Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية إعداد مصفوفة مختلطة 2D، تتكون من الجيلاتين والكولاجين الأول، وكولاجين 3D أنا سد لدراسة إنفادوسوم الخطي. هذه البروتوكولات تسمح لدراسة تشكيل إنفادوزوم الخطي، نشاط تدهور مصفوفة، وقدرات الغزو من الخلايا الأولية وخطوط الخلايا السرطانية.
Abstract
وتشارك التصاق الخلايا، والهجرة، والغزو في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية. على سبيل المثال، أثناء تشكيل ورم خبيث، الخلايا السرطانية يجب أن عبور الحواجز التشريحية لغزو والهجرة من خلال الأنسجة المحيطة بها من أجل الوصول إلى الدم أو الأوعية اللمفاوية. وهذا يتطلب التفاعل بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلية (إسم). على المستوى الخلوي، العديد من الخلايا، بما في ذلك غالبية الخلايا السرطانية، هي قادرة على تشكيل إنفادوسوميس، وهي الهياكل القائمة على أكتين F قادرة على تدهور إسم. إنفادوسوم هي هياكل أكتين بارزة التي تجنيد وتنشيط مصفوفة ميتالوبروتيناسيس (مبس). التركيب الجزيئي، والكثافة، والتنظيم، وصلابة من إسم هي حاسمة في تنظيم تشكيل إنفادوسوم وتنشيط. في المختبر ، مقايسة الجيلاتين هو مقايسة القياسية المستخدمة لمراقبة وكمية النشاط إنفادوسوم تدهور. ومع ذلك، الجيلاتين، وهو الكولاجين التشويه والتحريف أنا، ليست مصفوفة الفسيولوجية هlement. تم تطوير مقايسة رواية باستخدام الألياف I نوع الكولاجين وتستخدم لإثبات أن هذه المصفوفة الفسيولوجية هو محفز قوي من إنفادوسوميس. إنفادوسومات التي تشكل على طول ألياف الكولاجين تعرف باسم إنفادوسوم الخطي بسبب تنظيمها الخطي على الألياف. وعلاوة على ذلك، أظهر التحليل الجزيئي من إنفادوسوم الخطي أن مستقبلات ديسيدين المجال 1 (DDR1) هو مستقبلات تشارك في تشكيلها. هذه البيانات تظهر بوضوح أهمية استخدام مصفوفة ذات صلة فسيولوجيا من أجل فهم التفاعلات المعقدة بين الخلايا و إسم.
Introduction
المصفوفة خارج الخلية (إسم) إعادة عرض يحدث خلال العمليات الفسيولوجية والمرضية، مثل الأوعية الدموية وغزو الخلايا السرطانية. في الحالات الفسيولوجية، وأنواع كثيرة من الخلايا، ومعظمهم من الأنساب المكونة للدم، قادرون على تحلل عناصر إسم. على سبيل المثال، الضامة قادرة على عبور الحواجز التشريحية للوصول إلى الأنسجة، والخلايا تتحلل مصفوفة العظام لضمان التوازن الكالسيوم. أكثر عالميا، جميع المصفوفات في الجسم تجديد للحفاظ على الخصائص الفيزيائية والكيميائية. في أنسجة السرطان، يتم تغيير تكوين المكروية الورم. على سبيل المثال، في سرطان الثدي والرئة، نوع I الكولاجين هو أوفيركسريسد ويتراكم حول الورم. وعلاوة على ذلك، ويرتبط هذا تراكم مع زيادة خطر الإصابة الانبثاث 1 ، 2 . السرطان الانبثاث يعتمد على قدرة الخلايا السرطانية على تحلل إسم والغزو الأنسجة المجاورة.
الينسب النشاط الغازية للخلايا إلى الهياكل الغنية أكتين المتخصصة المعروفة باسم إنفادوسوميس. هذا المصطلح يشمل بودوسوميس و إنفادوبوديا، التي توجد على التوالي، في الخلايا العادية والسرطانية (على سبيل المثال، الضامة، الخلايا البطانية، والخلايا السرطانية مثل مدا-مب-231 سرطان الثدي خط الخلايا). في المختبر ، إنفادوسوم يمكن تنظيمها في أشكال مختلفة: النقاط، المجاميع، أو وريدات 3 . بشكل كلاسيكي، إنفادوسوم تتكون من F- أكتين الأساسية التي تحتوي على العديد من البروتينات، مثل بروتين سقالة Tks5 والكورتاكتين، وتحيط بها جزيئات اللصق التصاق، مثل إنتغرينز والفينكولين 4 . في الآونة الأخيرة، تبين أن Tks5 و روغتباس Cdc42 يمكن أن تستخدم كحد أدنى التوقيع الجزيئي ل إنفادوسوميس وظيفية 5 . هذه الهياكل هي قادرة على تحلل إسم عن طريق توظيف وتفعيل البروتينات ميتالوبروتيس محددة، مثل MT1-مب و مب-2 6. في دراسة سابقة، ذكرنا أن التفاعل بين ألياف الكولاجين من النوع الأول ومستقبل المجال ديسكويدين 1 (DDR1)، مستقبلات محددة من ألياف الكولاجين من النوع الأول، يؤدي إلى تشكيل فئة جديدة من إنفادوسوميس، يدعى إنفادوسوم الخطي. يتم تشكيل إنفادوسوم الخطي على طول نوع I الألياف الكولاجين 7 . هذه الهياكل هي قادرة على تحلل نوع I الألياف الكولاجين عن طريق التوظيف وتفعيل MT1-مب / MMP2. وعلاوة على ذلك، وتشكيلها يعتمد على Tks5 و Cdc42 5 . في المختبر ، أثبتنا وجود إنفادوسوم الخطي وإشراك DDR1 في تشكيلها والنشاط 8 باستخدام استراتيجيات مختلفة تتكون من مزيج من مختلف عناصر المصفوفة، بما في ذلك: ط) كوفرسليبس المغلفة بالجيلاتين الفلورسنت، إي) نوع الفلورسنت أنا الكولاجين الليفي كوفرسليبس -cated، و 3) 3D نوع I المقابس الكولاجين. نظرا لاستخدام مصفوفات مختلفة، كنا قادرين على دراسة والطابعإيز تشكيل إنفادوزوم الخطي ونشاط تدهورها 7 ، 8 .
