Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

2D og 3D matricer til at studere lineær invadosomdannelse og aktivitet

Published: June 2, 2017 doi: 10.3791/54911
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,3,4, 2, 2, 1, 1
1INSERM U1053, 2Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Tisch Cancer Institute, 3Faculté de Médecine, Casablanca, Université Mohammed 6 des Sciences de la Santé (UM6SS), 4Laboratoire National de Référence
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver, hvordan man forbereder en 2D-blandet matrix, der består af gelatine og kollagen I, og et 3D-collagen-I-stik for at studere lineære invadosomer. Disse protokoller tillader undersøgelsen af ​​lineær invadosomdannelse, matrixnedbrydningsaktivitet og invasionskapaciteterne af primære celler og cancercellelinier.

Abstract

Celleadhæsion, migration og invasion er involveret i mange fysiologiske og patologiske processer. For eksempel skal tumorceller i løbet af metastaseformationen krydse anatomiske barrierer for at invadere og migrere gennem det omgivende væv for at nå blod eller lymfekar. Dette kræver interaktionen mellem celler og den ekstracellulære matrix (ECM). På cellulært niveau er mange celler, herunder størstedelen af ​​kræftceller, i stand til at danne invadosomer, som er F-actinbaserede strukturer, der er i stand til at nedbryde ECM. Invadosomer er fremspringende actinstrukturer, som rekrutterer og aktiverer matrixmetalloproteinaser (MMP'er). Den molekylære sammensætning, densitet, organisation og stivhed af ECM er afgørende for regulering af invadosomdannelse og aktivering. In vitro er et gelatinestudie standardanalysen anvendt til at observere og kvantificere invadosomedbrydningsaktivitet. Imidlertid er gelatine, som er denatureret kollagen I, ikke en fysiologisk matrix element. Et nyt assay under anvendelse af type I-kollagenfibriller blev udviklet og anvendt til at demonstrere, at denne fysiologiske matrix er en potent inducer af invadosomer. Invadosomer, der danner langs kollagenfibrillerne, er kendt som lineære invadosomer på grund af deres lineære organisation på fibrene. Desuden viste molekylær analyse af lineære invadosomer, at discoidin-domænereceptoren 1 (DDR1) er receptoren involveret i deres dannelse. Disse data viser tydeligt betydningen af ​​at anvende en fysiologisk relevant matrix for at forstå de komplekse interaktioner mellem celler og ECM.

Introduction

Ekstracellulær matrix (ECM) remodeling forekommer under fysiologiske og patologiske processer, såsom angiogenese og tumorcelleinvasion. I fysiologiske forhold er mange celletyper, hovedsagelig fra hæmatopoietisk stamme, i stand til at nedbryde ECM-elementer. For eksempel er makrofager i stand til at krydse anatomiske barrierer for at nå væv, og osteoklaster nedbryder knoglematrix for at sikre calciumhomeostase. Mere globalt fornyer alle matricer i kroppen at opretholde deres fysiske og kemiske egenskaber. I kræftvæv ændres tumor mikromiljøsammensætningen. For eksempel i bryst- og lungekræft er type I-kollagen overudtrykt og akkumuleres omkring tumoren. Desuden er denne ophobning forbundet med en øget risiko for udvikling af metastase 1 , 2 . Cancer metastase er afhængig af kræftcellernes evne til at nedbryde ECM og invadere tilstødende væv.

