Summary
Dit protocol beschrijft hoe u een 2D gemengde matrix voorbereidt, bestaande uit gelatine en collageen I, en een 3D collageen I plug om lineaire invadosomen te bestuderen. Deze protocollen staan voor de studie van lineaire invadosoomvorming, matrixdegradatieactiviteit en de invasiemogelijkheden van primaire cellen en kankercellijnen.
Abstract
Celhechting, migratie en invasie zijn betrokken bij veel fysiologische en pathologische processen. Bijvoorbeeld bij de vorming van de metastase moeten tumorcellen anatomische barrières oversteken om in te vallen en door het omringende weefsel te migreren om bloed of lymfevaten te bereiken. Dit vereist de interactie tussen cellen en de extracellulaire matrix (ECM). Op cellulaire niveau kunnen veel cellen, waaronder de meerderheid van de kankercellen invadosomen vormen, die F-actin gebaseerde structuren vormen die ECM kunnen degraderen. Invadosomen zijn protrusieve actin structuren die matrix metalloproteinases (MMPs) werven en activeren. De moleculaire samenstelling, dichtheid, organisatie en stijfheid van de ECM zijn cruciaal bij het reguleren van invadosome vorming en activatie. In vitro is een gelatine-assay de standaardassess die gebruikt wordt om invadosome degradatieactiviteit te observeren en te kwantificeren. Gelatine, die gedenatureerd collageen I is, is echter geen fysiologische matrix element. Een nieuwe test met behulp van type I collageenfibrillen werd ontwikkeld en gebruikt om aan te tonen dat deze fysiologische matrix een krachtige inductor van invadosomen is. Invadosomen die langs de collageenfibrillen vormen, staan bekend als lineaire invadosomen door hun lineaire organisatie op de vezels. Bovendien liet de moleculaire analyse van lineaire invadosomen zien dat de discoidin-domeinreceptor 1 (DDR1) de receptor is die bij hun vorming betrokken is. Deze gegevens tonen duidelijk aan het belang van het gebruik van een fysiologisch relevante matrix om de complexe interacties tussen cellen en de ECM te begrijpen.
Introduction
Extracellulaire matrix (ECM) remodeling komt voor tijdens fysiologische en pathologische processen, zoals angiogenese en tumorcel invasie. In fysiologische omstandigheden kunnen veel celltypes, meestal uit de hematopoietische afstamming, ECM-elementen afbreken. Macrofagen kunnen bijvoorbeeld anatomische barrières oversteken om weefsels te bereiken, en osteoclasten verlagen botmatrix om calciumhomeostase te waarborgen. Wereldwijd vernieuwen alle matrices in het lichaam hun fysieke en chemische eigenschappen. In kankerweefsels verandert de micro-omgeving van de tumor. Bijvoorbeeld bij borst- en longkanker wordt type I collageen overexpresseerd en verzamelt zich rond de tumor. Bovendien is deze accumulatie geassocieerd met een verhoogd risico op het ontwikkelen van metastase 1 , 2 . Kankermetastase is afhankelijk van het vermogen van kankercellen om de ECM te degraderen en aanliggende weefsels te invallen.
DeInvasieve activiteit van cellen wordt toegeschreven aan gespecialiseerde actinrijke structuren die bekend staan als invadosomen. Deze term omvat podosomen en invadopodia, die respectievelijk aanwezig zijn in normale en kankercellen (bijvoorbeeld macrofagen , endotheelcellen en kankercellen zoals de MDA-MB-231 borstkanker cellijn). In vitro kunnen invadosomen in verschillende vormen organiseren: stippen, aggregaten of rozetten 3 . Klassiek zijn invadosomen samengesteld uit een F-actin-kern die verscheidene eiwitten bevat, zoals het steigerproteïne Tks5 en cortactine, omringd door hechtingsplaatmoleculen, zoals integrins en vinculine 4 . Recent werd aangetoond dat Tks5 en de RhoGTPase Cdc42 als minimum moleculaire handtekening voor functionele invadosomen 5 kunnen worden gebruikt. Deze structuren zijn in staat om de ECM te degraderen via de werving en activatie van specifieke metalloprotease-eiwitten, zoals MT1-MMP en MMP-2 6. In een eerdere studie hebben we gemeld dat de interactie tussen type I collageenfibrillen en de discoidin domeinreceptor 1 (DDR1), een specifieke receptor van type I collageenfibrillen, leidt tot de vorming van een nieuwe klasse invadosomen, genaamd lineaire invadosomen. Lineaire invadosomen worden gevormd langs type I collageenfibrillen 7 . Deze structuren kunnen type I collageenfibrillen afbreken via de werving en activering van MT1-MMP / MMP2. Bovendien is hun vorming afhankelijk van Tks5 en Cdc42 5 . In vitro hebben we het bestaan van lineaire invadosomen en de betrokkenheid van DDR1 in hun vorming en activiteit 8 aangetoond door gebruik te maken van verschillende strategieën die bestaan uit een combinatie van verschillende matrixelementen, waaronder: i) fluorescerende gelatinecoated deklagen, ii) collageenfibril fluorescent type I -coated coverlips, en iii) 3D type I collageen pluggen. Door het gebruik van verschillende matrices waren we in staat om te studeren en karakterIze lineaire invadosome vorming en hun afbraakactiviteit 7 , 8 .
