på dette tidspunktet; Heller, de forblir på toppen av kollagenet jeg plugger. Dermed brukes dette som kontrolltidspunktet når ingen invasjon oppstår. MMP-aktivering er nødvendig for at cellene kan invadere en kollagen I-pluggen ved denne tettheten. ( B ) Tre dager etter sådd, invaderer noen celler kollagenet jeg plugger. Denne analysen tillater observasjon og kvantifisering av celleinvasion. I tillegg kan det brukes til å studere virkningen av ulike stoffer eller siRNAer, for eksempel. Skalbjelke = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Klassisk undersøkes invadosomer in vitro uten hensyn til mikromiljøet og matrisen som cellene er plettert på. Flere typer matriser brukes for tiden, inkludert gelatin, fibronektin, vitronektin eller høytetthetsfibrillerkollagen (HDFC) 7 , 11 ; Imidlertid er disse ofte ikke representative for mikromiljøet der celler ligger og ikke er fysiologisk relevante. Her ble en ny type matriks, som består av en sammenheng mellom kollagen av gelatin og fibrillar type I, brukt. Bruken av type I kollagenfibriller gjør det mulig å markere en ny klasse invadosomer, kjent som lineære invadosomer, som spesifikt danner på kollagen I i sin fysiologiske arkitektur 7 . Merking av kollagen Jeg tillater oss å observere lineære invadosomer langs fibrene og for å kvantifisere dannelsen ved hjelp av cellulære markører som Tks5 og cortactin. Bruke miXed-matrisen, har vi identifisert en ny reseptor, discoidin-domene-reseptoren 1 (DDR1), involvert i dannelsen av lineære invadosomer 8 .

    Den 2D blandede matrisen tillater oss å kvantifisere matrisedbrytningsaktiviteten til lineære invadosomer via zymografi in situ- analysen. Denne analysen rapporterer proteolysevirkningen av MMPs ved å analysere tilstedeværelsen av sorte hull i det fluorescerende gelatinelag. Interessant øker organisasjonen av F-aktin til lineære invadosomer matriksdegradasjonsaktiviteten sammenlignet med bare gelatin 7 . En begrensning av denne analysen er at gelatinen er en ikke-fysiologisk matrise, og det har blitt påvist at en mer fysiologisk matrise endrer den cellulære responsen på mikromiljøet. En ytterligere begrensning eksisterer i måten hvor MMP-aktivitet kvantiseres på gelatinekollagen I-blandede matriser. Bare gelatinedbrytingen som lokaliseres under kollagen I fiBril lag kan kvantifiseres; Derfor er dette en indirekte metode for å kvantifisere kollagenmatriksdegradering. En alternativ metode for å visualisere nedbrytningsaktiviteten av lineære invadosomer er å merke kollagen I-fibre med et spesifikt antistoff mot kollagenklyvningssteder (Col1-3 /4 C, immunoglobulin). Dette muliggjør visualisering av kløvede fibre ved immunfluorescens. På grunn av cellemigrasjon er dette antistoffet imidlertid ikke veldig spesifikt i 2D for nedbrytning på grunn av lineær invadosomdannelse. En annen måte å visualisere og kvantifisere nedbrytningsaktiviteten til kollagen I-fibrene er å bruke multiphotonmikroskopi og andre harmoniske generasjon 8 . Denne metoden muliggjør avbildning av kollagenfibre uten farging.

    Vår metode for polymerisering av type I kollagen er forskjellig sammenlignet med andre metoder som brukes i litteraturen 12 , 13 . For eksempel, Artym

    For å studere involvering av lineære invadosomer i celleinvasion ble 3D-kollagen-pluggen-analysen brukt. 3D-kollagen-pluggen er allerede brukt av det vitenskapelige samfunn for å studere invasive strukturer eller involvering av metalloproteinaser i invasjonsprosessen 14 , 15 , 16 . Disse typer 3D-matriser har begrensninger angående disseR stivhet - for eksempel er 3D kollagen I pluggen mindre stiv enn 2D matrisen. Videre er typen og opprinnelsen til kollagenet I også viktig med hensyn til den forskjellige organisasjonen av kollagenfibre in vivo 17 . Til slutt, med hensyn til mikromiljøsammensetningen in vivo , var bare ett element av den ekstracellulære matriksen, type I-kollagenet, fokusert på. Videre studier er nødvendig for å bestemme relevansen av lineære invadosomer in vivo .

    I tillegg til studien av lineære invadosomer kan den blandede matriksen som er beskrevet her, brukes med andre typer matriksbestanddeler, så som fibronektin, vitronektin og andre typer kollagener ( f.eks. Type IV kollagen). Denne protokollen kan tilpasses, avhengig av hvilke typer matrikselementer som er av interesse, og prosessene som skal studeres. Det er imidlertid klart at generering av komplekse og fysiologiske matriser vil tillate identifisering av neW veier involvert i celleadhesjon, migrasjon og invasjon.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne har ingenting å avsløre.