DetInvasiv aktivitet af celler tilskrives specialiserede aktinrige strukturer kendt som invadosomer. Dette udtryk omfatter podosomer og invadopodier, som er til stede i henholdsvis normale og cancerceller ( fx makrofager, endotelceller og kræftceller, såsom MDA-MB-231 brystcancercellelinien). In vitro kan invadosomer organisere i forskellige former: prikker, aggregater eller rosetter 3 . Klassisk er invadosomer sammensat af en F-actin-kerne indeholdende flere proteiner, såsom stilladsproteinet Tks5 og cortactin, omgivet af adhæsionsplakmolekyler, såsom integriner og vinculin 4 . For nylig blev det vist, at Tks5 og RhoGTPase Cdc42 kan anvendes som en minimumsmolekylær signatur for funktionelle invadosomer 5 . Disse strukturer er i stand til at nedbryde ECM'en via rekruttering og aktivering af specifikke metalloprotease proteiner, såsom MT1-MMP og MMP-2 6. I en tidligere undersøgelse rapporterede vi, at interaktionen mellem type I-kollagenfibriller og discoidin-domænereceptoren 1 (DDR1), en specifik receptor af type I-kollagenfibriller, fører til dannelsen af ​​en ny klasse invadosomer, navngivet lineære invadosomer. Lineære invadosomer dannes langs type I collagenfibriller 7 . Disse strukturer er i stand til at nedbryde type I-kollagenfibriller via rekruttering og aktivering af MT1-MMP / MMP2. Desuden er deres dannelse afhængig af Tks5 og Cdc42 5 . In vitro demonstrerede vi eksistensen af ​​lineære invadosomer og inddragelsen af ​​DDR1 i deres dannelse og aktivitet 8 ved anvendelse af forskellige strategier bestående af en kombination af forskellige matrikselementer, herunder: i) fluorescerende gelatinecoated coverlips, ii) fluorescerende type I collagenfibril -coated coverlips, og iii) 3D type I collagen stik. På grund af brugen af ​​forskellige matricer kunne vi studere og karakterereIze lineær invadosomdannelse og deres nedbrydningsaktivitet 7 , 8 .

Endelig blev der anvendt en kombination af ECM-komponenter i både 2D- og 3D-kultursystemer for bedre at forstå biologien af ​​invasive celler, hvilket efterligner kompleksiteten af ​​tumormikro-miljø-sammensætningen. Nedenfor er protokoller for belægningsdæksler med gelatine / type I-kollagen i 2D- og 3D-kultursystemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Før fiksering udføres alle trin i en steril laminarstrømshætte.

1. 2D matrix

BEMÆRK: 2D matricer bruges til at bestemme procentdelen af ​​celler, der danner invadosomer og matrixnedbrydningsområdet pr. Celle.