وأخيرا، لفهم أفضل لبيولوجيا الخلايا الغازية، تم استخدام مزيج من مكونات إسم في كل من أنظمة الثقافة 2D و 3D، محاكاة تعقيد تكوين المكروية الورم. وفيما يلي بروتوكولات لطلاء كوفرسليبس مع الجيلاتين / نوع I الكولاجين في 2D و 3D نظم الثقافة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: قبل التثبيت، يتم الانتهاء من جميع الخطوات في غطاء تدفق الصفحي العقيمة.
1. 2D مصفوفة
ملاحظة: وتستخدم المصفوفات 2D لتحديد النسبة المئوية للخلايا تشكيل إنفادوسومس ومنطقة تحلل المصفوفة في الخلية.
الشكل 1: البروتوكول. ملخص البروتوكول المستخدمة لإعداد الجيلاتين والكولاجين أنا المصفوفات. فمن الممكن لجعل مصفوفة الجيلاتين فقط أو الجيلاتين والكولاجين أنا مختلطة المصفوفة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- مصفوفة الجيلاتين
ملاحظة: وتستخدم مصفوفات الجيلاتين الفلورسنت لتحديد تدهور المصفوفة، ويستخدم غير الفلورسنت الجيلاتين لتعزيز التصاق ألياف الكولاجين I. حصيرة الجيلاتين الفلورسنتوتستخدم أيضا الأرز ل بودوسوم ودراسات إنفادوبوديا (انظر الشكل 1 ).- تحت غطاء تدفق الصفحي العقيمة، ضع قطعة من بارافيلم (20 سم × 15 سم) على منطقة العمل وتطهيره مع الايثانول 70٪.
- قسامة 20 قطرات ميكرولتر من 1 ملغ / مل الجيلاتين في خط، متباعد حوالي 1 سم بعيدا؛ راجع الشكل 1 لتنظيم الحبرية.
- تغطية كل 20 ميكرولتر الجيلاتين قطرة مع ساترة الزجاج تعقيمها (12 ملم في القطر).
- احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إذا كان الجيلاتين الفلورسنت، حمايته من الضوء.
- قسامة 40 قطرات ميكرولتر من 0.5٪ غلوتارالدهيد في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (بس) في خط، كل متباعدة حوالي 1 سم تحت خط كوفرسليبس من الخطوة 1.1.3.
تنبيه: غلوتارالدهيد هو عامل تثبيتي سامة. استخدم القفازات ولا تستنشق. - باستخدام ملقط مرصع بالجواهر، ونقل كل ساترة الجيلاتين المغلفة إلى قطرة غلوتارالدهيد.
ملاحظة ذلكمن الطبيعي أن قطرة الجيلاتين الصغيرة لا تزال على بارافيلم. لا تعيد استخدام هذا لتجربة أخرى. - احتضان لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ل كوفرسليبس الفلورسنت، حمايتها من الضوء.
- خذ 24-جيدا لوحة زراعة الخلايا وملء كل بئر مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة 1X. وضع كوفرسليبس، الجانب الجيلاتين تصل، في كل بئر.
- غسل مرتين في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق لكل منهما.
ملاحظة: في هذه الخطوة، كوفرسليبس يمكن استخدامها للتجريب أو المخزنة في برنامج تلفزيوني 1X في 4 درجات مئوية. غير-- الفلورسنت كوفرسليبس يمكن تخزينها لمدة أسبوع واحد، ويمكن تخزين كوفرسليبس الفلورسنت لمدة 48 ساعة.
- فيبريلار نوع الكولاجين أنا مصفوفة
ملاحظة: يستخدم نوع الكولاجين فيبريلار I مصفوفة لدراسة تشكيل إنفادوسوم الخطي وتدهور المصفوفة المرتبطة بها. يتم استخدام مزيج من الكولاجين الفلورسنت الأول وغير الفلورسنت الجيلاتين كوفرسليبس ل كولوكاليز علامات إنفادوسوم مع ألياف الكولاجين (على سبيل المثال، F- أكتين طn القناة الحمراء الحمراء، الكولاجين I في القناة الحمراء، Tks5 في القناة الخضراء، وصبغ هويشت لصمة نووية). من ناحية أخرى، ويستخدم مزيج من غير الفلورسنت الكولاجين أنا مع غير الفلورسنت الجيلاتين كوفرسليبس لتعظيم عدد علامات إنفادوسوم ملطخة (على سبيل المثال، F- أكتين في القناة الحمراء الحمراء، كورتاكتين في القناة الحمراء، Tks5 في والقناة الخضراء، وصبغ هويشت لصمة نووية). وأخيرا، يتم استخدام مزيج من الكولاجين غير الفلورسنت I مع كوفرسليبس الجيلاتين الفلورسنت لتحديد الانحراف المرتبط بالجيلاتين (على سبيل المثال، F- أكتين في القناة الحمراء الحمراء، Tks5 في القناة الحمراء، في القناة الخضراء، وصبغ هويشت للحصول على وصمة نووية) (انظر الشكل 1). يستخدم صبغ هويشت لصمة عار النواة، وأنه يتحقق أيضا للتلوث الميكوبلازما، بالإضافة إلى اختبار ير القيام به بانتظام على خطوط الخلايا المستخدمة.- الكولاجين الفلورسنت I
- استخدام الكولاجين التجاري أنا المستخرجة من وتر ذيل الفئران في 0.02 N أسي الخليكد. سحب كمية الكولاجين أنا ضروري لإعداد 500 ميكرولتر من محلول ساترة في تركيز النهائي من 0.4 ملغ / مل من الكولاجين أولا.
- إضافة 5 كاربوكسي x استرامين سوتشينيميديل استر في تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل، وتحسب للحجم النهائي من حل الكولاجين الأول (نكس 500 ميكرولتر).
- مزيج من الحل عن طريق بيبتينغ صعودا وهبوطا واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.
- تمييع إلى الحجم النهائي مع 1X دولبيكو الفوسفات مخزنة المالحة (دبس) التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم، واستخدامها مباشرة.
- فيبريلار الكولاجين أنا ساترة
- استخدام غير الفلورسنت أو الفلورسنت الجيلاتين كوفرسليبس أعدت سابقا في الخطوة 1.1.
- إعداد محلول من الفلورسنت أو غير الفلورسنت الكولاجين أنا في تركيز النهائي من 0.4 ملغ / مل في دبس 1X تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم.
- إضافة 500 ميكرولتر من الفلورسنت أو غير الفلورسنت الكولاجين I حل لكلساترة في 24-جيدا لوحة زراعة الخلايا.
- احتضان لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية للكولاجين الأول البلمرة.
- بعد الحضانة، وإزالة الكولاجين الزائد أنا عن طريق إمالة لوحة و بيبتينغ على جانب البئر (وليس مباشرة على ساترة) لتجنب إتلاف المصفوفة.
ملاحظة: لا يمكن تخزين هذه المصفوفة. البذور الخلايا مباشرة بعد إزالة الكولاجين الزائدة I.
- الكولاجين الفلورسنت I
2. خلية البذر، وقت الثقافة، والتثبيت
- اعتمادا على نوع الخلية، وإعداد الخلايا في وسط الثقافة المناسبة وإضافة خلايا لحجم النهائي من 500 ميكرولتر لكل بئر.
- لتوصيف قدرة خط الخلية لتشكيل إنفادوسوم الخطي وتحلل المصفوفة، لوحة الخلايا لمدة 4 ساعات و 12 ساعة و 24 ساعة على الكولاجين أنا مصفوفة لتحديد حركية تشكيل إنفادوسوم الخطي ونشاط تدهور المرتبطة بها.
ملاحظة: يحتوي الجدول 1 على أمثلة لخطوط الخلايااختبارها في المختبر.
الجدول 1: زرع الخلايا ووقت الحضانة المرجعية. يعرض هذا الجدول قائمة غير شاملة من خطوط الخلايا المستخدمة لدراسة إنفادوسوم الخطي. وهو يشير إلى عدد الخلايا للبذور على المصفوفة، والوقت اللازم لمراقبة إنفادوسوم الخطي، والوقت اللازم لمراقبة تدهور المصفوفة المرتبطة بها. إنفادوسوم الخطي لها عمر قصير. لتكون قادرة على مراقبة إنفادوسوم الخطي في الحد الأقصى لعدد الخلايا، يجب أن تكون الخلايا في اتصال مع مصفوفة الكولاجين أنا لفترة قصيرة من الزمن. من ناحية أخرى، لتكون قادرة على تصور تدهور الجيلاتين ذكرت، يجب أن تكون الخلايا في اتصال مع مصفوفة الكولاجين أنا لفترة أطول من الوقت من تلك المذكورة أعلاه.خط الخلية عدد الخلايا لكل ساترة وقت الاتصال مع مصفوفة للخطي إنفادوسوم الكمي وقت الاتصال مع مصفوفة لقياس الكمي من انحطاط إنفادوسوم الخطي مدا مب 231 40000 4 ح 12 ح HUH7 40000 12 ح 24 ساعة هيب 3B 40000 12 ح 24 ساعة سنو 398 40000 12 ح 24 ساعة نيه 3T3 سرك 30000 4 ح 12 ح A431 50000 6 ح 24 ساعة A549 40000 12 ح 24 ساعة &# 160؛ الخام 40000 12 ح 12 ح PAE 40000 12 ح 12 ح - بعد إزالة وسط زراعة الخلايا،إصلاح كوفرسليبس لمدة 10 دقيقة في 500 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني 1X.
- غسل مرتين مع برنامج تلفزيوني 1X.
- تخزين في 4 درجات مئوية، محمية من الضوء.
3. المناعي
- بيرمابيليز الخلايا لمدة 10 دقيقة مع حل الطازجة من 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 1X. لا تقم بإعادة استخدام هذا الحل.
- غسل كوفرسليبس مرتين مع برنامج تلفزيوني 1X.
- وضع قطعة من بارافيلم (20 سم × 15 سم) على مقاعد البدلاء.
- تمييع الأجسام المضادة الأولية في 4٪ ألبومين المصل البقري (بسا) في برنامج تلفزيوني 1X، كما هو موضح في جدول المواد .
- قسامة 50 قطرات ميكرولتر من حل الأجسام المضادة الأولية في خط، كل متباعدة حوالي 1 سم بعيدا.
- وضع كل ساترة على قطرة.
- احتضان لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.
- بعد فترة الحضانة، وغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني 1X.
- تمييع الأجسام المضادة الثانوية، فالويدين، وصبغ هويشت في 4٪ بسا في 1XPBS.
- قسامة 50 قطرات ميكرولتر من المزيج، كل متباعدة حوالي 1 سم تحت السطر الأول من كوفرسليبس، كما فعلت سابقا.
- وضع كل ساترة على قطرة.
- احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.
- بعد الحضانة، وغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني 1X.
- اغسل مرة واحدة بالماء المقطر لإزالة الأملاح.
- جبل كوفرسليبس على شريحة زجاجية مع البلمرة تصاعد المتوسطة.
- السماح كوفرسليبس الجافة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء، قبل المجهري.
4. الكميات
الشكل 2: الخطي إنفادوسوم الكمي. الماكرو يتطلب الصور متحد البؤر F- أكتين و Tks5 تلطيخ (الشكل: 1،024 × 1،024). ( A ) أولا، افتح الصورة F- أكتين وجعل قناع. ( B ) ثم، فتحصورة Tks5 وعتبة ذلك. تطبيق الماكرو. ( C ) ستظهر نتائج تحليل في جدولين. عدد إنفادوسوم الخطية في الخلية وغيرها من المعلومات، مثل النسبة المئوية للمنطقة المستخدمة من قبل إنفادوسوم الخطي في الخلية، سيكون في جدول ملخص. سيكون حجم كل إنفادوسوم الخطي في جدول النتائج. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- النسبة المئوية للخلايا التي تشكل إنفادوسوم الخطية
- عد الخلايا التي تشكل إنفادوسوم الخطية، ما يقرب من 100 خلية لكل ساترة (استخدام تريبليكاتس التقنية). تحديد ما لا يقل عن 300 خلية لكل n، مع n = 3.
- حساب النسبة المئوية للخلايا التي تشكل إنفادوسوم الخطية من خلال اتخاذ متوسط ثلاث تجارب مستقلة، مما أدى إلى 900 الخلايا كميا.
- الخطي إنفادوسوم حجم ورقم لكل خلية
- استخدام إيماجيج مع الماكرو التكميلي.
- استخدام كوفرسليبس ثلاثة في حالة.
- تأخذ 30 صورة في ساترة من الجيلاتين الفلورسنت ونوى هويست الملطخة.
- استخدام برنامج إيماجيج كما هو موضح في مارتن خ وآخرون. 9 -
5. 3D الغزو الكولاجين الفحص
الشكل 3: مخطط فحص الغزو. ملخص لبروتوكول الفحص الغزو. الكولاجين الأول هو عبر ربط مع سوتسينيميديل استر صبغ وبلمرة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. يتم إضافة الخلايا في وسط خالية من المصل على رأس الكولاجين أنا سد العجز. يتم وضع إدراج في واي المتوسطةث 10٪ فبس. يتم إصلاح الكولاجين أنا المقابس 1 ساعة بعد زرع الخلايا في السيطرة و 3 أيام بعد زرع الخلايا في حالة تجريبية لتحديد قدرة الغزو من الخلايا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- الكولاجين أنا المكونات الإعداد
- جعل دورة الوقت من 4 ساعة، 12 ساعة، 24 ساعة، 48 ساعة، و 72 ساعة لأول تجربة لتحديد حركية الغزو في هلام وفقا لنوع الخلية. لكل تجربة، إضافة نقطة زمنية 1 ساعة كنقطة زمنية مرجعية عند حدوث أي غزو.
- إعداد الحل I الكولاجين على الجليد تحت غطاء محرك السيارة تدفق العقيمة الصفحي. إعداد 500 ميكرولتر من الحل ل 3 إدراج غرفة بويدن.
- نضح 1 ملغ من الكولاجين الفئران الذيل التجاري الأول لإعداد حل مع تركيز النهائي من 2 ملغ / مل الكولاجين أولا.
- إضافة 5 كاربوكسي x رودامين سوتشينيميديل استر فيتركيز النهائي من 1 ميكروغرام / مل، وتحسب للحجم النهائي من حل الكولاجين الأول (في هذه الحالة، 500 ميكرولتر).
- تخلط جيدا واحتضان لمدة 5 دقائق على الجليد تحت غطاء تدفق الصفحي العقيمة، محمية من الضوء.
- إضافة 50 ميكرولتر من الجليد الباردة، وتصفية 10X بس و 6.25 ميكرولتر من الجليد الباردة 1 M هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم).
- إضافة الماء المعقم وفقا لصيغة 443.75 - × ميكرولتر من الكولاجين أولا.
- إضافة 100 ميكرولتر من الحل لكل غرفة بويدن إدراج.
- احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية للسماح للبلمرة.
- إضافة المتوسطة ثقافة الخلية المخصب مع مصل الأبقار الجنين (فبس) في آبار جديدة؛ مكان إدراج في هذه الآبار.
- البذور 30000 الخلايا على رأس الكولاجين أنا سد العجز في وسط فبس خالية.
- بعد زراعة الخلايا في 37 درجة مئوية، وإصلاح الكولاجين أنا سد لمدة 30 دقيقة في بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني 1X.
- المناعي كاملة كما في الخطوة 3، باستثناء الخطوات التالية: بيرمابيليزي مع 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 30 دقيقة، وليس 10 دقيقة. احتضان مع حلول الأجسام المضادة الأولية والثانوية لمدة 1.5 ساعة لكل منهما، بدلا من 40 دقيقة و 30 دقيقة، على التوالي. وصمة عار ل F- أكتين أو نوى لتوطين الخلايا.
- بعد المناعي، واستخدام مشرط لقطع حول غشاء إدراج ونقل بعناية الكولاجين أنا سد العجز إلى طبق قاع الزجاج. تأكد من أن الجزء العلوي من الكولاجين أنا المكونات على اتصال مع الزجاج. إبقاء غشاء إدراج تعلق على الجزء السفلي من الكولاجين أنا سد من أجل الحفاظ على سلامة المكونات.
ملاحظة: الكولاجين أنا المكونات لا تزال سليمة في طبق القاع الزجاجي. عمق بين أسفل الزجاج والبلاستيك المحيطة أسفل الزجاج ما يعادل سمك المكونات. - وضع ساترة على الكولاجين أنا المكونات وجبل مع البلمرة تصاعد المتوسطة لمنع المكونات من الجفاف.
- استخدام المجهر متحد البؤر مقلوب لصورة الكولاجين أنا سد العجز. الجزء العلوي منالمكونات هو في اتصال مع أسفل الزجاج من الطبق.
- الحصول على كومة ض من أعلى إلى أسفل الكولاجين أنا سد لتصور غزو الخلية. تحديد سمك Z- المكدس من خلال دراسة مدى عمق الخلايا تغزو مجال التصوير. إجراء عمليات الاستحواذ مع هدف النفط 40X في شكل 512 × 512 مع حجم Z- خطوة من 0.25 ميكرون.
ملاحظة: كمرجع، متوسط z-- المكدس للخلايا مدا-مب-231 3 أيام بعد البذر هو 30 ميكرون.
- الحصول على كومة ض من أعلى إلى أسفل الكولاجين أنا سد لتصور غزو الخلية. تحديد سمك Z- المكدس من خلال دراسة مدى عمق الخلايا تغزو مجال التصوير. إجراء عمليات الاستحواذ مع هدف النفط 40X في شكل 512 × 512 مع حجم Z- خطوة من 0.25 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام مزيج من نوعين من المصفوفات، الجيلاتين والنوع الأول الكولاجين ( الشكلين 1 و 4 )، وقد أبرزنا نوع جديد من إنفادوسوم، والمعروفة باسم إنفادوسوم الخطي. وضع العلامات من هذه المصفوفات يسمح لمراقبة تشكيل إنفادوسوم الخطي على طول ألياف الكولاجين الأول وقدرات تدهورها ( الشكل 5 ). ويمكن بعد ذلك تحديد عدد الهياكل الغازية بواسطة الماكرو الموصوفة سابقا (الخطوة 4.2)، ويمكن أيضا تحديد نشاط التحلل باستخدام برنامج إيماجيج، كما يصف مارتن وآخرون. ودياز وآخرون. 9 ، 10 . مصفوفة مختلطة تسمح لتوصيف إنفادوسوم الخطي عن طريق تحديد DDR1 كمستقبلات ضرورية لتشكيل إنفادوسوم الخطي وظائف ( الشكل 6 ).