    Acknowledgments

    JDM ble støttet av et PhD-fellesskap fra INSERM / Région Aquitaine, og støttes nå av et postdoktoralt ARC-fellesskap og Tisch Cancer Institute ved Mount Sinai School of Medicine. EH støttes av en PhD fra Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. ZE støttes av et postdoktoralt fellesskap fra Agence Nationale de la Recherche (ANR). CM støttes av Tisch Cancer Institute ved Mount Sinai School of Medicine og JJBC støttes av NIH / NCI-stipend K22CA196750, TCI Young Scientist Cancer Research Award JJR Fond, og Tisch Cancer Institute ved Mount Sinai School of Medicine. Dette arbeidet ble støttet av et tilskud fra ANR-13-JJC-JSV1-0005. FS støttes av "Ligue nationale contre le cancer". VM og FS støttes av finansiering fra "Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016" og Institut National du Cancer, INCA_8036 og PLBio2012.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Gelatin solution Sigma G1393 Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml
    Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate Molecular probe life technologies G13186 5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water
    Microscope cover glasses Marlenfeld GmbH & Co 111520 Ø12mm No.1
    2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4 Electron microscopy science 15960 Dilute at 0.5 % in sterile water
    1x PBS pH 7.4 Gibco by life technologies 10010-015 Use this PBS in all steps before fixation
    Collagen I Rat tail Corning 354236
    5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester Life technologies C-6125
    DPBS 1x + calcium + magnesium Gibco by life technologies 14040-091
    Paraformaldehyde 16% solution Electron microscopy science 15710 Dilute at 4% in 1X PBS
    Triton X 100 Sigma T9284
    10x PBS buffer pH 7.4 Ambion AM9625 Dilute at 1X in water Use in steps after fixation
    Tks5 antibody Santa Cruz sc-30122 Invadosome markers Dilution : 1/100
    Cortactin 4F11 antibody Millipore 5180 Invadosome markers Dilution :1/100
    DDR1 antibody Cell signaling 5583 Linear invadosome receptor
    Dilution :1/100
    Phalloidin FluoProbes Interchim FT-AZ0330 Fibrillary actin marker Dilution :1/200
    Hoechst Sigma 33258 Nucleus marker Dilution :1/200
    Secondary antibodies FluoProbes Interchim FP-488 FP-547H or FP-647H
    Albumin from bovine serum Sigma A2153 Dilute at 4% in 1X PBS
    Fluoromount G mounting medium Interchim FP 483331
    ImageJ software Public domain http://www.macbiophotonics.ca/imagej/
    Cell culture insert Corning 353097 8.0µm pore size / 24 wells
    Sodium hydroxide (NaOH) Sigma 221465

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-54 (2003).
    2. Gilkes, D. M., et al. Collagen prolyl hydroxylases are essential for breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 3285-3296 (2013).
    3. Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 185-211 (2011).
    4. Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
    5. Di Martino, J., et al. Cdc42 and Tks5: a minimal and universal molecular signature for functional invadosomes. Cell Adh. Migr. 8, 280-292 (2014).
    6. Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. J. Cell Sci. 122, 3015-3024 (2009).
    7. Juin, A., et al. Physiological type I collagen organization induces the formation of a novel class of linear invadosomes. Mol. Biol. Cell. 23, 297-309 (2012).
    8. Juin, A., et al. Discoidin domain receptor 1 controls linear invadosome formation via a Cdc42-Tuba pathway. J. Cell Biol. 207, 517-533 (2014).
    9. Martin, K. H., et al. Quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts. J. Vis. Exp. , e4119 (2012).
    10. Diaz, B. Invadopodia detection and gelatin degradation assay. Bio-protocol. 3, 1-8 (2013).
    11. Artym, V. V., et al. Dense fibrillar collagen is a potent inducer of invadopodia via a specific signaling network. J. Cell Biol. 208, 331-350 (2015).
    12. Schachtner, H., et al. Megakaryocytes assemble podosomes that degrade matrix and protrude through basement membrane. Blood. 121, 2542-2552 (2013).
    13. Schoumacher, M., Glentis, A., Gurchenkov, V. V., Vignjevic, D. M. Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay. Methods Mol. Biol. 1046, 133-144 (2013).
    14. Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 102, 3262-3269 (2003).
    15. Geraldo, S., et al. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo? Eur. J. Cell Biol. 91, 930-937 (2012).
    16. Monteiro, P., et al. Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia. J. Cell Biol. 203, 1063-1079 (2013).
    17. Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).

    Tags

    Bioengineering utgave 124 Lineær invadosom ekstracellulær matrise nedbrytningsaktivitet kollagen I 3D invasjon
    2D- og 3D-matriser for å studere lineær invadosomdannelse og aktivitet
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Di Martino, J., Henriet, E.,… More

    Di Martino, J., Henriet, E., Ezzoukhry, Z., Mondal, C., Bravo-Cordero, J. J., Moreau, V., Saltel, F. 2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity. J. Vis. Exp. (124), e54911, doi:10.3791/54911 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter