Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन है कि कैसे 2 डी मिश्रित मैट्रिक्स तैयार करने के लिए, जिलेटिन और कोलेजन I से मिलकर, और एक 3D कोलेजन मैं रैखिक invadosomes का अध्ययन करने के लिए प्लग। ये प्रोटोकॉल रैखिक आविष्कारक गठन, मैट्रिक्स गिरावट गतिविधि, और प्राथमिक कोशिकाओं और कैंसर सेल लाइनों के आक्रमण क्षमताओं के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं।
Abstract
सेल आसंजन, प्रवास, और आक्रमण कई शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में शामिल हैं I उदाहरण के लिए, मेटास्टेसिस के गठन के दौरान, ट्यूमर कोशिकाओं को रक्त या लसीकाय वाहिकाओं तक पहुंचने के लिए आसपास के ऊतकों पर आक्रमण करने और आबाद करने के लिए संरचनात्मक अवरोधों को पार करना पड़ता है। इसके लिए कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के बीच बातचीत की आवश्यकता है। सेलुलर स्तर पर, कैंसर कोशिकाओं के बहुमत वाले कई कोशिकाएं, इनडॉडोसोम बनाने में सक्षम हैं, जो एफ-एक्टिन-आधारित ढांचे जो अपमानजनक ईसीएम में सक्षम हैं। इनडॉडोसोम एक्टिविंस एक्टिन संरचनाएं हैं जो मैट्रिक्स मेटलॉप्रोटीनसेस (एमएमपी) को भर्ती और सक्रिय करते हैं। आणविक संरचना, घनत्व, संगठन, और ईसीएम की कठोरता आजादी के गठन और सक्रियण को विनियमित करने में महत्वपूर्ण है। इन विट्रो में , एक जिलटिन परख एक मानक परख है जो इनडोस्कोम डिग्रेडेशन गतिविधि का निरीक्षण और मात्रा निर्धारित करता है। हालांकि, जिलेटिन, जो विकृत कोलाजेन I है, एक शारीरिक मैट्रिक्स ई नहीं हैlement। टाइप आई कोलेजन तंतुओं का उपयोग करते हुए एक उपन्यास परख विकसित किया गया था और यह प्रदर्शित करने के लिए प्रयोग किया जाता था कि यह शारीरिक मैट्रिक्स इनडॉडोसोमों का एक शक्तिशाली उद्यमी है। कोलेजन तंतुओं के साथ मिलकर काम करने वाले इनकोडोसोम को फाइबर पर उनके रैखिक संगठन के कारण रैखिक invadosomes के रूप में जाना जाता है। इसके अलावा, रैखिक invadosomes के आणविक विश्लेषण से पता चला है कि डिस्कोइडिन डोमेन रिसेप्टर 1 (DDR1) उनके गठन में शामिल रिसेप्टर है। कोशिकाओं और ईसीएम के बीच जटिल बातचीत को समझने के लिए ये आंकड़े स्पष्ट रूप से शारीरिक रूप से प्रासंगिक मैट्रिक्स का उपयोग करने के महत्व को दर्शाते हैं।
Introduction
एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) रीमॉडेलिंग शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं के दौरान होता है, जैसे एंजियोजेनेसिस और ट्यूमर सेल आक्रमण शारीरिक परिस्थितियों में, कई सेल प्रकार, जो कि हेमटोपोएटिक वंश से अधिकतर, ईसीएम तत्वों को विघटित करने में सक्षम हैं। उदाहरण के लिए, मैक्रोफेज ऊतकों तक पहुंचने के लिए संरचनात्मक बाधाओं को पार करने में सक्षम हैं, और ऑस्टियोक्लास्ट कैल्शियम होमोस्टैसिस को सुनिश्चित करने के लिए हड्डी मैट्रिक्स को नीचा कर देते हैं। अधिक विश्व स्तर पर, शरीर में सभी मैट्रिक्स अपने भौतिक और रासायनिक गुणों को बनाए रखने के लिए नवीनीकृत करते हैं। कैंसर के ऊतकों में, ट्यूमर माइक्रोएनेरमेंट संरचना बदल जाती है। उदाहरण के लिए, स्तन और फेफड़ों के कैंसर में, टाइप करें मैं कोलेजन को अत्यधिक विषम और ट्यूमर के आसपास जम जाता है। इसके अलावा, यह संचय मेटास्टेसिस 1 , 2 के विकास के जोखिम के साथ जुड़ा हुआ है। कैंसर मेटास्टैसिस कैंसर कोशिकाओं की क्षमता पर ईसीएम नीचा और आसन्न ऊतकों पर आक्रमण पर निर्भर है।
कोशिकाओं की आक्रामक गतिविधि विशिष्ट एक्टिन-समृद्ध संरचनाओं को जिम्मेदार ठहराती है जिसे आविंदोसोम नाम से जाना जाता है। इस अवधि में सामान्यतः और कैंसर कोशिकाओं ( जैसे, मैक्रोफेज, एंडोथेलियल कोशिकाएं, और एमडीए-एमबी-231 स्तन कैंसर सेल लाइन जैसे कैंसर कोशिकाओं ) में क्रमशः पॉडोसोम और ऐनाडोडोपोडिया शामिल हैं। इन विट्रो में , इनकोडोसोम विभिन्न आकारों में व्यवस्थित कर सकते हैं: डॉट्स, समुच्चय या रोज 3 शास्त्रीय रूप से, इनडेडोसोम एक एफ-एक्टिन कोर से बने होते हैं जिनमें कई प्रोटीन होते हैं, जैसे स्कैफोल्ड प्रोटीन टीके 5 और कॉरटेक्टिन, जो आसंजन पट्टिका के अणुओं से घिरा हुआ है, जैसे कि इंटीग्रिन और वििनकुलिन 4 । हाल ही में, यह दिखाया गया था कि Tks5 और RhoGTPase सीडीसी 42 को कार्यात्मक invadosomes 5 के लिए कम से कम आणविक हस्ताक्षर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। ये संरचनाएं विशिष्ट मेटलॉप्रोटेस प्रोटीन की भर्ती और सक्रियण के माध्यम से ईसीएम को नीचा दिखाने में सक्षम हैं, जैसे कि एमटी 1-एमएमपी और एमएमपी -2 6। पिछले अध्ययन में, हमने बताया कि टाइप 1 कोलेजन तंतुओं और डिस्कोइडन डोमेन रिसेप्टर 1 (डीडीआर 1) के बीच बातचीत, टाइप आई कोलेजन तंतुओं के एक विशिष्ट रिसेप्टर, रैखिक invadosomes नामक एक नए वर्ग invadosomes के गठन की ओर जाता है। रैखिक invadosomes प्रकार मैं कोलेजन तंतुओं के साथ 7 का गठन कर रहे हैं ये संरचनाएं एमटी 1-एमएमपी / एमएमपी 2 की भर्ती और सक्रियण के माध्यम से प्रकार मैं कोलेजन तंतुओं को नीचा कर सकती हैं। इसके अलावा, उनका गठन Tks5 और Cdc42 5 पर निर्भर है। इन विट्रो में , हमने विभिन्न मैट्रिक्स तत्वों के संयोजन से विभिन्न रणनीतियों का उपयोग करके रैखिक invadosomes और उनके गठन और गतिविधि 8 में DDR1 की उपस्थिति का प्रदर्शन किया, जिनमें निम्न शामिल हैं: i) फ्लोरोसेंट जेलाटीन-लेपित शॉस्लिप्स, ii) फ्लोरोसेंट टाइप मैं कोलेजन फाब्रिल -क्लाइड कवरलेट्स, और iii) 3 डी प्रकार मैं कोलेजन प्लग। विभिन्न मैट्रिक्स के उपयोग के कारण, हम अध्ययन और चरित्र के लिए सक्षम थेरैखिक आविष्कारक गठन और उनकी गिरावट गतिविधि 7 , 8
आखिरकार, आक्रामक कोशिकाओं के जीव विज्ञान को बेहतर ढंग से समझने के लिए, ट्यूमर माइक्रोएनेरमेंट संरचना की जटिलता की नकल करते हुए, 2 डी और 3 डी संस्कृति दोनों प्रणालियों में ईसीएम घटकों के संयोजन का उपयोग किया गया। नीचे 2 डी और 3 डी कल्चर सिस्टम में जिलेटिन / टाइप आई कोलेजन के साथ कवर लेटेप के लिए प्रोटोकॉल हैं।
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Protocol
नोट: निर्धारण से पहले, सभी चरणों को एक बाँझ लामिना का प्रवाह हुड में पूरा किया जाता है।
1. 2 डी मैट्रिक्स
नोट: 2 डी मैट्रिस का इस्तेमाल इनकॉडोसोम बनाने वाली कोशिकाओं के प्रतिशत और प्रति सेल मैट्रिक्स डिग्रेडेशन क्षेत्र का निर्धारण करने के लिए किया जाता है।
चित्रा 1: प्रोटोकॉल जेलेटिन और कोलेजन मैं मैट्रिक्स तैयार करने के लिए इस्तेमाल प्रोटोकॉल का सारांश। जिलेटिन मैट्रिक्स केवल या एक जिलेटिन और कोलेजन को मैट्रिक्स मिश्रित करना संभव है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
- जिलेटिन मैट्रिक्स
नोट: मैट्रिक्स गिरावट को मापने के लिए फ्लोरोसेंट जिलेटिन मैट्रिक्स का उपयोग किया जाता है, और कोलाजेन I फाइबर के आसंजन को बढ़ावा देने के लिए गैर फ्लोरोसेंट जिलेटिन का उपयोग किया जाता है। फ्लोरोसेंट जिलेटिन चटाईराडो का उपयोग पोडोसोम और ऐनाडोडोपोडिया अध्ययन के लिए भी किया जाता है ( चित्रा 1 देखें)।- बाँझ लामिना का प्रवाह हुड के तहत, काम के क्षेत्र में परफिलम (20 सेमी x 15 सेमी) का एक टुकड़ा रखें और इसे 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित करें।
- एक पंक्ति में 1 मिलीग्राम / एमएल जिलेटिन के 20 μL बूंदों की विभाज्य, लगभग 1 सेमी की दूरी पर; छोटी बूंद संगठन के लिए चित्रा 1 को देखें।
- प्रत्येक 20 μL जिलेटिन छोटी बूंद को एक आटोक्लेव ग्लास कंसलिप (व्यास में 12 मिमी) के साथ कवर करें।
- कमरे के तापमान पर 20 मिनट सेते हैं अगर जिलेटिन फ्लोरोसेंट है, तो इसे प्रकाश से बचाएं
- 1x फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) में 1x फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) में 0.5% ग्लूटार्डाडिहाइड की 40 μL बूंदों को एक कदम में, प्रत्येक 1.1.3 कदम से coverslips की रेखा के नीचे लगभग 1 सेमी।
सावधानी: ग्लुटार्डाडिहाइड एक जहरीले लगानेवाला एजेंट है। दस्ताने का प्रयोग करें और श्वास न करें। - जर्दीय संदंश का उपयोग करना, प्रत्येक जिलेटिन-लेपित कंडोलिप को एक ग्लूटार्डाडिहाइड बूंदों में स्थानांतरित करें।
यह ध्यान देंसामान्य है कि पैराफिलम पर एक छोटे जिलेटिन की छोटी बूंद बनी हुई है किसी अन्य प्रयोग के लिए इसका पुन: उपयोग न करें। - कमरे के तापमान पर 40 मिनट सेते हैं। फ्लोरोसेंट कंडोली के लिए, उन्हें प्रकाश से बचाएं
- 24-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट लें और 500 μL बाँझ 1x पीबीएस के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से भरें। प्रत्येक कूल्हे में कवरलेट्स, जिलेटिन साइड अप रखें
- 5 मिनट प्रत्येक के लिए 1x पीबीएस में दो बार धो लें
नोट: इस चरण में, कवर्लिप्स प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएस में संग्रहीत किया जा सकता है। गैर-फ्लोरोसेंट कवरलेट एक सप्ताह के लिए संग्रहीत की जा सकती है, और फ्लोरोसेंट कवरलेट 48 घंटे के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
- फ़िब्रिलर कोलेजन प्रकार I मैट्रिक्स
नोट: फाइब्रिलर कोलेजन प्रकार I मैट्रिक्स का उपयोग रैखिक आविष्कारक गठन और संबद्ध मैट्रिक्स गिरावट के अध्ययन के लिए किया जाता है। फ्लोरोसेंट कोलेजन I और गैर-फ्लोरोसेंट जिलेटिन कंडोली का एक संयोजन का उपयोग कोलाजेन फाइबर के साथ आविष्कारक मार्करों को सम्मिलित करने के लिए किया जाता है ( जैसे, एफ-एक्टिन iN लाल चैनल, लाल चैनल में कोलेजन 1, ग्रीन चैनल में Tks5, और परमाणु दाग के लिए हईचस्ट डाई)। दूसरी ओर, गैर-फ्लोरोसेंट कोलाजेन I का गैर-फ्लोरोसेंट जिलेटिन कंडरी के साथ संयोजन का उपयोग आविष्कारक चिह्नकों की संख्या को अधिकतम करने के लिए किया जाता है ( जैसे, दूर-रेड चैनल में एफ-एक्टिन, लाल चैनल में कॉर्टटेन, Tks5 में हरी चैनल, और परमाणु दाग के लिए हईचस्ट डाई)। अंत में, फ्लोरोसेंट जेलेटीन कंडोली के साथ गैर-फ्लोरोसेंट कोलेजन I का संयोजन जिलेटिन-संबंधित गिरावट ( जैसे, दूर-लाल चैनल में एफ-एक्टिन, लाल चैनल में TKS5, हरे रंग की चैनल में, और हईचस्ट डाई परमाणु दाग के लिए) (चित्रा 1 देखें)। Hoechst डाई नाभिक को दाग करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और यह मायकोप्लास्सा प्रदूषण के लिए भी जांचता है, एक पीसीआर परीक्षण के इस्तेमाल के अनुसार सेल लाइनों पर नियमित रूप से किया जाता है।- फ्लोरोसेंट कोलेजन I
- 0.02 एन एसिटिक एसी में चूहे-पूंछ कण्डरा से निकाले गए व्यावसायिक कोलेजन का उपयोग करें Iघ। कोलेजन की मात्रा निकालने के लिए आवश्यक है कि मैं 0.4 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन आई के अंतिम एकाग्रता में प्रति कंडोलिप में 500 μL समाधान तैयार करना चाहता हूं।
- कोलेजन I समाधान (एनएक्स 500 μL) के अंतिम मात्रा के लिए गणना की गई 10 μg / mL की अंतिम एकाग्रता में 5-कार्बोक्सी एक्स रोडामाइन सुक्विनिमिडिल एस्टर जोड़ें।
- ऊपर और नीचे pipetting द्वारा समाधान मिक्स और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते, प्रकाश से सुरक्षित।
- कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त 1 एक्स डुल्बेके के फॉस्फेट-बफर्ड सलाईन (डीपीबीएस) के साथ अंतिम मात्रा को पतला करें और सीधे उपयोग करें।
- फ़िब्रिल्लर कोलेजन I कवर एलिप
- पहले चरण 1.1 में तैयार किए गए गैर फ्लोरोसेंट या फ्लोरोसेंट जिलेटिन coverslips का उपयोग करें।
- कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त 1 एक्स डीपीबीएस में 0.4 मिलीग्राम / एमएल के अंतिम एकाग्रता में फ्लोरोसेंट या गैर फ्लोरोसेंट कोलेजन I का समाधान तैयार करें।
- प्रति फ्लोरोसेंट या गैर फ्लोरोसेंट कोलेजन I समाधान के 500 μL जोड़ेंएक 24-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट में coverslip
- कोलेजन I के लिए 4 डिग्री सेल्सियस से 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेते।
- ऊष्मायन के बाद, मैट्रिक्स को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए प्लेट को झुकाव और अच्छी तरह से (सीधे कवरलिप पर) के किनारे पर पिपेट करने से अतिरिक्त कोलेजन I को हटा दें।
नोट: यह मैट्रिक्स संग्रहीत नहीं किया जा सकता। अतिरिक्त कोलेजन आई को हटाने के तुरंत बाद कोशिकाओं बीज।
- फ्लोरोसेंट कोलेजन I
2. सेल बोने, संस्कृति का समय और निर्धारण
- सेल प्रकार के आधार पर, उचित संस्कृति माध्यमों में कोशिकाओं को तैयार करें और प्रति सप्ताह 500 μL प्रति के लिए कोशिकाओं को जोड़ें।
- रैखिक invadosomes बनाने के लिए एक सेल लाइन की क्षमता को चिह्नित करने के लिए और मैट्रिक्स नीचा करने के लिए, रैखिक invadosome गठन और संबद्ध गिरावट गतिविधि के कैनेटीक्स निर्धारित करने के लिए कोलेजन I मैट्रिक्स पर 4 घंटे, 12 घंटे और 24 घंटे के लिए कोशिकाओं प्लेट।
नोट: तालिका 1 में सेल लाइनों के उदाहरण हैंप्रयोगशाला में परीक्षण
तालिका 1: सेल बोने और ऊष्मायन समय संदर्भ यह तालिका रैखिक invadosomes का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल सेल लाइनों की एक गैर-विस्तृत सूची प्रस्तुत करता है। यह मैट्रिक्स पर बीज की कोशिकाओं की संख्या को इंगित करता है, रेखीय invadosomes का निरीक्षण करने के लिए आवश्यक समय, और जुड़े मैट्रिक्स गिरावट का निरीक्षण करने के लिए आवश्यक समय। रैखिक invadosomes एक लघु जीवनकाल है। कोशिकाओं की अधिकतम संख्या में रैखिक invadosomes का निरीक्षण करने में सक्षम होने के लिए, कोशिकाओं को कम समय के लिए कोलेजन I मैट्रिक्स के संपर्क में होना चाहिए। दूसरी ओर, रिपोर्ट किए गए जिलेटिन गिरावट की कल्पना करने में सक्षम होने के लिए, ऊपर सूचीबद्ध सूचीबद्धियों की तुलना में कोशिकाओं को लंबे समय तक कोलेजन I मैट्रिक्स के संपर्क में होना चाहिए।कोशिका की परत प्रति सेल्स-सेल की संख्या रैखिक invadosome मात्रा का ठहराव के लिए मैट्रिक्स के साथ संपर्क का समय रैखिक invadosome गिरावट गतिविधि की मात्रा का ठहराव के लिए मैट्रिक्स के साथ संपर्क का समय एमडीए एमबी 231 40,000 4 घंटे 12 घंटे Huh7 40,000 12 घंटे 24 घंटे एचईपी 3 बी 40,000 12 घंटे 24 घंटे एसएनयू 398 40,000 12 घंटे 24 घंटे एनआईएच 3 टी 3 एसआरसी 30,000 4 घंटे 12 घंटे A431 50,000 6 घंटे 24 घंटे A549 40,000 12 घंटे 24 घंटे &# 160; कच्चा 40,000 12 घंटे 12 घंटे पीएई 40,000 12 घंटे 12 घंटे - सेल संस्कृति माध्यम को हटाने के बाद,1 मिनट पीबीएस में 500 μL के 4% पैराफॉर्मालाइहाइड में 10 मिनट के लिए कवर लिप्स को ठीक करें
- 1x पीबीएस के साथ दो बार धो लें
- 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, प्रकाश से सुरक्षित।
3. Immunofluorescence
- एक हौसले से तैयार समाधान के साथ 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को स्थिर करें 1x पीबीएस में 0.2% ट्राइटन एक्स -100 का। इस समाधान का पुन: उपयोग न करें
- 1x पीबीएस के साथ दो बार कवरलाप धो लें
- बेंच पर पेराफिल्म (20 सेमी x 15 सेमी) का एक टुकड़ा रखें।
- सामग्री तालिका में वर्णित के अनुसार 1x पीबीएस में 4% गोजातीय सीरम एल्बूमिन (बीएसए) में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें।
- एक पंक्ति में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 50 μL बूंदों की विभाज्य, प्रत्येक स्थान लगभग 1 सेमी अलग है।
- एक छोटी बूंद पर प्रत्येक coverslip जगह
- कमरे के तापमान पर 40 मिनट के लिए सेते, रोशनी से सुरक्षित।
- ऊष्मायन अवधि के बाद, 1x पीबीएस के साथ दो बार धो लें
- 1x में 4% बीएसए में द्वितीयक एंटीबॉडी, फलोइडिन और होचस्ट डाईले को पतला करेंपीबीएस।
- मिश्रण के 50 μL बूंदों की अनुपस्थिति, पहले से पहले के रूप में कवरल्स की पहली पंक्ति से लगभग प्रत्येक 1 सेंटीमीटर नीचे स्थित है।
- एक छोटी बूंद पर प्रत्येक coverslip जगह
- कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते, रोशनी से सुरक्षित।
- ऊष्मायन के बाद, 1x पीबीएस के साथ दो बार धो लें
- नमक को हटाने के लिए आसुत जल के साथ एक बार धो लें।
- बढ़ते माध्यम के साथ एक ग्लास स्लाइड पर कवरलेट्स माउंट करें।
- सूक्ष्मदर्शी से पहले, कमरे के तापमान पर, रात के समय, प्रकाश से संरक्षित कवरलाप सूखा।
4. मात्राएं
चित्रा 2: रैखिक invadosome मात्रा का ठहराव। मैक्रो को एफ-एक्टिन और टीके 5 स्केनिंग (प्रारूप: 1,024 x 1,024) की कन्फोकल छवियों की आवश्यकता है। ( ए ) सबसे पहले, एफ-एक्टिन तस्वीर खोलें और मुखौटा बनाएं। ( बी ) फिर, खुलाTks5 तस्वीर और सीमा यह। मैक्रो को लागू करें ( सी ) विश्लेषण किए गए परिणाम दो तालिकाओं में दिखाई देंगे। प्रति सेल रैखिक invadosomes की संख्या और अन्य जानकारी, जैसे सेल में रैखिक invadosomes द्वारा उपयोग प्रतिशत क्षेत्र, सारांश तालिका में होगा। प्रत्येक रैखिक invadosome का आकार परिणाम तालिका में होगा। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
- रैखिक invadosomes गठन कोशिकाओं का प्रतिशत
- रैखिक invadosomes के गठन कोशिकाओं की गणना, प्रति coverslip प्रति लगभग 100 कोशिकाओं (तकनीकी triplicates का उपयोग करें)। एन = 3 के साथ कम से कम 300 कोशिकाओं को प्रति एनं।
- 900 स्वतंत्र कोशिकाओं के परिणामस्वरूप, तीन स्वतंत्र प्रयोगों की औसत ले कर रैखिक invadosomes के गठन कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना।
- रैखिक आविष्कारक आकार और प्रति सेल संख्या
- पूरक मैक्रो के साथ ImageJ का उपयोग करें।
- प्रति शर्त के लिए तीन कवरलाप का उपयोग करें
- फ्लोरोसेंट जिलेटिन और होकस्ट-स्टेक्टेड न्यूक्ली के प्रति कवरलाइट्स के प्रति 30 चित्र लें।
- मार्टिन के एच एट अल में वर्णित ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें 9
5. 3 डी कोलेजन आक्रमण परख
चित्रा 3: आक्रमण परख स्कीमा आक्रमण परख प्रोटोकॉल का सारांश कोलेजन I को सुक्विनिमिडिल एस्टर डाई के साथ क्रॉस-लिंक किया गया है और 1 घंटे 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पॉलिमराइज़ किया गया है। कोशिकाओं को कोलेजन I प्लग के ऊपर सीरम से मुक्त माध्यम में जोड़ा जाता है डालने को मध्यम वाई में रखा गया हैवें 10% एफबीएस कोलेजन I प्लग को नियंत्रण में सेल बोने के बाद 1 घंटा और कोशिकाओं की आक्रमण क्षमता निर्धारित करने के लिए प्रयोगात्मक स्थिति में सेल बोने के 3 दिन बाद तय की गई है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
- कोलेजन मैं प्लग तैयारी
- सेल प्रकार के अनुसार जेल में आक्रमण के कैनेटीक्स को निर्धारित करने के लिए पहला प्रयोग के लिए 4 घंटे, 12 घंटे, 24 घंटे, 48 घंटे और 72 घंटे का एक समय का कोर्स करें। प्रत्येक प्रयोग के लिए, एक संदर्भ समय बिंदु के रूप में 1 घंटे का समय बिंदु जोड़ें जब कोई आक्रमण नहीं होता है।
- एक बाँझ लामिना का प्रवाह हुड के तहत बर्फ पर कोलेजन I समाधान तैयार करें। 3 बॉयडेन चैंबर आवेषण के लिए समाधान के 500 μL तैयार करें।
- 1 मिलीग्राम वाणिज्यिक चूहे-पूंछ कोलेजन मैं 2 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन आई के अंतिम एकाग्रता के साथ एक समाधान तैयार करने के लिए आकांक्षा।
- 5-कार्बोक्सी x रोडामाइन सुक्विनिमिडिल एस्टर जोड़ें1 माइक्रोग्राम / एमएल की एक अंतिम एकाग्रता, कोलेजन I समाधान के अंतिम मात्रा के लिए गणना (इस मामले में, 500 μL)।
- अच्छी तरह से मिक्स करें और 5 मिनट के लिए बर्फ पर बाँझ लामिना का प्रवाह हुड के नीचे से रोशनी से सुरक्षित रखें।
- बर्फ के ठंडे, फ़िल्टर्ड 10 एक्स पीबीएस और 6.25 μL बर्फ-ठंडा 1 एम सोडियम हाइड्रॉक्साइड (NaOH) के 50 μL जोड़ें।
- सूत्र 443.75 के अनुसार बाँझ पानी जोड़ें - कोलेजन आई के एक्स μ एल।
- बोवेन कक्ष डालने के लिए 100 μL का समाधान जोड़ें।
- पोलीमराइजेशन की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
- भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) से नए कुओं में समृद्ध सेल संस्कृति माध्यम जोड़ें; जगह इन कुओं में सम्मिलित करता है
- कोलेजन के शीर्ष पर बीज 30,000 कोशिकाओं मैं एफबीएस मुक्त माध्यम प्लग।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को संवर्धन करने के बाद, कोलेजन को ठीक करें, मैं 1x पीबीएस में 4% पैराफॉर्मालाइडहाइड में 30 मिनट का प्लग करता हूं।
- निम्नलिखित चरणों के अपवाद के साथ, चरण 3 के रूप में पूर्ण immunofluorescence: permeabiliZe के साथ 0.2% ट्राइटन एक्स -100 में 1x पीबीएस 30 मिनट के लिए, न 10 मिनट; क्रमशः 40 मिनट और 30 मिनट के बजाय, प्रत्येक 1.5 घंटे के लिए प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ सेते हैं। कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए एफ-एक्टिन या नाभिक के लिए दाग।
- Immunofluorescence के बाद, डालने के झिल्ली के चारों ओर काटने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें और ध्यान से मैं एक गिलास नीचे डिश में प्लग कोलेजन स्थानांतरण। सुनिश्चित करें कि मैं कोलेजन के ऊपर कांच कांच के संपर्क में है। प्लग की अखंडता को बनाए रखने के लिए मैं कोलेजन के प्लग में निचले झिल्ली को जोड़ता हूं।
नोट: कोलेजन मैं प्लग ग्लास नीचे डिश में बरकरार है। कांच के नीचे और प्लास्टिक के गिलास नीचे के बीच की गहराई प्लग की मोटाई के बराबर होती है। - कोलाजेन पर एक कंसलिप को रखें जो प्लग को रोकने के लिए प्लग को रोकने के लिए मैं बहती हुई मध्यम बहुलकिंग के साथ प्लग और माउंट करता हूं।
- छवि को कोलेजन I प्लग में एक उल्टे confocal सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग करें; के ऊपरप्लग डिश के गिलास नीचे के संपर्क में है।
- कोलेजन के शीर्ष से ऊपर से एक z- स्टैक प्राप्त करें, मैं सेल आक्रमण को देखने के लिए प्लग करता हूं। जांच करके z- स्टैक की मोटाई निर्धारित करें कि कोशिका इमेजिंग फील्ड पर कैसे आती है। 0.25 माइक्रोन के एक जेड-स्टेप साइज के साथ 512 x 512 प्रारूप में 40 एक्स ऑयल के उद्देश्य से अधिग्रहण करें
नोट: संदर्भ के लिए, एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं के लिए औसत z- स्टैक 30 दिन बीजों के बाद 30 माइक्रोन है।
- कोलेजन के शीर्ष से ऊपर से एक z- स्टैक प्राप्त करें, मैं सेल आक्रमण को देखने के लिए प्लग करता हूं। जांच करके z- स्टैक की मोटाई निर्धारित करें कि कोशिका इमेजिंग फील्ड पर कैसे आती है। 0.25 माइक्रोन के एक जेड-स्टेप साइज के साथ 512 x 512 प्रारूप में 40 एक्स ऑयल के उद्देश्य से अधिग्रहण करें
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Representative Results
मैट्रिक्स, जिलेटिन और टाइप 1 कोलेजन ( आंकड़े 1 और 4 ) के दो प्रकार के संयोजन का उपयोग करते हुए, हमने एक नए प्रकार के आविष्कारक को हाइलाइट किया है, जिसे रैखिक invadosomes कहा जाता है। इन मैट्रिक्स के लेबलिंग कोलेजन I फाइबर और उनकी गिरावट क्षमता ( चित्रा 5 ) के साथ रैखिक invadosome गठन के अवलोकन के लिए अनुमति देता है। इनवेसिव संरचनाओं की संख्या को तब पहले वर्णित मैक्रो द्वारा निर्धारित किया जा सकता है (चरण 4.2), और गिरावट गतिविधि को भी ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है, जैसा कि मार्टिन एट अल द्वारा वर्णित है और डायज़ एट अल 9 , 10 मिश्रित मैट्रिक्स रैखिक invadosomes के लक्षण वर्णन के लिए डीडीआर 1 को रेखीय invadosome गठन और कार्यक्षमता ( चित्रा 6 ) के लिए आवश्यक रिसेप्टर के रूप में परिभाषित करने की अनुमति देता है।
आंकड़े 3 और 7 ) भी विकसित किए हैं। इस परख हमें जे-स्टैक पुनर्निर्माण का उपयोग करके कोलेजन I प्लग में, और साथ ही दूरी की कूच की गई कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने की अनुमति देता है।
चित्रा 4: जिलेटिन और जिलेटिन-कोलाजेन की तुलना मैं मस्तिष्ककोशिका माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मैट्रिक्स को मिला। शीर्ष पैनल पर फ्लोरोसेंट जेलेटीन के कवरलिप्स के संगठन को दिखाए गए योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व ( ए ) कन्फोकल जेड-स्टैक पुनर्निर्माण दर्शाता है कि फ्लोरोसेंट जिलेटिन मैट्रिक्स एक पतली, एक समान परत बनाता है जो कंसलिप की पूरी सतह को कवर करता है। ( बी ) मिश्रित मैट्रिक्स में, कवरलीपों पर फ्लोरोसेंट जिलेटिन के बयान के बाद, टाइप करें मैं कोलेजन तंतुओंशीर्ष पर पॉलिमराइज़ करें कोलेजन मैं लाल रंग में लाल रंग में रंगा हुआ होता है। कोलेजन I मैट्रिक्स कंडोली पर मोटी और विषम है। कोलेजन I फाइबर का वितरण कोलेजन I α चेन के पोलीमराइजेशन पर निर्भर करता है। स्केल बार = 10 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 5: जिलेटिन और जिलेटिन-कोलेजन का प्रभाव, आविष्कारक गठन और गतिविधि पर मैट्रिक्स। इन assays के लिए इस्तेमाल कोशिकाओं एमडीए-एमबी -2011 स्तन कैंसर कोशिकाओं हैं ( ए ) एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व शीर्ष पैनल पर एक फ्लोरोसेंट जिलेटिन coverslip पर वर्गीकृत कोशिकाओं से पता चलता है प्रतिदीप्ति की कमी के कारण गिरावट वाले क्षेत्रों को काले रंग में देखा गया है। Tks5 धुंधला एक आविष्कारक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था जिलेटिन पर, invAdosomes कि फार्म डॉट्स के रूप में आयोजित कर रहे हैं। ( बी ) एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व जिलेटिन और कोलेजन आई के मिश्रित मैट्रिक्स पर वर्गीकृत कोशिकाओं से पता चलता है। कोलेजन I को लाल रंग दिया गया है; प्रकार मैं कोलेजन तंतुओं के अलावा जेलेटीन को नीचा करने के लिए सेल की क्षमता बढ़ जाती है। दिलचस्प बात यह है कि invadosome मार्कर Tks5 पुनर्गठन किया गया है, और डॉट्स रैखिक invadosomes का प्रतिनिधित्व रैखिक संरचनाओं द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैं। प्रतिदीप्ति की कमी के कारण गिरावट वाले क्षेत्रों को काले रंग में देखा गया है। स्केल बार = 5 सुक्ष्ममापी इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 6: आणविक संरचना और जिलेटिन और मिश्रित मैट्रिक्स दोनों परिस्थितियों में invadosomes के संगठन के confocal माइक्रोस्कोपी विश्लेषण। ( ए ) जी मेंएलाटिन हालत, इनडोडोओम्स को डॉट्स में व्यवस्थित किया जाता है, और एफ-एक्टिन (लाल) टीके 5 (ग्रीन, नीचे पैनल) के साथ सह-स्थानीयकरण करता है, लेकिन डीडीआर 1 (ग्रीन, टॉप पैनल) के साथ नहीं। ये शास्त्रीय invadosomes हैं स्केल सलाखों = 5 सुक्ष्ममापी ( बी ) जिलेटिन-कोलेजन में मिश्रित-मैट्रिक्स स्थिति, डीडीआर 1 (हरा, ऊपरी पैनल) कोलेजन I फाब्रिल (लाल, ऊपरी पैनल), टीके 5 (ग्रीन, निचला पैनल) और एफ-एक्टिन (लाल, नीचे पैनल)। प्रकार मैं कोलेजन तंतुओं रैखिक invadosomes के गठन को प्रेरित। स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 7: एक कोलेजन I प्लग में एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं के सेल आक्रमण परख। कोशिकाओं को बोने के बाद 1 घंटा, नियंत्रण आवेषण ठीक और दाग़ होते हैं। ( ए ) ज़-स्टैक एकोलाजेन के सिग्लाशन मैं प्लग confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जाता है। कोशिकाओं को कोलेजन पर आक्रमण नहीं करते जो मैं इस समय बिंदु पर प्लग करता हूं; बल्कि, वे कोलेजन I प्लग के शीर्ष पर रहते