ثين-بادج = "1"> من أجل فهم القدرة الغازية للخلايا، قمنا أيضا بتطوير نوع 3D فحص الكولاجين قابس ( أرقام 3 و 7 ). هذا الفحص يسمح لنا لتحديد عدد الخلايا التي غزت في الكولاجين أنا سد العجز، وكذلك المسافة المقطوعة، وذلك باستخدام Z- كومة إعادة البناء.
الشكل 4: مقارنة الجيلاتين والجيلاتين الكولاجين أنا المصفوفات المختلطة باستخدام المجهر متحد البؤر. التمثيل التخطيطي تظهر تنظيم الفلورسنت الجيلاتين كوفرسليبس على اللوحة العليا. ( A ) متحد البؤر Z- كومة إعادة الإعمار يدل على أن مصفوفة الجيلاتين الفلورسنت يشكل طبقة رقيقة وموحدة تغطي كامل سطح ساترة. ( B ) في المصفوفة المختلطة، بعد ترسب الجيلاتين الفلورسنت على كوفرسليبس، اكتب أنا ألياف الكولاجينبلمرة على القمة. ملطخة ألياف الكولاجين I باللون الأحمر. الكولاجين أنا مصفوفة سميكة وغير متجانسة على ساترة. توزيع ألياف الكولاجين I يعتمد على البلمرة من سلاسل الكولاجين I α. شريط مقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تأثير الجيلاتين والجيلاتين الكولاجين أنا المصفوفات على تشكيل إنفادوسوم والنشاط. الخلايا المستخدمة لهذه المقايسات هي مدا-مب-231 خلايا سرطان الثدي. ( A ) تمثيل تخطيطي يظهر الخلايا المصنفة على ساترة الفلورسنت الجيلاتين على اللوحة العليا. وتصور مناطق تدهور باللون الأسود بسبب الحد من مضان. تم استخدام Tx5 تلطيخ كعلامة إنفادوسوم. على الجيلاتين، و إنفيتم تنظيم أدوسوميس هذا الشكل كنقاط. ( B ) ويظهر التمثيل التخطيطي الخلايا المصنفة على مصفوفة مختلطة من الجيلاتين والكولاجين I. المسمى الكولاجين الأول باللون الأحمر. وإضافة نوع I الألياف الكولاجين يزيد من قدرة الخلية على تحلل الجيلاتين. ومن المثير للاهتمام، يتم إعادة تنظيم علامة Tks5 إنفادوسوم، ويتم استبدال النقاط من قبل الهياكل الخطية التي تمثل إنفادوسوم الخطي. وتصور مناطق تدهور باللون الأسود بسبب الحد من مضان. شريط مقياس = 5 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تحليل المجهري متحد البؤر التركيب الجزيئي وتنظيم إنفادوسوم في كل من الجيلاتين وظروف مصفوفة مختلطة. ( A ) في زإلاتين، يتم تنظيم إنفادوسوميس في النقاط، و F- أكتين (الأحمر) يشارك في لوكاليزس مع Tks5 (الأخضر، لوحة أسفل)، ولكن ليس مع DDR1 (الأخضر، اللوحة العليا). هذه هي إنفادوسوم الكلاسيكية. مقياس الحانات = 5 ميكرون. ( B ) في حالة الجيلاتين الكولاجين أنا مختلطة مصفوفة، DDR1 (الأخضر، لوحة أعلى) كولوكاليزس مع ألياف الكولاجين أنا (أحمر، لوحة أعلى)، Tks5 (الأخضر، لوحة أسفل)، و F- أكتين (الأحمر والأسفل فريق). نوع I ألياف الكولاجين تحفز تشكيل إنفادوسوم الخطي. مقياس الحانات = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: غزو الخلية فحص خلايا مدا-مب-231 في الكولاجين أنا سد العجز. 1 ساعة بعد البذر الخلايا، يتم إصلاح إدراجات السيطرة وملطخة. ( A ) z-ستاك aيتم تنفيذ ككيسيتيون من الكولاجين أنا المكونات باستخدام المجهر متحد البؤر. الخلايا لا تغزو الكولاجين أنا سد العجز في هذه النقطة الزمنية. بدلا من ذلك، فإنها لا تزال على رأس الكولاجين أنا سد العجز. وهكذا، يتم استخدام هذا كنقطة تحكم الوقت عندما لا يحدث غزو. تفعيل مب ضروري للخلايا لغزو الكولاجين أنا سد العجز في هذه الكثافة. ( ب ) ثلاثة أيام بعد البذر، بعض الخلايا تغزو الكولاجين أنا سد العجز. هذا الفحص يسمح للمراقبة وتقدير كمية من غزو الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يمكن استخدامها لدراسة تأثير مختلف العقاقير أو سيرناس، على سبيل المثال. شريط مقياس = 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بشكل كلاسيكي، يتم دراسة إنفادوسوم في المختبر دون النظر إلى المكروية والمصفوفة التي يتم مطلي الخلايا. وتستخدم حاليا عدة أنواع من المصفوفات، بما في ذلك الجيلاتين، فبرونيكتين، فيترونكتين، أو عالية الكثافة الكولاجين فيبريلار (هدفك) 7 ، 11 ؛ ومع ذلك، فإن هذه غالبا ما لا تمثل البيئة المكروية التي تقيم فيها الخلايا وليست ذات صلة من الناحية الفسيولوجية. هنا، تم استخدام نوع جديد من المصفوفة، والذي يتكون من رابطة بين الجيلاتين و فيبريلار نوع I الكولاجين،. استخدام نوع I الألياف الكولاجين يسمح لنا لتسليط الضوء على فئة جديدة من إنفادوسوميس، والمعروفة باسم إنفادوسوم الخطي، والتي تشكل على وجه التحديد على الكولاجين الأول في العمارة الفسيولوجية 7 . وسم الكولاجين أنا يسمح لنا لمراقبة إنفادوسوم الخطي على طول الألياف، وتحديد تشكيلها باستخدام علامات الخلوية مثل Tks5 والكورتاكتين. باستخدام ميشيد مصفوفة، حددنا مستقبلات جديدة، مستقبلات ديسودين مجال 1 (DDR1)، والمشاركة في تشكيل إنفادوسوم الخطي 8 .