Tenslotte, om de biologie van invasieve cellen beter te begrijpen, werden een combinatie van ECM-componenten in zowel 2D- als 3D-cultuursystemen gebruikt, die de complexiteit van de micro-milieusamenstelling van de tumor nabootsen. Hieronder staan protocollen voor coatingslips met gelatine / type I collageen in 2D en 3D-cultuur systemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alvorens de fixatie te voltooien, worden alle stappen ingevuld in een steriele laminaire stroomkap.
1. 2D matrix
OPMERKING: 2D matrices worden gebruikt om het percentage cellen te bepalen die invadosomen vormen en het matrixafbraakgebied per cel bepalen.
Figuur 1: Protocol. Samenvatting van het protocol dat wordt gebruikt om gelatine- en collageen I-matrices te bereiden. Het is mogelijk om alleen de gelatine matrix of een gelatine- en collageen I gemengde matrix te maken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Gelatine matrix
OPMERKING: Fluorescerende gelatine matrices worden gebruikt om matrixdegradatie te kwantificeren, en niet-fluorescerende gelatine wordt gebruikt om de hechting van collageen I vezels te bevorderen. Fluorescerende gelatine matRijstjes worden ook gebruikt voor podosome en invadopodia studies (zie figuur 1 ).- Plaats onder een steriele laminaatstroomkapje een stuk parafilm (20 cm x 15 cm) op het werkgebied en desinfecteer het met 70% ethanol.
- Aliquot 20 μL druppels van 1 mg / ml gelatine in een lijn, op afstand ongeveer 1 cm van elkaar; Verwijzen naar figuur 1 voor druppelorganisatie.
- Bedek elke 20 μL gelatine druppel met een geautoclaveerde glazen deklaag (12 mm in diameter).
- Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Als de gelatine fluorescent is, bescherm het tegen licht.
- Aliquot 40 μL druppels van 0,5% glutaraldehyde in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) in een lijn, die elk ongeveer 1 cm onder de lijn van de dekglazen van stap 1.1.3 liggen.
VOORZICHTIG: Glutaraldehyde is een giftig fixatief middel. Gebruik handschoenen en niet inademen. - Met behulp van juwelkleurige pennen, overdragen elke gelatine bedekte deklaag naar een glutaraldehyde druppel.
Noteer hetIs normaal dat een kleine gelatine druppel op de parafilm blijft. Gebruik dit niet opnieuw voor een ander experiment. - Incubeer gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur. Voor fluorescerende deklagen, bescherm ze tegen licht.
- Neem een 24-putjes celkweekplaat en vul elke put met 500 μL steriele 1x PBS. Leg de dekglazen, gelatine kant omhoog, in elke put.
- Wassen twee keer in 1x PBS gedurende 5 minuten elk.
OPMERKING: Bij deze stap kunnen de deklagen worden gebruikt voor experimenten of opgeslagen in 1x PBS bij 4 ° C. Niet-fluorescerende deklagen kunnen voor een week worden opgeslagen, en fluorescerende deklips kunnen 48 uur opgeslagen worden.