हैं। इस प्रकार, इसका उपयोग नियंत्रण समय बिंदु के रूप में किया जाता है जब कोई आक्रमण नहीं होता है। सेल के कोलेजन पर आक्रमण करने के लिए एमएमपी सक्रियण आवश्यक है I इस घनत्व पर प्लग करता है I ( बी ) बीज लगाने के तीन दिन बाद, कुछ कोशिकाओं को कोलेजन मैं प्लग में आक्रमण यह परख सेल आक्रमण के अवलोकन और मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, इसका उपयोग विभिन्न दवाओं या सीआरएनए के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए। स्केल बार = 20 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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Discussion
क्लासिकल, इनकोडोसोम का प्रयोग माइक्रोएनेयरमेंट और मैट्रिक्स के संबंध में इन विट्रो में किया जाता है, जिस पर कोशिका चढ़ायी जाती हैं। वर्तमान में कई प्रकार के मैट्रिक्स का उपयोग किया जाता है, जिसमें जिलेटिन, फाइब्रोनिक्टिन, विट्रोनेक्टिन या उच्च घनत्व फाइब्रिलर कोलेजन (एचडीएफसी) 7 , 11 ; हालांकि, ये अक्सर सूक्ष्म ऊर्जा का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं जिसमें कोशिकाएं निवास करती हैं और शारीरिक रूप से प्रासंगिक नहीं हैं। यहां, मैट्रिक्स का एक उपन्यास प्रकार, जिसमें जिलेटिन और फ़िबिलर टाइप आई कोलेजन के बीच एक संघ शामिल है, इसका इस्तेमाल किया गया था। टाइप I कोलेजन तंतुओं के उपयोग से हम एक आविष्कारक वर्ग, जिसे रैखिक invadosomes के रूप में जाना जाता है, को प्रकाशित करने की अनुमति देता है, जो कि विशेष रूप से कोलेजन 1 पर अपनी शारीरिक संरचना 7 में बना देता है । कोलेजन लेबलिंग मैं हमें फाइबर के साथ रैखिक invadosomes का निरीक्षण करने के लिए और Tks5 और cortactin जैसे सेलुलर मार्करों का उपयोग कर अपने गठन मात्रा निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है। मील का उपयोग करनाXed मैट्रिक्स, हमने एक नया रिसेप्टर, डिस्कोइडिन डोमेन रिसेप्टर 1 (डीडीआर 1), रैखिक invadosomes 8 के गठन में शामिल की पहचान की है
2 डी मिश्रित मैट्रिक्स हमें सीटू परख में zymography के माध्यम से रैखिक invadosomes की मैट्रिक्स गिरावट गतिविधि मात्रा ठहराना करने की अनुमति देता है। इस परख ने फ्लोरोसेंट जिलेटिन परत में ब्लैक होल की मौजूदगी का विश्लेषण करके एमएमपी की प्रोटीलाइज़ गतिविधि को बताया। दिलचस्प है, रैखिक invadosomes में एफ actin के संगठन मैट्रिक्स गिरावट गतिविधि जिलेटिन केवल 7 की तुलना में बढ़ जाती है। इस परख की एक सीमा यह है कि जिलेटिन एक गैर-शारीरिक मैट्रिक्स है, और यह दिखाया गया है कि एक अधिक शारीरिक मैट्रिक्स सूक्ष्म ऊर्जा के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया में परिवर्तन करता है। एक अतिरिक्त सीमा जिस तरह से एमएमपी गतिविधि जिलेटिन-कोलेजन पर मिश्रित मैट्रिक्स मिश्रित है, उसमें मौजूद है। केवल जेलेटीन गिरावट जो कोलेजन आई फाई के तहत स्थानीयकरण करता हैब्रिल परत मात्रा निर्धारित किया जा सकता है; इसलिए, यह कोलेजन I मैट्रिक्स डिग्रेडेशन को मापने के लिए एक अप्रत्यक्ष विधि है। रैखिक invadosomes की गिरावट गतिविधि कल्पना करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका कोलेजन मैं फाइबर कोलेजन cleavage साइटों के खिलाफ एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेबल (Col1- 3/4 सी, इम्युनोग्लोबुलिन) लेबल है। यह immunofluorescence द्वारा साफ किए गए तंतुओं के दृश्य के लिए अनुमति देता है। हालांकि, सेल प्रवासन के कारण, यह एंटीबॉडी रैखिक आविष्कारक गठन के कारण 2 डी में गिरावट के लिए बहुत विशिष्ट नहीं है। कोलेजन I फाइबर की गिरावट की गतिविधि को देखने और मापने का दूसरा तरीका मल्टीप्लटन माइक्रोस्कोपी और दूसरे हार्मोनिक पीढ़ी 8 का उपयोग करना है । इस विधि को किसी धुंधला होने के बिना कोलेजन I फाइबर के इमेजिंग के लिए अनुमति देता है।