مصفوفة مختلطة 2D يسمح لنا لقياس النشاط تدهور المصفوفة من إنفادوسوم الخطي عبر فحص زيموغرافي في الموقع . هذا الفحص تقارير النشاط التحلل البروتيني من مبس من خلال تحليل وجود الثقوب السوداء في طبقة الجيلاتين الفلورسنت. ومن المثير للاهتمام، وتنظيم F- أكتين في إنفادوسوم الخطي يزيد من النشاط تدهور المصفوفة مقارنة مع الجيلاتين فقط 7 . واحد الحد من هذا الفحص هو أن الجيلاتين هو مصفوفة غير الفسيولوجية، وقد ثبت أن مصفوفة أكثر الفسيولوجية يغير الاستجابة الخلوية إلى المكروية. وجود قيود إضافية في الطريقة التي يتم فيها قياس النشاط مب على الكيلاتين الجلاجين أنا مختلطة المصفوفات. فقط تدهور الجيلاتين الذي لوكاليزس تحت الكولاجين أنا فييمكن أن يكون كميا طبقة حبة. وبالتالي، وهذا هو وسيلة غير مباشرة لقياس الكولاجين I تدهور المصفوفة. طريقة بديلة لتصور نشاط تدهور إنفادوسوم الخطي هو تسمية ألياف الكولاجين I مع الأجسام المضادة محددة ضد الكولاجين مواقع الانقسام (COL1- 3/4 C، المناعي). هذا يسمح لتصور الألياف المشقوقة بواسطة المناعي. ومع ذلك، بسبب هجرة الخلايا، وهذا الجسم المضاد ليست محددة جدا في 2D لتدهور بسبب تشكيل إنفادوزوم الخطي. طريقة أخرى لتصور وكمية النشاط تدهور ألياف الكولاجين I هو استخدام مولتيفوتون المجهري والثاني التوافقي الثاني 8 . هذا الأسلوب يسمح للتصوير من ألياف الكولاجين I دون أي تلطيخ.
طريقة لدينا من بلمرة نوع I الكولاجين يختلف بالمقارنة مع الأساليب الأخرى المستخدمة في الأدب 12 ، 13 . على سبيل المثال، أرتم لدراسة مشاركة إنفادوسوم الخطي في غزو الخلية، تم استخدام الكولاجين 3D المقايسة المكونات. يستخدم الكولاجين 3D I المكونات بالفعل من قبل المجتمع العلمي من أجل دراسة الهياكل الغازية أو تورط ميتالوبروتيناسيس في عملية الغزو 14 ، 15 ، 16 . هذه الأنواع من المصفوفات 3D لديها حدود فيما يتعلق ثيr صلابة - على سبيل المثال، وكولاجين 3D أنا المكونات أقل جامدة من مصفوفة 2D. وعلاوة على ذلك، نوع وأصل الكولاجين أنا مهم أيضا فيما يتعلق بتنظيم مختلف ألياف الكولاجين في الجسم الحي 17 . وأخيرا، في ما يتعلق بتكوين المكروية في الجسم الحي ، وقد ركز عنصر واحد فقط من المصفوفة خارج الخلية، ونوع الكولاجين، على. مزيد من الدراسة ضروري لتحديد أهمية إنفادوسوم الخطي في الجسم الحي . بالإضافة إلى دراسة إنفادوسوم الخطي، ويمكن استخدام المصفوفة المختلطة، الموصوفة هنا، مع أنواع أخرى من مكونات المصفوفة، مثل فبرونيكتين، فيترونكتين، وأنواع أخرى من الكولاجين (على سبيل المثال، نوع الكولاجين الرابع). ويمكن تكييف هذا البروتوكول، اعتمادا على أنواع عناصر المصفوفة التي هي ذات أهمية والعمليات التي يتعين دراستها. ومع ذلك، فمن الواضح أن توليد المصفوفات المعقدة والفسيولوجية تسمح لتحديد نث مسارات تشارك في التصاق الخلية، والهجرة، والغزو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وقد دعمت جدم زمالة الدكتوراه من إنزيرم / ريجيون أكيتين وتدعم الآن من قبل زمالة أرك ما بعد الدكتوراه ومعهد تيش للسرطان في كلية جبل سيناء للطب. ويدعم إه درجة الدكتوراه من وزارة التعليم العالي والبحث العلمي. ويدعم زي من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه من الوكالة الوطنية للبحث العلمي (أنر). ويدعم سم من قبل معهد تيش للسرطان في مدرسة جبل سيناء الطب ويدعم جي بي سي من قبل المعاهد الوطنية للصحة / نسي منحة K22CA196750، وجزيرة طوكيو صندوق أبحاث السرطان العلماء صندوق جر، ومعهد السرطان تيشش في كلية جبل سيناء الطب. وأيد هذا العمل من منحة من أنر-13-جيك-JSV1-0005. فس يدعمه "ليغ ناتيونال كونتر لي كانسر." يتم دعم فم و فس بتمويل من "إكيب لابليسي ليغ ناتيونال كونتر لي كانسر 2016" و إنستيتوت ناتيونال دو كانسر، INCA_8036، و PLBio2012.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin solution | Sigma | G1393 | Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml |
| Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate | Molecular probe life technologies | G13186 | 5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water |
| Microscope cover glasses | Marlenfeld GmbH & Co | 111520 | Ø12mm No.1 |
| 2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4 | Electron microscopy science | 15960 | Dilute at 0.5 % in sterile water |
| 1x PBS pH 7.4 | Gibco by life technologies | 10010-015 | Use this PBS in all steps before fixation |
| Collagen I Rat tail | Corning | 354236 | |
| 5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester | Life technologies | C-6125 | |
| DPBS 1x + calcium + magnesium | Gibco by life technologies | 14040-091 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron microscopy science | 15710 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
| 10x PBS buffer pH 7.4 | Ambion | AM9625 | Dilute at 1X in water Use in steps after fixation |
| Tks5 antibody | Santa Cruz | sc-30122 | Invadosome markers Dilution : 1/100 |
| Cortactin 4F11 antibody | Millipore | 5180 | Invadosome markers Dilution :1/100 |
| DDR1 antibody | Cell signaling | 5583 | Linear invadosome receptor |
| Dilution :1/100 | |||
| Phalloidin FluoProbes | Interchim | FT-AZ0330 | Fibrillary actin marker Dilution :1/200 |
| Hoechst | Sigma | 33258 | Nucleus marker Dilution :1/200 |
| Secondary antibodies FluoProbes | Interchim | FP-488 FP-547H or FP-647H | |
| Albumin from bovine serum | Sigma | A2153 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Fluoromount G mounting medium | Interchim | FP 483331 | |
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| Cell culture insert | Corning | 353097 | 8.0µm pore size / 24 wells |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 221465 |
References
- Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-54 (2003).
- Gilkes, D. M., et al. Collagen prolyl hydroxylases are essential for breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 3285-3296 (2013).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 185-211 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Di Martino, J., et al. Cdc42 and Tks5: a minimal and universal molecular signature for functional invadosomes. Cell Adh. Migr. 8, 280-292 (2014).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. J. Cell Sci. 122, 3015-3024 (2009).
- Juin, A., et al. Physiological type I collagen organization induces the formation of a novel class of linear invadosomes. Mol. Biol. Cell. 23, 297-309 (2012).
- Juin, A., et al. Discoidin domain receptor 1 controls linear invadosome formation via a Cdc42-Tuba pathway. J. Cell Biol. 207, 517-533 (2014).
- Martin, K. H., et al. Quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts. J. Vis. Exp. , e4119 (2012).
- Diaz, B. Invadopodia detection and gelatin degradation assay. Bio-protocol. 3, 1-8 (2013).
- Artym, V. V., et al. Dense fibrillar collagen is a potent inducer of invadopodia via a specific signaling network. J. Cell Biol. 208, 331-350 (2015).
- Schachtner, H., et al. Megakaryocytes assemble podosomes that degrade matrix and protrude through basement membrane. Blood. 121, 2542-2552 (2013).
- Schoumacher, M., Glentis, A., Gurchenkov, V. V., Vignjevic, D. M. Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay. Methods Mol. Biol. 1046, 133-144 (2013).
- Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 102, 3262-3269 (2003).
- Geraldo, S., et al. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo? Eur. J. Cell Biol. 91, 930-937 (2012).
- Monteiro, P., et al. Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia. J. Cell Biol. 203, 1063-1079 (2013).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).