- Fibriele collageen type I matrix
OPMERKING: Fibriele collageen type I matrix wordt gebruikt om lineaire invadosoomvorming en de bijbehorende matrixdegradatie te bestuderen. Een combinatie van fluorescerende collageen I en niet-fluorescerende gelatine deksellips wordt gebruikt om invadosom markers te co-localiseren met collageenvezels (bijvoorbeeld F-actine iN het verre rode kanaal, collageen I in het rode kanaal, Tks5 in het groene kanaal en Hoechst verven voor een kernvlek). Aan de andere kant wordt een combinatie van niet-fluorescerende collageen I met niet-fluorescerende gelatine-deklagen gebruikt om het aantal geïnduceerde invadosoommarkers te maximaliseren (bijvoorbeeld F-actine in het verre rode kanaal, cortactine in het rode kanaal, Tks5 in Het groene kanaal en Hoechst kleurstof voor een kernvlek). Tenslotte wordt een combinatie van niet-fluorescerende collageen I met fluorescerende gelatine-deklagen gebruikt om de gelatine-geassocieerde afbraak te kwantificeren (bijvoorbeeld F-actine in het verre kanaal, Tks5 in het rode kanaal, in het groene kanaal en Hoechst-kleurstof Voor een kernvlek) (zie figuur 1). Hoechst-kleurstof is gebruikt om de kern te vleken, en controleert ook op mycoplasma-verontreiniging, naast een PCR-test die regelmatig wordt uitgevoerd op de gebruikte cellijnen.- Fluorescerende collageen I
- Gebruik commercieel collageen I geëxtraheerd uit rat-tail pezen in 0,02 N acetic acidd. Verwijder de hoeveelheid collageen die ik nodig heb om 500 μL oplossing per deklaag te bereiden bij een uiteindelijke concentratie van 0,4 mg / ml collageen I.
- Voeg 5-carboxy x rhodamine succinimidyl ester toe bij een uiteindelijke concentratie van 10 μg / ml, berekend voor het uiteindelijke volume van collageen I oplossing (nx 500 μl).
- Meng de oplossing door pipettering omhoog en omlaag en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
- Verdun tot het eindvolume met 1X Dulbecco's fosfaatbufferde zoutoplossing (DPBS) die calcium en magnesium bevat en direct gebruiken.
- Fibrillair collageen I deklaag
- Gebruik de niet-fluorescerende of fluorescerende gelatine deklagen die eerder in stap 1.1 zijn voorbereid.
- Bereid een oplossing van fluorescerende of niet-fluorescerende collageen I bij een uiteindelijke concentratie van 0,4 mg / ml in 1X DPBS die calcium en magnesium bevatten.
- Voeg 500 μL fluorescerende of niet-fluorescerende collageen I oplossing perDeklip in een celkweekplaat met 24 putjes.
- Incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C voor collageen I-polymerisatie.
- Verwijder na het incuberen het overtollige collageen I door de plaat en de pipettering aan de zijkant van de put te kantelen (niet direct op de deklaag) om de matrix te beschadigen.
OPMERKING: Deze matrix kan niet worden opgeslagen. Zaad de cellen onmiddellijk na het verwijderen van overtollig collageen I.
- Fluorescerende collageen I
2. Cellseeding, tijd van cultuur en fixatie
- Afhankelijk van het celtype, bereid de cellen in het geschikte kweekmedium en voeg cellen toe voor een eindvolume van 500 μl per putje.
- Om de capaciteit van een cellijn te vormen om lineaire invadosomen te vormen en de matrix te degraderen, plaatst u de cellen gedurende 4 uur, 12 uur en 24 uur op collageen I matrix om de kinetiek van lineaire invadosoomvorming en de bijbehorende afbraakactiviteit te bepalen.
OPMERKING: Tabel 1 bevat voorbeelden van cellijnenGetest in het laboratorium.
Tabel 1: Cellseeding en incubatietijdreferentie. Deze tabel bevat een niet-exhaustieve lijst van cellijnen die worden gebruikt om lineaire invadosomen te bestuderen. Het geeft het aantal cellen aan zaad op de matrix aan, de tijd die nodig is om lineaire invadosomen te waarnemen en de tijd die nodig is om de bijbehorende matrixdegradatie te waarnemen. Lineaire invadosomen hebben een korte levensduur. Om lineaire invadosomen in het maximale aantal cellen te kunnen observeren, moeten de cellen gedurende een korte tijd in contact staan met de collageenmatrix. Aan de andere kant, om de gerapporteerde gelatine degradatie te kunnen visualiseren, moeten de cellen gedurende een langere tijd in contact komen met de collageenmatrix dan die welke hierboven zijn vermeld.Cellijn Aantal cellen per coverlip Tijd van contact met matrix voor lineaire invadosoom kwantificering Tijd van contact met matrix voor kwantificering van lineaire invadosoom degradatie activiteit MDA MB 231 40.000 4 uur 12 uur HUH7cellen 40.000 12 uur 24 uur HEP 3B 40.000 12 uur 24 uur SNU 398 40.000 12 uur 24 uur NIH 3T3 src 30.000 4 uur 12 uur A431 50.000 6 uur 24 uur A549 40.000 12 uur 24 uur &# 160; RAW 40.000 12 uur 12 uur PAE 40.000 12 uur 12 uur - Na de verwijdering van het celkweekmedium,Reinig de dekglazen gedurende 10 minuten in 500 μl 4% paraformaldehyde in 1X PBS.