figur 1
Figur 1: Protokol. Sammendrag af protokollen anvendt til fremstilling af gelatin og kollagen I matricer. Det er muligt kun at lave gelatinematrixen eller en gelatine- og collagen I-blandet matrix. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Gelatine matrix
    BEMÆRK: Fluorescerende gelatine matricer anvendes til at kvantificere matrix nedbrydning, og ikke-fluorescerende gelatine anvendes til at fremme vedhæftningen af ​​kollagen I-fibre. Fluorescerende gelatinemåtteRice anvendes også til podosome og invadopodia undersøgelser (se figur 1 ).
    1. Under en steril laminarstrømshætte skal du sætte et parparilm (20 cm x 15 cm) på arbejdsområdet og desinficere det med 70% ethanol.
    2. Aliquot 20 μl dråber af 1 mg / ml gelatine i en linje, adskilt ca. 1 cm fra hinanden; Se figur 1 for dråbeorganisation.
    3. Dæk hver 20 μl gelatinedroppe med et autoklaveret glasdæksel (12 mm i diameter).
    4. Inkubér i 20 minutter ved stuetemperatur. Hvis gelatinen er fluorescerende, skal du beskytte den mod lys.
    5. Aliquot 40 μl dråber af 0,5% glutaraldehyd i 1x phosphatpufret saltvand (PBS) i en linje, der hver er anbragt ca. 1 cm under linjen af ​​dækglas fra trin 1.1.3.
      FORSIGTIG: Glutaraldehyd er et giftigt fikseringsmiddel. Brug handsker og indånd ikke.
    6. Brug jeweled pincett til at overføre hver gelatinecoated coverlip til en glutaraldehyddråbe.
      BEMÆRK: DetDet er normalt, at en lille gelatinedroppe forbliver på parafilmen. Genbrug ikke dette til et andet eksperiment.
    7. Inkubér i 40 minutter ved stuetemperatur. Til fluorescerende dækslip skal du beskytte dem mod lys.
    8. Tag en 24-brønd cellekulturplade og fyld hver brønd med 500 μL sterilt 1x PBS. Læg dækslipene, gelatinsiden opad, ind i hver brønd.
    9. Vask to gange i 1x PBS i 5 minutter hver.
      BEMÆRK: På dette trin kan dækslipene bruges til forsøg eller opbevares i 1x PBS ved 4 ° C. Ikke-fluorescerende dækglas kan opbevares i en uge, og fluorescerende dækglas kan opbevares i 48 timer.
  2. Fibrillær kollagen type I matrix
    BEMÆRK: Fibrillar kollagen type I matrix anvendes til at studere lineær invadosom dannelse og den tilhørende matrix nedbrydning. En kombination af fluorescerende kollagen I og ikke-fluorescerende gelatine coverlips anvendes til at kolokalisere invadosomarkører med kollagenfibre ( fx F-actin iN den fjerneste kanal, kollagen I i den røde kanal, Tks5 i den grønne kanal og Hoechst farve for en nuklear plet). På den anden side anvendes en kombination af ikke-fluorescerende kollagen I med ikke-fluorescerende gelatine-dækslip til maksimering af antallet af invadosomarkører farvet ( fx F-actin i den fjerneste kanal, cortactin i den røde kanal, Tks5 i Den grønne kanal og Hoechst farvestof til en nuklear plet). Endelig anvendes en kombination af ikke-fluorescerende kollagen I med fluorescerende gelatine-dækslip til at kvantificere den gelatinassocierede nedbrydning ( fx F-actin i den farrøde kanal, Tks5 i den røde kanal, i den grønne kanal og Hoechst-farvestoffet For en nuklear plet) (se figur 1). Hoechst farvestof bruges til at plette kernen, og det kontrollerer også for mycoplasmaforurening, ud over en PCR-test, der udføres regelmæssigt på de anvendte cellelinjer.
    1. Fluorescerende kollagen I
      1. Brug kommercielt kollagen I ekstraheret fra rottehale sene i 0,02 N eddikesyred. Træk den mængde kollagen, der er nødvendig for at fremstille 500 μl opløsning pr. Dækslip, til en slutkoncentration på 0,4 mg / ml collagen I.
      2. Tilsæt 5-carboxy x rhodaminsuccinimidylester i en slutkoncentration på 10 μg / ml beregnet for slutvolumenet af collagen I-opløsning (nx 500 μl).
      3. Bland opløsningen ved pipettering op og ned og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
      4. Fortynd til den endelige mængde med 1X Dulbeccos fosfatbuffede saltvand (DPBS) indeholdende calcium og magnesium og brug direkte.
    2. Fibrillær kollagen I dækslip
      1. Brug de ikke-fluorescerende eller fluorescerende gelatine dækglas, der tidligere er fremstillet i trin 1.1.
      2. Forbered en opløsning af fluorescerende eller ikke-fluorescerende collagen I ved en slutkoncentration på 0,4 mg / ml i 1X DPBS indeholdende calcium og magnesium.
      3. Tilsæt 500 μL fluorescerende eller ikke-fluorescerende kollagen I opløsning prCoverlip i en 24-brønd cellekulturplade.
      4. Inkubér i 4 timer ved 37 ° C til kollagen I-polymerisering.
      5. Efter inkubation fjernes overskydende kollagen I ved at vippe pladen og pipetteringen på siden af ​​brønden (ikke direkte på dækslet) for at undgå at beskadige matrixen.
        BEMÆRK: Denne matrix kan ikke gemmes. Sæd cellerne umiddelbart efter fjernelse af overskydende collagen I.

2. Cellsåning, kulturtid og fixering

  1. Afhængig af celletypen fremstilles cellerne i det passende dyrkningsmedium og tilsæt celler til et slutvolumen på 500 μl pr. Brønd.
  2. For at karakterisere evnen af ​​en cellelinie til at danne lineære invadosomer og nedbrydning af matrixen, pladerne cellerne i 4 h, 12 h og 24 h på kollagen I matrix for at bestemme kinetikken for lineær invadosomdannelse og den tilhørende nedbrydningsaktivitet.
    BEMÆRK: Tabel 1 indeholder eksempler på cellelinjerTestet i laboratoriet.
    Cellelinie Antal celler pr. Dækslip Tidspunkt for kontakt med matrix for lineær invadosom kvantificering Tidspunkt for kontakt med matrix til kvantificering af lineær invadosomedbrydningsaktivitet
    MDA MB 231 40.000 4 timer 12 timer
    HUH7 40.000 12 timer 24 timer
    HEP 3B 40.000 12 timer 24 timer
    SNU 398 40.000 12 timer 24 timer
    NIH 3T3 src 30.000 4 timer 12 timer
    A431 50.000 6 timer 24 timer
    A549 40.000 12 timer 24 h &# 160;
    RÅ 40.000 12 timer 12 timer
    PAE 40.000 12 timer 12 timer
    Tabel 1: Cellesedning og inkubationstid reference. Denne tabel viser en ikke-udtømmende liste over cellelinjer, der anvendes til at studere lineære invadosomer. Det angiver antallet af celler til frø på matricen, den tid der er nødvendig for at observere lineære invadosomer og den tid, der er nødvendig for at observere den associerede matrixnedbrydning. Lineære invadosomer har kort levetid. For at kunne observere lineære invadosomer i det maksimale antal celler, skal cellerne være i kontakt med collagen I-matrixen i en kort periode. På den anden side for at kunne visualisere den rapporterede gelatinedbrydning skal cellerne være i kontakt med collagen-I-matrixen i længere tid end dem, der er anført ovenfor.
  3. Efter fjernelsen af ​​cellekulturmediet,Læg dækslerne i 10 minutter i 500 μl 4% paraformaldehyd i 1X PBS.
  4. Vask to gange med 1x PBS.
  5. Opbevares ved 4 ° C, beskyttet mod lys.

