Summary
Vi præsenterer en orthotopic aorta transplantation model ved hjælp af ærmet teknik i mus. Det er en meget hurtig anastomose metode, som kan være ansat i undersøgelser af vaskulær sygdom.
Abstract
Orthotopic aorta transplantation ved hjælp af ærmet teknik reducerer skade på aorta med fejlrate på kun 10-20%. Tid til anastomose aorta i mus ved hjælp af metoden ærme var kort og let i gennemsnit 20 min, tillader undersøgelser af iso/allo grafts. Følgende artikel beskriver aorta transplantation procedure anvendes i vores laboratorium. Musene blev bedøvede med en blanding af 1,5% volumen isofluran og 100% ilt gennem en ansigtsmaske. På dette tidspunkt, segmentet af aorta mellem nyrearterier og sin bifurkation var adskilt fra vena cava, frit forberedt og clampedat de proksimale og distale segmenter med en enkelt silke sutur. Før fjernelse af aorta, var en saltopløsning, som indeholder heparin injiceres i den ringere vena cava. Derefter aorta blev skåret mellem klemmerne og en saltvand heparin løsning blev brugt til at skylle lumen. Ærme teknik med monofilamenter suturer blev brugt for at omplante den abdominale aorta i orthotopic position.
Introduction
Som påpeget i en tidligere undersøgelse, har fået stor opmærksomhed til murine aorta transplantation modeller, som giver mulighed for forskelsbehandling mellem bestemt vaskulære svar forårsaget af graften selv og visse systemiske faktorer forbundet med en arteriogenic miljø 1 , 2 , 3. den vigtigste faktor, der spiller en afgørende rolle her er tilgængeligheden af knockout og Transgene mus. Deres inddragelse i denne model giver mulighed for at identificere og fastlægge nye patofysiologiske veje forbundet med udviklingen af degenerative Vaskulære sygdomme, såsom åreforkalkning og aneurisme dannelse4, 5.
Det er værd at bemærke, at i løbet af podning en iboende iskæmi/reperfusion muligvis skade for de fartøjer, der er beregnet til transplantation. Forekomsten af bestemte problemer med transplantat integritet eller en uventet betændelsesreaktion i den postoperative periode kan derfor udelukkes muligvis udelukke patofysiologiske forandringer i degenerative Vaskulære sygdomme3 ,4,5,6,7. Ærme anastomose er den alternative metode, i slut for arterielle anastomose med fartøjer med en diameter på mindre end en millimeter og har været anvendt med succes i nyre og hjerte transplantation i rotter, som senere blev tilpasset til aorta transplantation i mus af Dambrin et al. 8 , 9 , 10 , 11.
Aorta skade ved hjælp af ærmet transplantation teknik minimeres med en meget lav tekniske fejlrate på grund af det varede kun 20 minutter i gennemsnit. Vores tidligere resultater har vist gode funktionelle og strukturelle egenskaber af en isograft i vivo efter transplantation bruger ærme teknik1. Dambrin et al. beskriver, efter en kort indlæringskurve succesraten var over 78%10. Komplikationer som blodpropper er sjældne, for eksempel Engelbrecht et al. ikke overholdt trombose ved hjælp af ærmet teknik i renal transplantation i rotte8.
Murine aorta transplantation modellen med ærme anastomoser er en hurtig og let værktøj til at studere iso/allograft reaktioner i den transplanterede fartøj. Denne video illustrerer den aorta transplantation procedure udført i vores laboratorium. Denne transplantation model kan være nyttige i at definere de underliggende patologiske mekanismer af degenerative karsygdom og kan bidrage til yderligere vurdering af molekylære og farmakologiske interventioner12.
Protocol
procedurer, der involverer dyr emner blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på RWTH Aachen University, AZ 84-02.04.2012.A234.
Bemærk: proceduren, der er påvist ved hjælp af voksne mandlige vildtype mus med CD1 baggrund. Holde mus i et specialiseret laboratorium enhed, før og efter operationen, sikre ordentlig adgang til mad, specialiserede veterinære kontrol og behandling. Hvis dyrene er købt fra udenfor, give en uges tilvænning før du udfører kirurgi.