- Was twee keer met 1x PBS.
- Bewaar bij 4 ° C, beschermd tegen licht.
3. Immunofluorescentie
- Permeabiliseer de cellen gedurende 10 minuten met een vers bereide oplossing Van 0,2% Triton X-100 in 1x PBS. Gebruik deze oplossing niet opnieuw.
- Was de deklips tweemaal met 1x PBS.
- Plaats een stuk parafilm (20 cm x 15 cm) op de bank.
- Verdun primair antilichaam in 4% boviene serumalbumine (BSA) in 1x PBS, zoals beschreven in de Material Table .
- Aliquot 50 μL druppels van primaire antilichaamoplossing in een lijn, elk op een afstand van ongeveer 1 cm van elkaar.
- Plaats elke deklaag op een druppel.
- Incubeer gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
- Na de incubatieperiode wassen twee keer met 1x PBS.
- Verdun het secundaire antilichaam, phalloidine en Hoechst-kleurstof in 4% BSA in 1xPBS.
- Aliquot 50 μL druppels van de mix, elk van elkaar geplaatst ongeveer 1 cm onder de eerste lijn van de dekglazen, zoals eerder gedaan.
- Plaats elke deklaag op een druppel.
- Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
- Na incubatie, wassen twee keer met 1x PBS.
- Was eens met gedestilleerd water om de zouten te verwijderen.
- Monteer de deklagen op een glazen glijbaan met polymerisatie montage medium.
- Laat de dekglazen overnachten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, voor microscopie.
4. Kwantificaties
Figuur 2: Lineaire invadosome kwantificering. De macro vereist confocale beelden van F-actin en Tks5-kleuring (formaat: 1.024 x 1.024). ( A ) Eerst, open de F-actin foto en maak een masker. ( B ) Open danDe Tks5 foto en drempel het. Pas de macro toe. ( C ) Geanalyseerde resultaten worden in twee tabellen weergegeven. Het aantal lineaire invadosomen per cel en andere informatie, zoals het percentage gebied dat wordt gebruikt door lineaire invadosomen in de cel, staat in de samenvattingstabel. De grootte van elke lineaire invadosoom komt in de tabel Resultaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Percentage cellen die lineaire invadosomen vormen
- Tel de cellen die lineaire invadosomen vormen, ongeveer 100 cellen per deklaag (gebruik technische triplicaten). Kwantificeer tenminste 300 cellen per n, met n = 3.
- Bereken het percentage cellen dat lineaire invadosomen vormt door het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten te berekenen, wat resulteert in 900 gekwantificeerde cellen.
- Lineaire invadosoomgrootte en aantal per cel
- Gebruik ImageJ met de aanvullende macro.
- Gebruik drie deklips per voorwaarde.
- Neem 30 afbeeldingen per deklaag van fluorescerende gelatine en Hoechst-gekleurde kernen.
- Gebruik de ImageJ software zoals beschreven in Martin KH et al. 9 .
5. 3D-collageen Invasion Assay
Figuur 3: Invasie assay schema. Samenvatting van het invasie assay protocol. Collageen I is verknoopt met succinimidylester kleurstof en gepolymeriseerd gedurende 1 uur bij 37 ° C. Cellen worden toegevoegd in serumvrij medium bovenop de collageen I-stekker. Het inzetstuk wordt in medium wi geplaatstDe 10% FBS. Collageen I proppen worden 1 uur vastgelegd na het zaaien van cellen in de controle en 3 dagen na het zaaien van cellen in de experimentele conditie om de invasiecapaciteit van de cellen te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Collageen I plug voorbereiding
- Maak een tijdsbaan van 4 uur, 12 uur, 24 uur, 48 uur en 72 uur voor het eerste experiment om de kinetiek van invasie in de gel volgens het celtype te bepalen. Voor elk experiment voegt u een 1 h tijdspunt toe als referentie tijdpunt wanneer er geen invasie plaatsvindt.