3. Immunofluorescens

  1. Permeabiliser cellerne i 10 minutter med en frisklavet opløsning 0,2% Triton X-100 i 1x PBS. Genbrug ikke denne løsning.
  2. Vask dækslerne to gange med 1x PBS.
  3. Placér et stykke parafilm (20 cm x 15 cm) på bænken.
  4. Fortynd primær antistof i 4% bovint serumalbumin (BSA) i 1x PBS som beskrevet i Materialetabellen .
  5. Aliquot 50 μl dråber af primær antistofopløsning i en linje, hver med en afstand på ca. 1 cm fra hinanden.
  6. Placer hver dækslip på en dråbe.
  7. Inkubér i 40 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
  8. Efter inkubationsperioden vaskes to gange med 1x PBS.
  9. Fortynd det sekundære antistof, phalloidin og Hoechst farvestof i 4% BSA i 1xPBS.
  10. Aliquot 50 μl dråber af blandingen, hver med en afstand på ca. 1 cm under den første linje af dækglas, som tidligere gjort.
  11. Placer hver dækslip på en dråbe.
  12. Inkubér i 30 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
  13. Efter inkubation vaskes to gange med 1x PBS.
  14. Vask en gang med destilleret vand for at fjerne saltene.
  15. Monter dækslipene på et glasskinne med polymeriserende monteringsmedium.
  16. Lad afdækningen tørre natten over ved stuetemperatur, beskyttet mod lys, før mikroskopi.

4. Kvantifikationer

Figur 2
Figur 2: Lineær invadosom kvantificering. Makroen kræver konfokale billeder af F-actin og Tks5-farvning (format: 1.024 x 1.024). ( A ) Først skal du åbne F-actin-billedet og lave en maske. ( B ) Åbn derefterTks5 billedet og tærskel det. Anvend makroen. ( C ) Analyserede resultater vises i to tabeller. Antallet af lineære invadosomer pr. Celle og anden information, såsom procentdelen af ​​området, der anvendes af lineære invadosomer i cellen, findes i sammenfattende tabel. Størrelsen af ​​hver lineær invadosom vil være i resultat tabellen. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Procentdel af celler, der danner lineære invadosomer
    1. Tæl cellerne, der danner lineære invadosomer, ca. 100 celler pr. Dækglas (brug tekniske triplicater). Kvantificer mindst 300 celler pr n, med n = 3.
    2. Beregn procentdelen af ​​celler, der danner lineære invadosomer ved at tage gennemsnittet af tre uafhængige eksperimenter, hvilket resulterer i 900 kvantificerede celler.
  2. Lineær invadosom størrelse og antal pr. Celle
  3. Brug ImageJ med den ekstra makro.
  • Nedbrydning pr. Celle
    1. Brug tre dæksler pr. Tilstand.
    2. Tag 30 billeder pr. Dækslip af fluorescerende gelatine og Hoechst-farvede kerner.
    3. Brug ImageJ-softwaren som beskrevet i Martin KH et al. 9 .