1. forberedelse af Donor-
- bruge sterile materialer og instrumenter til at vedligeholde sterile forhold under operation for at undgå infektioner.
- Bedøver hver mus med en blanding af 1,5% af volumen isofluran og 100% ilt gennem en ansigtsmaske. Lå musen på en platform i liggende stilling og tape alle sine ben til operationsbordet. Kontrollere dens reflekser ved at klemme de bagben fødder for at være sikker på, at musen er tilstrækkeligt bedøvede. Placer oftalmologiske salve på øjnene at forhindre udtørring under proceduren.
- Fjerner alle hår fra maven ved hjælp af en depilatory gel eller bruge en barbermaskine. Udføre handlingen under sterile forhold. Desinficere maven med vekslende scrubs af klorhexidin og sterilt vand.
- Fjerne donor aorta via en midterlinjen abdominal snit med saks eller skalpel. Trække tarm manuelt til højre. Forsigtigt manuelt afspejler tarmene til side ved hjælp af pulver gratis handsker.
- Læg tarmen på et stykke gaze chloroformvædet med saltvand til at holde det fugtig.
- Dissekere væk den abdominale aorta meget omhyggeligt fra de omkringliggende væv ved hjælp af en stump dissektion med pincet.
- Separat segment af aorta mellem nyrearterier og sin bifurkation fra vena cava med pincet.
- Sikre alle de små grene af dette segment meget omhyggeligt ved hjælp af 11-0 monofilamenter enkelt sutur.
- Før du fjerner aorta, injicere 0,5 milliliter (mL) af saltopløsning indeholdende 50 U af heparin til den ringere vena cava.
- Lad donordyret exsanguinate efter segment af aorta er fjernet.
- Skylles graft fuldt med saltvand og derefter overføre det straks til en container af iskoldt saltvand.
2. Forberedelse af modtageren
- bedøver modtager dyret med en blanding af 1,5% af volumen isofluran og 100% ilt gennem en maske, og derefter fjerne hår og desinficere (afsnit 1). Gøre en midterlinje indsnit fra formet som et sværd til bækken med en skalpel og trække mavesmerter væggene. Placer oftalmologiske salve på øjnene at forhindre tørhed under proceduren.
- Wrap tarm i saltopløsning fugtet gaze og fortrænge meget forsigtigt at dyret ' s højre.
- Dissekere infrarenal aorta gratis mellem nyrearterier proksimalt og bifurcation distalt med pincet.
- Sikre alle de små grene af dette segment meget omhyggeligt ved hjælp af 11-0 monofilamenter enkelt sutur.
- Klemme den proksimale og distale dele af aorta med en 6-0 enkelt silke sutur.
- Opdele aorta i midten mellem klemmerne og overrisle cut enderne med heparinized saltvand til at skylle lumen åbne.
- Placer graften i orthotopic position med fodring fartøj slutningen indsat i den modtagende fartøj efterfulgt af sutur med 11-0 monofilamenter pasning til at undgå enhver torsion af aorta ved korrekt justering af donor og recipient ( figur 1) 10.
- omhyggeligt frigive ligaturer efter en kontrol af anastomose. Frigive den distale klemme først. Dette resulterer i lavt tryk holder vægge sammen før frigive den proksimale højtryks side.
- Perfuse graften straks og indskrive nemlig en synlig puls. Forsigtigt fjerne resterne af silke. Den optimale overlapning længde mellem donor og recipient aorta er 1-2 mm.
- Atvendetilbage bughulen abdominal indholdet og luk hele sår med en løbende 3-0 polyglycolic syre sutur.
- Give mus buprenorphin (0,05 mg/kg kropsvægt subkutant (SC)) før afslutning anæstesi.
- Efterlad ikke et dyr uden opsyn indtil det er fuldt bevidst. Administrere smerter terapi med buprenophine 0,05 mg/kg kropsvægt administreres SC tre gange om dagen for tre dage efter operationen, som blev godkendt af det institutionelle tilsyn organ.