- Bereid de collageen I oplossing op ijs onder een steriele laminar flow hood. Bereid 500 μL oplossing voor 3 Boyden kamerinzetten.
- Aspireren 1 mg commercieel rat-staart collageen I om een oplossing te bereiden met een uiteindelijke concentratie van 2 mg / ml collageen I.
- Voeg 5-carboxy x Rhodamine succinimidyl ester bijEen uiteindelijke concentratie van 1 μg / ml, berekend voor het uiteindelijke volume van collageen I oplossing (in dit geval 500 μl).
- Meng goed en incubeer gedurende 5 minuten op ijs onder de steriele laminaire stroomkap, beschermd tegen licht.
- Voeg 50 μl ijskoud, gefilterd 10X PBS en 6,25 μl ijskoud 1 M natriumhydroxide (NaOH) toe.
- Voeg steriel water volgens de formule 443.75 - x ul collageen I.
- Voeg 100 μL oplossing per Boyden kamerinzet toe.
- Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C om polymerisatie mogelijk te maken.
- Voeg celcultuurmedium verrijkt met foetaal runder serum (FBS) in nieuwe putjes toe; Plaats inzetstukken in deze putjes.
- Zaad 30.000 cellen bovenop het collageen. Ik steek het FBS-vrije medium in.
- Nadat u de cellen bij 37 ° C hebt gekweekt, fixeer de collageen I-plug gedurende 30 minuten in 4% paraformaldehyde in 1x PBS.
- Volledige immunofluorescentie zoals in stap 3, met uitzondering van de volgende stappen: permeabiliZe met 0,2% Triton X-100 in 1x PBS gedurende 30 minuten, niet 10 minuten; Incuberen met primaire en secundaire antilichaamoplossingen gedurende 1,5 uur elk, in plaats van respectievelijk 40 minuten en 30 minuten. Vlek voor F-actine of kernen om de cellen te lokaliseren.
- Na immunofluorescentie, gebruik een scalpel om het membraan van het inzetstuk te snijden en zorg ervoor dat de collageen I-stekker voorzichtig overgaat naar een glazen bodemschotel. Zorg ervoor dat de bovenkant van de collageen I-stekker in contact is met het glas. Houd het inzetmembraan vast aan de onderkant van de collageen I-stekker om de integriteit van de stekker te handhaven.
OPMERKING: De collageen I-stekker blijft intact in de glasbodemschotel. De diepte tussen de glazen bodem en het plastic rondom de glazen bodem is gelijk aan de dikte van de stekker. - Plaats een deksel op de collageen die ik stekker en monteer met polymerisatie montage medium om te voorkomen dat de stekker uitdroogt.
- Gebruik een omgekeerde confocale microscoop om de collageen die ik stekker aan te geven; de top vanDe stekker is in contact met de glazen bodem van de schotel.
- Verkrijg een z-stapel van de top naar de onderkant van het collageen, ik plug in om de invasie van een cel te visualiseren. Bepaal de dikte van de z-stapel door te onderzoeken hoe diep de cellen het beeldgebied binnendringen. Doe acquisities met een 40X olie doelstelling in een 512 x 512 formaat met een z-step grootte van 0.25 μm.
OPMERKING: ter referentie is de gemiddelde z-stapel voor MDA-MB-231 cellen 3 dagen na het zaaien 30 μm.
- Verkrijg een z-stapel van de top naar de onderkant van het collageen, ik plug in om de invasie van een cel te visualiseren. Bepaal de dikte van de z-stapel door te onderzoeken hoe diep de cellen het beeldgebied binnendringen. Doe acquisities met een 40X olie doelstelling in een 512 x 512 formaat met een z-step grootte van 0.25 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van een combinatie van twee soorten matrices, gelatine en type I collageen ( figuren 1 en 4 ) hebben we een nieuw type invadosome, bekend als lineaire invadosomen, gemarkeerd. De etikettering van deze matrices zorgt voor de observatie van lineaire invadosome vorming langs collageen I vezels en van hun afbreekmogelijkheden ( Figuur 5 ). Het aantal invasieve structuren kan dan gekwantificeerd worden door de eerder beschreven macro (stap 4.2), en de afbraakactiviteit kan ook worden bepaald met behulp van de ImageJ software, zoals beschreven door Martin et al. En Diaz et al. 9 , 10 . De gemengde matrix laat de karakterisering van lineaire invadosomen toe door DDR1 te definiëren als de receptor die nodig is voor lineaire invadosoomvorming en functionaliteit ( Figuur 6 ).
Figuren 3 en 7 ). Met deze analyse kunnen we het aantal cellen bepalen die in de collageen I-stekker zijn binnengevallen, evenals de afstand die is gereisd, door z-stack reconstructies te gebruiken.
Figuur 4: Vergelijking van gelatine en gelatine-collageen I gemengde matrices met behulp van confocale microscopie. Schematische weergave die de organisatie toont van fluorescerende gelatine-deklagen op het bovenpaneel. ( A ) Confocal z-stack reconstructie demonstreert dat de fluorescerende gelatine matrix een dunne, uniforme laag vormt die het gehele oppervlak van de deklaag dek. ( B ) In de gemengde matrix, na de afzetting van fluorescerende gelatine op de dekglazen, typen collageenfibrillen van type IPolymeriseren bovenop. De collageen I fibrillen zijn in rood gekleurd. De collageen I-matrix is dik en heterogeen op de deklaag. De verdeling van de collageen I vezels is afhankelijk van de polymerisatie van collageen I a-ketens. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Impact van gelatine- en gelatine-collageen I-matrices op invadosome vorming en activiteit. De cellen die voor deze analyses worden gebruikt zijn MDA-MB-231 borstkankercellen. ( A ) Een schematische weergave toont cellen die op een fluorescerende gelatine-deklaag op het bovenpaneel zaaien. Afbreekpunten worden in zwart weergegeven door de vermindering van de fluorescentie. Tks5-kleuring werd gebruikt als een invadosome marker. Op gelatine, de invAdosomen die vorm zijn georganiseerd als punten. ( B ) Een schematische weergave toont cellen die op een gemengde matrix gelatine en collageen worden gezaaid. Collage I is in rood gemerkt; De toevoeging van type I collageenfibrillen verhoogt het vermogen van de cel om gelatine te degraderen. Interessant is de invadosome marker Tks5 gereorganiseerd, en de punten worden vervangen door lineaire structuren die lineaire invadosomen vertegenwoordigen. Afbreekpunten worden in zwart weergegeven door de vermindering van de fluorescentie. Schaalbalk = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Confocal microscopie analyse van de moleculaire samenstelling en de organisatie van invadosomen in zowel gelatine als gemengde-matrix omstandigheden. ( A ) In de gElatine conditie, invadosomen zijn georganiseerd in stippen, en F-actin (rood) co-lokaliseert met Tks5 (groen, onderpaneel), maar niet met DDR1 (groen, bovenpaneel). Dit zijn klassieke invadosomen. Schaalstaven = 5 μm. ( B ) In de gelatine-collageen coördineert DDR1 (groen, bovenpaneel) met de collageen I fibrillen (rood, bovenpaneel), Tks5 (groen, onderpaneel) en F-actine (rood, bodem paneel). De collageenfibrillen van type I veroorzaken de vorming van lineaire invadosomen. Schaalstaven = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Cel-invasieassay van MDA-MB-231 cellen in een collageen I-stekker. 1 uur na het zaaien van de cellen, zijn de controle inserts vast en gekleurd. ( A ) z-stap aVerklaring van de collageen I-plug wordt uitgevoerd met behulp van confocale microscopie. De cellen invallen niet de collageen die ik op dit tijdstip installeer; In plaats daarvan blijven ze bovenop de collageen die ik stekker. Zo wordt dit gebruikt als het controletijdpunt wanneer er geen invasie plaatsvindt. MMP-activering is nodig voor de cellen om een collageen-I-stekker op deze dichtheid in te vallen. ( B ) Drie dagen na het zaaien, invallen sommige cellen de collageen I plug. Deze analyse maakt het mogelijk de waarneming en kwantificering van celinval te waarborgen. Daarnaast kan het gebruikt worden om de impact van verschillende drugs of siRNA's bijvoorbeeld te bestuderen. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Klassiek worden invadosomen in vitro bestudeerd, zonder inachtneming van de micro-omgeving en de matrix waarop de cellen zijn geplateerd. Verschillende soorten matrices worden momenteel gebruikt, waaronder gelatine, fibronectine, vitronectine of hoge dichtheidsfibrillair collageen (HDFC) 7 , 11 ; Echter zijn deze vaak niet representatief voor de micro-omgeving waarin cellen zich bevinden en niet fysiologisch relevant zijn. Hier wordt een nieuw type matrix gebruikt, dat bestaat uit een associatie tussen gelatine- en fibrillair type I collageen. Het gebruik van collagenfibrillen van type I stelt ons in staat om een nieuwe klasse invadosomen te markeren, bekend als lineaire invadosomen, die specifiek op collageen I vormen in zijn fysiologische architectuur 7 . Het labelen van de collageen Ik laat ons toe om lineaire invadosomen langs de vezels te observeren en hun vorming te kwantificeren met behulp van cellulaire markers zoals Tks5 en cortactine. Met behulp van de miXed matrix, hebben we een nieuwe receptor geïdentificeerd, de discoidin domeinreceptor 1 (DDR1), betrokken bij de vorming van lineaire invadosomen 8 .