    • 5. 3D Collagen Invasion Assay

    Figur 3
    Figur 3: Invasion assay skema. Resumé af invasion assay protokol. Kollagen I er tværbundet med succinimidylesterfarvestof og polymeriseret i 1 time ved 37 ° C. Celler tilsættes i serumfrit medium oven på collagen-I-stikket. Indsatsen placeres i medium wiTh 10% FBS. Kollagen I stikpropper fastgøres 1 time efter cellesedning i kontrollen og 3 dage efter cellesedning i forsøgsbetingelserne for at bestemme invasionskapaciteten af ​​cellerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

    1. Kollagen Jeg plugger forberedelse
      1. Lav et tidsforløb på 4 timer, 12 timer, 24 timer, 48 timer og 72 timer for det første forsøg for at bestemme kinetikken for invasionen i gelen ifølge celletypen. For hvert eksperiment skal du tilføje et 1 h tidspunkt som referencepunkt, når ingen invasion opstår.
      2. Forbered kollagen I-opløsningen på is under en steril laminarstrømshætte. Forbered 500 μL opløsning til 3 Boyden kammerindsatser.
      3. Aspirer 1 mg kommercielt rotterhale-kollagen I til fremstilling af en opløsning med en slutkoncentration på 2 mg / ml collagen I.
      4. Tilsæt 5-carboxy x Rhodamine succinimidyl ester vedEn slutkoncentration på 1 μg / ml beregnet for det endelige volumen af ​​kollagen I-opløsning (i dette tilfælde 500 μl).
      5. Bland godt og inkuber i 5 minutter på is under den sterile laminarstrømshætte, beskyttet mod lys.
      6. Tilsæt 50 μl iskold, filtreret 10X PBS og 6,25 μl iskold 1 M natriumhydroxid (NaOH).
      7. Tilsæt sterilt vand ifølge formlen 443,75 - x μl kollagen I.
      8. Tilsæt 100 μL opløsning pr. Boyden kammerindsats.
      9. Inkuber i 1 time ved 37 ° C for at muliggøre polymerisering.
      10. Tilsæt cellekulturmedium beriget med føtalt bovint serum (FBS) i nye brønde; Placere indsatser i disse brønde.
      11. Sæd 30.000 celler oven på collagenet I plug-in FBS-frit medium.
      12. Efter dyrkning af cellerne ved 37 ° C fikseres kollagen I-pluggen i 30 minutter i 4% paraformaldehyd i 1x PBS.
      13. Komplet immunofluorescens som i trin 3 med undtagelse af følgende trin: permeabiliZe med 0,2% Triton X-100 i 1x PBS i 30 minutter, ikke 10 minutter; Inkuberes med primære og sekundære antistofopløsninger i henholdsvis 1,5 timer hver især i stedet for 40 minutter og 30 minutter. Stain for F-actin eller kerner til lokalisering af cellerne.
      14. Efter immunofluorescens skal du bruge en skalpel til at skære rundt på indsatsens membran og omhyggeligt overføre collagen I-stikket til en glasbundet skål. Sørg for, at toppen af ​​kollagenstikket er i kontakt med glasset. Hold indsatsmembranen fastgjort til bunden af ​​kollagen I-stikket for at opretholde stikkets integritet.
        BEMÆRK: Kollagen I-stikket forbliver intakt i glasskålen. Dybden mellem glasbunden og plasten omkring glasbunden svarer til tykkelsen af ​​stikket.
      15. Placér et dækslip på kollagenet, jeg plugger og monterer med polymeriserende monteringsmedium for at forhindre stikket i at tørre ud.
      16. Brug et omvendt konfokalmikroskop til at billedet kollagen jeg plugger; Toppen afStikket er i kontakt med glasets bund på skålen.
        1. Få en z-stack fra toppen til bunden af ​​collagenet, jeg plugger for at visualisere celleinvasion. Bestem tykkelsen af ​​z-stacken ved at undersøge, hvor dybt cellerne invaderer billedfeltet. Udfør opkøb med et 40X oliemål i et 512 x 512 format med en z-step størrelse på 0,25 μm.
          BEMÆRK: Til reference er den gennemsnitlige z-stack for MDA-MB-231-celler 3 dage efter såning 30 μm.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Ved hjælp af en kombination af to typer matricer, gelatine og type I-kollagen ( figur 1 og 4 ) har vi fremhævet en ny type invadosom, kendt som lineære invadosomer. Mærkningen af ​​disse matricer muliggør observation af lineær invadosomdannelse langs kollagen I-fibre og deres nedbrydningskapacitet ( figur 5 ). Antallet af invasive strukturer kan derefter kvantificeres af den tidligere beskrevne makro (trin 4.2), og nedbrydningsaktiviteten kan også bestemmes under anvendelse af ImageJ-softwaren, som beskrevet af Martin et al. Og Diaz et al. 9 , 10 . Den blandede matrix tillader karakterisering af lineære invadosomer ved at definere DDR1 som den receptor, der er nødvendig for lineær invadosomdannelse og funktionalitet ( Figur 6 ).

    figur 3 og 7 ). Dette assay giver os mulighed for at bestemme antallet af celler, der har invaderet i kollagen I-stikket, såvel som den tilbagelagte afstand ved anvendelse af z-stack rekonstruktioner.