पोलरमैराइज़िंग प्रकार मैं कोलेजन की हमारी पद्धति साहित्य 12 , 13 में इस्तेमाल की जाने वाली अन्य विधियों की तुलना में अलग है। उदाहरण के लिए, आर्टम सेल आक्रमण में रैखिक invadosomes की भागीदारी का अध्ययन करने के लिए, 3D कोलेजन मैं प्लग परख इस्तेमाल किया गया था। 3 डी कोलेजन मैं प्लग इनवेसिव संरचनाओं या आक्रमण प्रक्रिया 14 , 15 , 16 में मेटलॉप्रोटीनिस की भागीदारी के अध्ययन के लिए पहले ही वैज्ञानिक समुदाय द्वारा उपयोग किया जाता है। इन प्रकार के 3D मैट्रिक्स के बारे में thei संबंधित सीमाएं हैंR कठोरता - उदाहरण के लिए, 3 डी कोलेजन मैं प्लग 2 डी मैट्रिक्स से कम कठोर है। इसके अलावा, कोलेजन के प्रकार और उत्पत्ति विवो 17 में कोलेजन फाइबर के विभिन्न संगठन के बारे में भी महत्वपूर्ण है। अंत में, vivo में सूक्ष्म ऊर्जा संरचना के संबंध में, बाह्य मैट्रिक्स का केवल एक तत्व, प्रकार मैं कोलेजन, पर ध्यान केंद्रित किया गया था। विवो में रैखिक invadosomes की प्रासंगिकता निर्धारित करने के लिए आगे के अध्ययन आवश्यक है रैखिक invadosomes के अध्ययन के अलावा, मिश्रित मैट्रिक्स, जो यहाँ वर्णित है, अन्य प्रकार के मैट्रिक्स घटकों जैसे फाइब्रोनिक्टिन, विट्रोनेक्टिन, और अन्य प्रकार के कोलेजन ( जैसे, टाइप IV कोलेजन) के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का अनुकूलन किया जा सकता है, जो कि मैट्रिक्स तत्वों के प्रकार, जो ब्याज के हैं और प्रक्रियाओं का अध्ययन किया जाना चाहिए। हालांकि, यह स्पष्ट है कि जटिल और शारीरिक मैट्रिक्स उत्पन्न करने से ईई के पहचान की अनुमति होगीसेल आसंजन, प्रवास, और आक्रमण में शामिल मार्ग।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
जेडीएम को INSERM / क्षेत्र एक्विटेन से पीएचडी फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था और अब एक पोस्ट-डॉक्टरेट एआरसी फेलोशिप और माउंट सिनाई स्कूल ऑफ मेडीसिन में Tisch कैंसर इंस्टीट्यूट द्वारा समर्थित है। ईएच को पीएचडी द्वारा समर्थित है मिनिस्टेरे डी ल एन एनिसिमेंट सुपरएरीयर एट डे ला रिकेर। एसजीईई एजेंस नेशनेल डी ला रिकशे (एएनआर) से पोस्ट डॉक्टरेट फेलोशिप द्वारा समर्थित है। मुख्यमंत्री को माईंट सिनाई स्कूल ऑफ मेडिसिन में Tisch कैंसर इंस्टीट्यूट द्वारा समर्थित है और जे जे बी सी एनआईएच / एनसीआई अनुदान K22CA196750, टीसीआई यंग साइंटिस्ट कैंसर रिसर्च अवार्ड जेजेआरआर फंड और माउंट सिनाई स्कूल ऑफ मेडीसिन में Tisch कैंसर संस्थान द्वारा समर्थित है। यह काम ANR-13-JJC-JSV1-0005 से अनुदान द्वारा समर्थित था। एफएस "लीग नेशनलली कॉन्ट्रे ले कैंसर" द्वारा समर्थित है। वीएम और एफएस "इक्ूइप लेबेलिसि लीग नेशनेल कॉन्ट्रै ले कैंसर 2016" और इन्स्टिट्यूट नेशनल डु कैंसर, इंकै_8036, और पीएलबीओ2012 से फंडिंग द्वारा समर्थित हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin solution | Sigma | G1393 | Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml |
| Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate | Molecular probe life technologies | G13186 | 5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water |
| Microscope cover glasses | Marlenfeld GmbH & Co | 111520 | Ø12mm No.1 |
| 2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4 | Electron microscopy science | 15960 | Dilute at 0.5 % in sterile water |
| 1x PBS pH 7.4 | Gibco by life technologies | 10010-015 | Use this PBS in all steps before fixation |
| Collagen I Rat tail | Corning | 354236 | |
| 5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester | Life technologies | C-6125 | |
| DPBS 1x + calcium + magnesium | Gibco by life technologies | 14040-091 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron microscopy science | 15710 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
| 10x PBS buffer pH 7.4 | Ambion | AM9625 | Dilute at 1X in water Use in steps after fixation |
| Tks5 antibody | Santa Cruz | sc-30122 | Invadosome markers Dilution : 1/100 |
| Cortactin 4F11 antibody | Millipore | 5180 | Invadosome markers Dilution :1/100 |
| DDR1 antibody | Cell signaling | 5583 | Linear invadosome receptor |
| Dilution :1/100 | |||
| Phalloidin FluoProbes | Interchim | FT-AZ0330 | Fibrillary actin marker Dilution :1/200 |
| Hoechst | Sigma | 33258 | Nucleus marker Dilution :1/200 |
| Secondary antibodies FluoProbes | Interchim | FP-488 FP-547H or FP-647H | |
| Albumin from bovine serum | Sigma | A2153 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Fluoromount G mounting medium | Interchim | FP 483331 | |
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| Cell culture insert | Corning | 353097 | 8.0µm pore size / 24 wells |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 221465 |
References
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