De 2D gemengde matrix stelt ons in staat om de matrixdegradatieactiviteit van lineaire invadosomen te kwantificeren via de zymografie in situ- analyse. Deze test rapporteert de proteolyse activiteit van MMPs door de aanwezigheid van zwarte gaten in de fluorescerende gelatine laag te analyseren. Interessant, de organisatie van F-actine in lineaire invadosomen verhoogt de matrixdegradatieactiviteit in vergelijking met alleen gelatine 7 . Een beperking van deze analyse is dat de gelatine een niet-fysiologische matrix is, en aangetoond is dat een meer fysiologische matrix de cellulaire respons op de micro-omgeving verandert. Er bestaat een aanvullende beperking op de manier waarop MMP-activiteit wordt gekwantificeerd op de gemengde matrices van gelatine-collageen I. Alleen de gelatine degradatie die lokaliseert onder het collageen I fiBril laag kan worden gekwantificeerd; Daarom is dit een indirecte methode om de collageen I-matrixafbraak te kwantificeren. Een alternatieve methode om de afbraakactiviteit van lineaire invadosomen te visualiseren is om de collageen I vezels met een specifiek antilichaam tegen collageen splitsingsplaatsen (Col1-3 /4 C, immunoglobuline) te labelen. Dit zorgt voor het visualiseren van gespleten vezels door immunofluorescentie. Echter, door celmigratie is dit antilichaam niet erg specifiek in 2D voor degradatie als gevolg van lineaire invadosoomvorming. Een andere manier om de afbraakactiviteit van de collageen I vezels te visualiseren en te kwantificeren is het gebruik van multiphoton microscopie en tweede harmonische generatie 8 . Deze methode zorgt voor het imaging van collageen I vezels zonder kleuring.
Onze werkwijze voor het polymeriseren van type I collageen is verschillend in vergelijking met andere methoden die in de literatuur 12 , 13 gebruikt worden . Bijvoorbeeld, Artym Om de betrokkenheid van lineaire invadosomen bij celinfaratie te bestuderen, werd de 3D collageen I plug-test gebruikt. De 3D collageen I plug wordt al gebruikt door de wetenschappelijke gemeenschap om invasieve structuren of de betrokkenheid van metalloproteinasen in het invasieproces 14 , 15 , 16 te bestuderen. Deze typen 3D matrices hebben beperkingen ten aanzien van dezeR stijfheid-bijvoorbeeld, de 3D collageen I plug is minder rigide dan de 2D matrix. Bovendien is het type en de oorsprong van het collageen I ook belangrijk met betrekking tot de verschillende organisatie van collageenvezels in vivo 17 . Ten slotte, ten aanzien van de micro-milieusamenstelling in vivo , was er slechts één element van de extracellulaire matrix, het type I collageen, gericht op. Verdere studie is nodig om de relevantie van lineaire invadosomen in vivo te bepalen . Naast de studie van lineaire invadosomen zou de gemengde matrix die hierin beschreven wordt, kunnen worden gebruikt met andere typen matrixcomponenten, zoals fibronectine, vitronectine en andere soorten collagenen (bijvoorbeeld type IV collageen). Dit protocol kan worden aangepast, afhankelijk van de typen matrixelementen die van belang zijn en de processen die moeten worden bestudeerd. Het is echter duidelijk dat het genereren van complexe en fysiologische matrices de identificatie van ne mogelijk maaktW pathways betrokken bij celadhesie, migratie en invasie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
JDM werd ondersteund door een PhD-fellowship van INSERM / Région Aquitaine en wordt nu ondersteund door een post-doctorale ARC-gemeenschap en het Tischkankerinstituut aan de Sinai School of Medicine. EH wordt ondersteund door een promovendus van de Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. ZE wordt ondersteund door een postdoctorale gemeenschap van Agence Nationale de la Recherche (ANR). CM wordt ondersteund door het Tischkankerinstituut aan de Mount Sinai School of Medicine en JJBC wordt ondersteund door de NIH / NCI-subsidie K22CA196750, het JRR-fonds voor Kankeronderzoek TCI Young, en het Tischkankerinstituut aan de Sinai School of Medicine. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van ANR-13-JJC-JSV1-0005. FS wordt ondersteund door de "Ligue nationale contre le cancer". VM en FS worden ondersteund door financiering van "Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016" en Institut National du Cancer, INCA_8036 en PLBio2012.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin solution | Sigma | G1393 | Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml |
| Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate | Molecular probe life technologies | G13186 | 5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water |
| Microscope cover glasses | Marlenfeld GmbH & Co | 111520 | Ø12mm No.1 |
| 2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4 | Electron microscopy science | 15960 | Dilute at 0.5 % in sterile water |
| 1x PBS pH 7.4 | Gibco by life technologies | 10010-015 | Use this PBS in all steps before fixation |
| Collagen I Rat tail | Corning | 354236 | |
| 5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester | Life technologies | C-6125 | |
| DPBS 1x + calcium + magnesium | Gibco by life technologies | 14040-091 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron microscopy science | 15710 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
| 10x PBS buffer pH 7.4 | Ambion | AM9625 | Dilute at 1X in water Use in steps after fixation |
| Tks5 antibody | Santa Cruz | sc-30122 | Invadosome markers Dilution : 1/100 |
| Cortactin 4F11 antibody | Millipore | 5180 | Invadosome markers Dilution :1/100 |
| DDR1 antibody | Cell signaling | 5583 | Linear invadosome receptor |
| Dilution :1/100 | |||
| Phalloidin FluoProbes | Interchim | FT-AZ0330 | Fibrillary actin marker Dilution :1/200 |
| Hoechst | Sigma | 33258 | Nucleus marker Dilution :1/200 |
| Secondary antibodies FluoProbes | Interchim | FP-488 FP-547H or FP-647H | |
| Albumin from bovine serum | Sigma | A2153 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Fluoromount G mounting medium | Interchim | FP 483331 | |
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| Cell culture insert | Corning | 353097 | 8.0µm pore size / 24 wells |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 221465 |
References
- Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-54 (2003).
- Gilkes, D. M., et al. Collagen prolyl hydroxylases are essential for breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 3285-3296 (2013).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 185-211 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Di Martino, J., et al. Cdc42 and Tks5: a minimal and universal molecular signature for functional invadosomes. Cell Adh. Migr. 8, 280-292 (2014).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. J. Cell Sci. 122, 3015-3024 (2009).
- Juin, A., et al. Physiological type I collagen organization induces the formation of a novel class of linear invadosomes. Mol. Biol. Cell. 23, 297-309 (2012).
- Juin, A., et al. Discoidin domain receptor 1 controls linear invadosome formation via a Cdc42-Tuba pathway. J. Cell Biol. 207, 517-533 (2014).
- Martin, K. H., et al. Quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts. J. Vis. Exp. , e4119 (2012).
- Diaz, B. Invadopodia detection and gelatin degradation assay. Bio-protocol. 3, 1-8 (2013).
- Artym, V. V., et al. Dense fibrillar collagen is a potent inducer of invadopodia via a specific signaling network. J. Cell Biol. 208, 331-350 (2015).
- Schachtner, H., et al. Megakaryocytes assemble podosomes that degrade matrix and protrude through basement membrane. Blood. 121, 2542-2552 (2013).
- Schoumacher, M., Glentis, A., Gurchenkov, V. V., Vignjevic, D. M. Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay. Methods Mol. Biol. 1046, 133-144 (2013).
- Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 102, 3262-3269 (2003).
- Geraldo, S., et al. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo? Eur. J. Cell Biol. 91, 930-937 (2012).
- Monteiro, P., et al. Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia. J. Cell Biol. 203, 1063-1079 (2013).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).