    Figur 4
    Figur 4: Sammenligning af gelatine og gelatinekollagen I blandede matricer ved anvendelse af konfokal mikroskopi. Skematisk repræsentation, der viser organisationen af ​​fluorescerende gelatine dækglas på toppanelet. ( A ) Confocal z-stack rekonstruktion demonstrerer, at den fluorescerende gelatinematrix danner et tyndt, ensartet lag, som dækker hele overfladen af ​​dækslet. ( B ) I den blandede matrix, efter aflejringen af ​​fluorescerende gelatine på dækslipene, type I-collagenfibrillerPolymerisere ovenpå. Kollagenet I fibriller farves i rødt. Kollagen I-matrixen er tyk og heterogen på dækslet. Fordelingen af ​​kollagen I-fibre er afhængig af polymerisationen af ​​kollagen I a-kæder. Skalestang = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

    Figur 5
    Figur 5: Virkning af gelatin og gelatinekollagen I-matricer på invadosomdannelse og aktivitet. De celler, der anvendes til disse assays, er MDA-MB-231 brystcancerceller. ( A ) En skematisk repræsentation viser celler podet på en fluorescerende gelatine dæklip på toppanelet. Nedbrydningsområder visualiseres i sort på grund af reduktionen af ​​fluorescens. Tks5-farvning blev anvendt som en invadosomarkør. På gelatine, invAdosomer denne form er organiseret som prikker. ( B ) En skematisk repræsentation viser celler podet på en blandet matrix af gelatine og kollagen I. Kollagen I er mærket i rødt; Tilsætningen af ​​type I kollagenfibriller øger cellens evne til at nedbryde gelatine. Interessant nok er invadosomarkøren Tks5 reorganiseret, og prikkerne erstattes af lineære strukturer, der repræsenterer lineære invadosomer. Nedbrydningsområder visualiseres i sort på grund af reduktionen af ​​fluorescens. Målestang = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

    Figur 6
    Figur 6: Konfokal mikroskopi analyse af molekylær sammensætning og organisering af invadosomer i både gelatine og blandede matrix betingelser. ( A ) I gElatin betingelse, invadosomer er organiseret i prikker, og F-actin (rød) co-lokaliseres med Tks5 (grøn, bundpanel), men ikke med DDR1 (grøn, toppanel). Disse er klassiske invadosomer. Skalestænger = 5 μm. ( B ) I gelatinekollagenet blandede matrix-betingelsen, koloniserer DDR1 (grønt toppanel) med collagen I-fibrillerne (rødt, øverste panel), Tks5 (grønt bundpanel) og F-actin (rødt bund panel). Kollagenfibriller af type I inducerer dannelsen af ​​lineære invadosomer. Skalestænger = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

    Figur 7
    Figur 7: Cell invasion assay af MDA-MB-231 celler i en collagen I plug. 1 time efter såning af cellerne er kontrolindsatserne fikset og farvet. ( A ) z-stack aOpkøbet af kollagen I-stikket udføres under anvendelse af konfokal mikroskopi. Cellerne invaderer ikke kollagenet jeg plugger på dette tidspunkt I stedet forbliver de oven på det kollagen, jeg plugger. Således anvendes dette som kontroltidspunktet, når ingen invasion forekommer. MMP-aktivering er nødvendig for at cellerne kan invadere et kollagen I-stik ved denne tæthed. ( B ) Tre dage efter såning invaderer nogle celler kollagen I-pluggen. Dette assay tillader observation og kvantificering af celleinvasion. Derudover kan det bruges til at studere virkningen af ​​forskellige stoffer eller siRNA'er, for eksempel. Skalbjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Klassisk undersøges invadosomer in vitro uden hensyntagen til mikromiljøet og den matrix, som cellerne er pletteret på. Flere typer matricer anvendes i øjeblikket, herunder gelatine, fibronektin, vitronectin eller højdensitetsfibrillar collagen (HDFC) 7 , 11 ; Imidlertid er disse ofte ikke repræsentative for mikromiljøet, hvor cellerne ligger og ikke er fysiologisk relevante. Her anvendes en ny type matrix, der består af en forbindelse mellem kollagen af ​​gelatine og fibrillar type I. Brugen af ​​type I-kollagenfibriller gør det muligt at fremhæve en ny klasse invadosomer, kendt som lineære invadosomer, som specifikt danner på kollagen I i sin fysiologiske arkitektur 7 . Mærkning af kollagen Jeg tillader os at observere lineære invadosomer langs fibrene og kvantificere deres dannelse ved hjælp af cellulære markører som Tks5 og cortactin. Brug af miXed matrix har vi identificeret en ny receptor, discoidin domæne receptoren 1 (DDR1), involveret i dannelsen af ​​lineære invadosomer 8 .