- For væv høst, bedøver de modtagende mus som beskrevet ovenfor og flush til fartøjer med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) efterfulgt af 4% formaldehyd/PBS, (pH = 7.4) af hjertets punktering. Fjern podninger forsigtigt. Efter natten fiksering i 4% formaldehyd/PBS, proces prøver yderligere og integrere i paraffin.
Representative Results
Musene inddrives fra anæstesi inden for 15-30 min med ingen observerede fysiske svækkelse, selv om der var en forhøjet risiko for blodpropper. Ultralyd analyse blev brugt under postoperativ følge. Vildtype musene brugt i undersøgelsen udstillet ingen ændringer i dimensionerne af deres lumen. Derfor blev hverken stenoses eller aneurysmal formationer observeret. Transplantation dyr undladt at udstille plaque udvikling af fartøj vægge (figur 2).
Konventionelle farvning procedurer som immunohistology kan bruges til at bestemme plaque, mønster af glatte muskelceller, og ophobning af makrofager. I vores undersøgelse den histologiske og immunhistokemisk farvning blev udført 6 uger efter podning for at teste integriteten af graften. Histologiske farvning (hæmatoxylin og eosin (han) og immunhistokemisk farvning (glat muskel aktin (SMA) og makrofager (MAC2)) (figur 3) viste os uændret spredningsmønstre af glatte muskelceller, intakt endothelial celler foring og ingen ophobning af celler i intima. Disse resultater viser, at ingen betydelig læsion eller celle aktivering blev fundet i de podede fartøjer (figur 3).
Figur 1 : Ærme teknik. Den abdominale aorta blev transplanteret ved hjælp af ærmet teknik. I denne procedure, blev donors aorta placeret i orthotopic position med overfladiske bid i fodring fartøjet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Intraoperativ og ultralyd billeder. Eksempler på visningen intraoperativ (obduktion) af grafts 6 uger efter transplantation (A), tre-dimensionelle ultralyd (B), og B-tilstand Se (C). Den postoperative opfølgning blev gennemført ved hjælp af ultralyd. Billederne viser passage af transplantat med ingen ændring i lumen dimensioner. Derudover blev ingen stenoses eller aneurysmal formationer observeret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Histologiske og Immunhistokemi billeder. De histologiske og Immunhistokemi repræsentative billeder af transplanterede dyr på 6 uger efter transplantation. Ingen betydelige læsioner blev observeret i transplanterede aortas af histologi (hæmatoxylin og eosin, han, 100 X forstørrelse, skalalinjen = 50 µm), immunhistokemisk farvning (glat muskel aktin SMA (rød) eller makrofag MAC2 (grøn), 200 X forstørrelse, skala bar = 25 µm). Kerner blev Counter plettet af DAPI (blå). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Forud for denne undersøgelse var forskellige andre transplantation modeller i mus grundigt analyseret3,6,7,10,13,14. Model af aorta transplantation ved hjælp af ærmet teknik med ændringer af Dambrin et al. blev valgt som det matchede vores kriterier og viste en høj pålidelighed af ærmet anastomose i forhold til konventionelle ende til sutur metoder 1 , 10.
Denne teknik er gunstig på mange måder med cross-klemme tid betydeligt reduceret minimere skaderne på aorta under kirurgi. En lav forekomst af blodpropper blev observeret ud over at undgå potentielle uoverensstemmelse i fartøjet kaliber mellem donor og modtager. Ovenstående bemærkninger gør denne teknik særdeles velegnet til at undersøge karsygdom i aorta transplantationer i mus.
I en opfølgende undersøgelse, som var en ultralyd udført 8 uger efter transplantation, blev ikke fundet nogen væsentlige ændringer. Dette bekræftede antagelser at enhver skade på aorta under operation ville være minimal1.
Podning procedure præsenteret i denne artikel sikrer ingen forringelse både i graft integritet og dens funktion. Det kan derfor konkluderes, at denne eksperimentelle transplantation model kan tjene som et værdifuldt redskab for fremtidige molekylære og farmakologiske undersøgelser af degenerative fartøj sygdom i gensplejsede mus.
Vi tror at den video guide kan fungere som undervisningsmateriale illustrerer brugen af denne enkle arterio-arteriel model og at det vil bidrage til yderligere frugtbar debat om mange vigtige spørgsmål i Vaskulære sygdomme. Denne meget hurtige anastomose metode kan bruges til at studere karsygdom i gensplejsede mus. Det kan også bruges som en ændring i aneurisme model kombineret med transplantation.
Der er kritiske punkter under proceduren. Markedsføring af sutur, selv er den mest kritiske trin. Kirurgen har til at sørge for at undgå enhver torsion af aorta ved korrekt justering af donor og recipient. Klemmerne er omhyggeligt fjernet efter inspektion af anastomose. Den distale klemme skal altid frigives først resulterer i lavt tryk holder vægge sammen inden den proksimale højtryks side udsætningen. Konsekvensen af ikke ordentligt efter rækkefølgen af frigivelse ville være blødning.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Roma Wieczorek og Peter Kurdybacha for deres fremragende redigering hjælp, og Leon Decker og Uli Heuter for deres fremragende teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halsey Needle Holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Dumont #5 Forceps - | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Lexer-Baby Scissors | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Castroviejo Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Vannas Scissors | Aesculap, Germany | Typ OC498R | |
| Castroviejo Suture Forceps | Geuder, Germany | 19015 | |
| 6-0 silk black (Silk) | Deknatel, Research Triangle Park NC, USA | 18020-60- FST | |
| 11-0 monofilament (Ethilon) | Ethicon, Norderstedt, Germany | EH7438G | |
| 3-0 polyglycolic acid suture (Serafit) | Serag-Wiessner, Naila, Germany | 60203214 | |
| Isofluorane | Any genericon | ||
| Heparin | Any genericon | ||
| 0.9% saline | Any genericon | ||
| Buprenorphine | Any genericon | ||
| Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | ||
| Microscop | Zeiss | Opmi MDO/S5 | |
| Vaporiser | Eickemeyer | TEC3 | |
| Ultrasound | Vevo, Canada | 770,2100 |
References
- Rowinska, Z., et al. Non- invasive in vivo analysis of a murine aortic graft using high resolution ultrasound microimaging. Eur J Radiol. 81 (2), 244-249 (2012).
- Daugherty, A. Mouse models of atherosclerosis. Am J Med Sci. 323 (1), 3-10 (2002).
- Xu, Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts. Am J Pathol. 165 (1), 1-10 (2004).
- Daugherty, A., Cassis, L. A. Mouse models of abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc .Biol. 24 (3), 429-434 (2004).
- Zernecke, A., Shagdarsuren, E., Weber, C. Chemokines in atherosclerosis: an update. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (11), 1897-1908 (2008).
- Chereshnev, I., et al. Mouse model of heterotopic aortic arch transplantation. J Surg Res. 111 (2), 171-176 (2003).
- Koulack, J., McAlister, V. C., Giacomantonio, C. A., Bitter-Suermann, H., MacDonald, A. S., Lee, T. D. Development of a mouse aortic transplant model of chronic rejection. Microsurgery. 16 (2), 110-113 (1995).
- Engelbrecht, G., Kahn, D., Duminy, F., Hickman, R. New rapid technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 13 (6), 340-344 (1992).
- Baxter, K., Hao, P. M., Howden, B. O., Saunder, A., Jablonski, P. Modified technique of abdominal heart transplantation in the rat. J Heart Lung Transplant. 17 (11), 1057-1064 (1998).
- Dambrin, C., Calise, D., Pieraggi, M. T., Thiers, J. C., Thomsen, M. Orthotopic aortic transplantation in mice: a new model of allograft arteriosclerosis. J Heart Lung Transplant. 18 (10), 946-951 (1999).
- Siemionow, M. Histopathology of microarterial anastomoses: end-to-end versus end-in-end (sleeve) technique. J Hand Surg Am. 15, 619-625 (1990).
- Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N Engl J Med. 354 (6), 610-621 (2006).
- Sun, H., et al. Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation. Microsurgery. 18 (6), 368-371 (1998).
- Guo, L., Agarwal, A., George, J. F. Orthotopic aortic transplantation in mice for the study of vascular disease. J Vis Exp. (69), e4338 (2012).