    Den 2D blandede matrix tillader os at kvantificere matrix-nedbrydningsaktiviteten af ​​lineære invadosomer via zymografi in situ- analysen. Dette assay rapporterer proteolysaktiviteten af ​​MMP'er ved at analysere tilstedeværelsen af ​​sorte huller i det fluorescerende gelatinelag. Interessant øger organisationen af ​​F-actin i lineære invadosomer matrixnedbrydningsaktiviteten sammenlignet med kun gelatine 7 . En begrænsning af dette assay er, at gelatinen er en ikke-fysiologisk matrix, og det er blevet påvist, at en mere fysiologisk matrix ændrer den cellulære respons på mikromiljøet. Der findes en yderligere begrænsning på den måde, hvorpå MMP-aktivitet kvantificeres på gelatinekollagen I-blandede matricer. Kun gelatinedbrydelsen, der lokaliseres under collagen I fiBril lag kan kvantificeres; Derfor er dette en indirekte metode til at kvantificere kollagen I matrix nedbrydning. En alternativ metode til visualisering af nedbrydningsaktiviteten af ​​lineære invadosomer er at mærke collagen I-fibre med et specifikt antistof mod kollagenspaltningssteder (Col1-3 /4 C, immunoglobulin). Dette muliggør visualisering af spaltede fibre ved immunofluorescens. På grund af cellemigration er dette antistof imidlertid ikke særlig specifikt i 2D for nedbrydning på grund af lineær invadosomdannelse. En anden måde at visualisere og kvantificere nedbrydningsaktiviteten af ​​kollagen I-fibre er at anvende multiphotonmikroskopi og anden harmonisk generation 8 . Denne metode muliggør afbildning af kollagen I-fibre uden nogen farvning.

    Vores metode til polymerisering af type I-kollagen er forskellig i forhold til andre metoder anvendt i litteraturen 12 , 13 . For eksempel Artym

    For at studere involveringen af ​​lineære invadosomer i celleinvasion blev 3D-kollagen-I-stikprøven anvendt. 3D-kollagen-pluggen bruges allerede af det videnskabelige samfund for at studere invasive strukturer eller involvering af metalloproteinaser i invasionen 14 , 15 , 16 . Disse typer af 3D-matricer har grænser for denneR stivhed - for eksempel er 3D-kollagen I-pluggen mindre stiv end 2D-matrixen. Desuden er typen og oprindelsen af ​​collagenet I også vigtig med hensyn til den forskellige organisering af collagenfibre in vivo 17 . Endelig blev der kun fokuseret på mikromiljøsammensætningen in vivo kun ét element af den ekstracellulære matrix, type I-kollagenet. Yderligere undersøgelse er nødvendig for at bestemme relevansen af ​​lineære invadosomer in vivo .

    Ud over undersøgelsen af ​​lineære invadosomer kan den blandede matrix beskrevet heri anvendes sammen med andre typer matrixkomponenter, såsom fibronektin, vitronectin og andre typer af collagener ( f.eks. Type IV-kollagen). Denne protokol kan tilpasses, afhængigt af hvilke typer matrixelementer der er af interesse, og hvilke processer der skal studeres. Det er imidlertid klart, at generering af komplekse og fysiologiske matricer vil muliggøre identifikation af neW veje involveret i celleadhæsion, migration og invasion.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne har intet at afsløre.

    Acknowledgments

    JDM blev støttet af et ph.d.-stipendium fra INSERM / Région Aquitaine og støttes nu af et postdoktoralt ARC-fællesskab og Tisch Cancer Institute ved Mount Sinai School of Medicine. EH støttes af en ph.d. fra Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. ZE støttes af et postdoktoralt fællesskab fra Agence National de la Recherche (ANR). CM understøttes af Tisch Cancer Institute ved Mount Sinai School of Medicine, og JJBC støttes af NIH / NCI grant K22CA196750, TCI Young Scientist Cancer Research Award JJR Fund og Tisch Cancer Institute ved Mount Sinai School of Medicine. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra ANR-13-JJC-JSV1-0005. FS understøttes af "Ligue nationale contre le cancer". VM og FS understøttes af finansiering fra "Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016" og Institut National du Cancer, INCA_8036 og PLBio2012.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Gelatin solution Sigma G1393 Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml
    Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate Molecular probe life technologies G13186 5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water
    Microscope cover glasses Marlenfeld GmbH & Co 111520 Ø12mm No.1
    2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4 Electron microscopy science 15960 Dilute at 0.5 % in sterile water
    1x PBS pH 7.4 Gibco by life technologies 10010-015 Use this PBS in all steps before fixation
    Collagen I Rat tail Corning 354236
    5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester Life technologies C-6125
    DPBS 1x + calcium + magnesium Gibco by life technologies 14040-091
    Paraformaldehyde 16% solution Electron microscopy science 15710 Dilute at 4% in 1X PBS
    Triton X 100 Sigma T9284
    10x PBS buffer pH 7.4 Ambion AM9625 Dilute at 1X in water Use in steps after fixation
    Tks5 antibody Santa Cruz sc-30122 Invadosome markers Dilution : 1/100
    Cortactin 4F11 antibody Millipore 5180 Invadosome markers Dilution :1/100
    DDR1 antibody Cell signaling 5583 Linear invadosome receptor
    Dilution :1/100
    Phalloidin FluoProbes Interchim FT-AZ0330 Fibrillary actin marker Dilution :1/200
    Hoechst Sigma 33258 Nucleus marker Dilution :1/200
    Secondary antibodies FluoProbes Interchim FP-488 FP-547H or FP-647H
    Albumin from bovine serum Sigma A2153 Dilute at 4% in 1X PBS
    Fluoromount G mounting medium Interchim FP 483331
    ImageJ software Public domain http://www.macbiophotonics.ca/imagej/
    Cell culture insert Corning 353097 8.0µm pore size / 24 wells
    Sodium hydroxide (NaOH) Sigma 221465

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-54 (2003).
    2. Gilkes, D. M., et al. Collagen prolyl hydroxylases are essential for breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 3285-3296 (2013).
    3. Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 185-211 (2011).
    4. Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
    5. Di Martino, J., et al. Cdc42 and Tks5: a minimal and universal molecular signature for functional invadosomes. Cell Adh. Migr. 8, 280-292 (2014).
    6. Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. J. Cell Sci. 122, 3015-3024 (2009).
    7. Juin, A., et al. Physiological type I collagen organization induces the formation of a novel class of linear invadosomes. Mol. Biol. Cell. 23, 297-309 (2012).
    8. Juin, A., et al. Discoidin domain receptor 1 controls linear invadosome formation via a Cdc42-Tuba pathway. J. Cell Biol. 207, 517-533 (2014).
    9. Martin, K. H., et al. Quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts. J. Vis. Exp. , e4119 (2012).
    10. Diaz, B. Invadopodia detection and gelatin degradation assay. Bio-protocol. 3, 1-8 (2013).
    11. Artym, V. V., et al. Dense fibrillar collagen is a potent inducer of invadopodia via a specific signaling network. J. Cell Biol. 208, 331-350 (2015).
    12. Schachtner, H., et al. Megakaryocytes assemble podosomes that degrade matrix and protrude through basement membrane. Blood. 121, 2542-2552 (2013).
    13. Schoumacher, M., Glentis, A., Gurchenkov, V. V., Vignjevic, D. M. Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay. Methods Mol. Biol. 1046, 133-144 (2013).
    14. Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 102, 3262-3269 (2003).
    15. Geraldo, S., et al. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo? Eur. J. Cell Biol. 91, 930-937 (2012).
    16. Monteiro, P., et al. Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia. J. Cell Biol. 203, 1063-1079 (2013).
    17. Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).

    Tags

    Bioengineering udgave 124 Lineær invadosom ekstracellulær matrix nedbrydningsaktivitet collagen I 3D invasion
    2D og 3D matricer til at studere lineær invadosomdannelse og aktivitet
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Di Martino, J., Henriet, E.,… More

    Di Martino, J., Henriet, E., Ezzoukhry, Z., Mondal, C., Bravo-Cordero, J. J., Moreau, V., Saltel, F. 2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity. J. Vis. Exp. (124), e54911, doi:10.3791/54911 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter