Summary
우리는 orthotopic 대동맥 이식 모델 마우스에 슬리브 기술을 사용 하 여 현재. 혈관 질환의 연구에 사용할 수 있는 매우 빠른 문 합 방법 이다.
Abstract
Orthotopic 대동맥 이식 슬리브 기술을 사용 하 여 단지 10-20%의 고장율과 대동맥에 부상을 줄일 수 있습니다. 시간 anastomose 슬리브 메서드를 사용 하 여 마우스에 대동맥을 짧고 쉽게 iso/여 보세요 이식의 연구를 허용 하는 20 분을 평균 했다. 다음 문서는 우리의 실험실에서 사용 하는 대동맥 이식 절차를 설명 합니다. 생쥐는 1.5% 볼륨 isoflurane와 얼굴 마스크를 통해 100% 산소의 혼합물으로 취 했다. 이 시점에서, 신장 동맥 및 그것의 분기 사이 대동맥의 세그먼트는 베 나 정 맥, 자유롭게 준비 및 clampedat에서 분리 된 단일 실크 봉합과 인접 하 고 원심 세그먼트. 대동맥의 제거, 이전 염 헤 파 린을 포함 하는 열 등 한 베 나 정 맥에 주입 됩니다. 대동맥은 클램프 사이 렸 그리고 염 분 덤플링을 솔루션 루멘 이용 되었다. Monofilament 봉합 소매 기술 orthotopic 위치에서 복 부 대동맥을 이식 하기 위해 사용 되었다.
Introduction
이전 연구에서 지적, 큰 관심 murine 대동맥 이식 모델 자체 이식으로 인 한 특정 혈관 응답 및 arteriogenic 환경 연결 특정 조직 요인 사이 차별을 허용 하는 지급 되었습니다. 1 , 2 , 3. 여기에 중요 한 역할을 담당 하는 주요 요인은 녹아웃, 유전자 변형 마우스의 가용성 이다. 식별 하 고 퇴행 성 혈관 질환, 동맥 경화, 동맥 류 형성4, 등의 개발과 관련 된 새로운 pathophysiological 경로 결정의 가능성을 제공 하는 이러한 모델 들의 참여 5.
그것은 내장 국 소 빈 혈 또는 reperfusion를 접목 하는 동안 부상을 위한 이식 혈관에 나타날 수 있습니다 지적 가치가 있다. 따라서, 특정 문제 이식 무결성 또는 수술 기간 동안 예기치 않은 염증 반응의 발생 제외할 수 없습니다 가능성이 제외 퇴행 성 혈관 질환3 에에서 병 태 생리 변화 ,45,,67. 소매 문 합 미만 1 밀리미터의 직경을 가진 혈관의 동맥 문 합에 대 한 대체 끝에 방법 이며 대동맥에 연속적으로 적응 시켰다는 쥐에 있는 신장과 심장 이식에 성공적으로 적용 된는 Dambrin 그 외 여러분 에 의해 쥐에 이식 8 , 9 , 10 , 11.
대동맥 손상 슬리브 이식 기법을 사용 하는 매우 낮은 기술 고장율, 평균 20 분 지속 그것 때문으로 최소화 됩니다. 우리의 이전 결과 소매 기술1을 사용 하 여 이식 후 isograft에는 vivo에서 의 우수한 기능 및 구조적 특성을 증명 하고있다. Dambrin 그 외 여러분 설명 후 짧은 학습 곡선 성공률은 78% 이상10. 혈전 증 등의 합병증은 드물다, 예 Engelbrecht 외. 쥐8신장 이식에서 소매 기술을 사용 하 여 혈전 증을 관찰 하지 않았다.
소매 anastomoses와 murine 대동맥 이식 모델 이식 선박에서 iso/이식 반응 연구를 신속 하 고 쉬운 도구입니다. 이 비디오에서는 우리의 실험실에서 실시 하는 대동맥 이식 절차를 보여 줍니다. 이 이식 모델 혈관 퇴행 성 질환의 기본 병 적인 메커니즘을 정의 하는 데 유용할 수 있습니다 그리고 분자 약리학 내정간섭12의 추가 평가에 기여할 수 있습니다.
Protocol
동물 주제와 관련 된 절차는 RWTH 아 헨 대학, AZ 84-02.04.2012.A234에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 했다.
참고: 절차는 CD1 배경을 가진 성인 남성 강포한 유형 쥐를 사용 하 여 보여 줍니다. 음식, 전문된 수의 제어, 그리고 치료에 대 한 적절 한 액세스 보장 수술 전후 특수 실험실 단위에서 생쥐를 유지. 동물에서 구입 하는 경우 밖에 서 수술을 수행 하기 전에 일주일 순응 허용.
1. 기증자의 준비
- 불 임 자료와 악기를 사용 하 여 감염을 피하기 위해 수술 하는 동안 멸 균 상태를 유지.
- 볼륨 isoflurane와 얼굴 마스크를 통해 100% 산소에 의해 1.5%의 혼합물으로 각 마우스를 anesthetize. 운영 테이블에 모든 다리 부정사 위치에 테이프 플랫폼에 마우스를 하다. 마우스는 충분히 마 취 해야 뒷 발을 곤란 하 게 하 여 그 반사를 확인 합니다. 절차 동안 건조를 방지 하기 위해 눈에 안과 연 고를 배치.
- Depilatory 젤을 사용 하 여 복 부에서 모든 머리카락을 제거 하거나는 면도기를 사용 합니다. 무 균 조건 하에서 작업을 수행 합니다. 수술 용 멸 균 물과 액체의 교류와 함께 복 부를 소독.
- 가 위 또는 메스 중간 복 부 절 개를 통해 기증자 대동맥을 제거합니다. 수동으로 오른쪽에 창 자를 철회. 부드럽게 수동으로 파우더 무료 장갑을 사용 하 여 측면 창 반영.
- 창 촉촉한 유지 하는 식 염 수와 접촉 하는 거 즈의 조각 장소.
- 멀리 핀셋으로 무딘 해 부를 사용 하 여 주변 조직에서 매우 신중 하 게 복 부 대동맥 해 부.
- 핀셋으로 신장 동맥과 베 나 정 맥에서의 분기점 사이 대동맥의 세그먼트 분리.
- 매우 신중 하 게 11-0 monofilament 하나의 봉합 사를 사용 하 여이 세그먼트의 모든 작은 가지 보안.
- 대동맥을 제거 하기 전에 0.5 밀리 리터 (mL) 염 덤플링 50 U를 포함 하는 열 등 한 베 나 정 맥으로 주사.
- Exsanguinate 대동맥의 세그먼트를 제거한 후 기증자 동물 하자.
- 린스 식 염 수와 완벽 하 게 이식 하 고 다음 차가운 식 염 수의 컨테이너에 즉시 전송.
2. 받는 사람의 준비
- 볼륨 isoflurane와 얼굴 마스크를 통해 100% 산소에 의해 1.5%의 혼합물으로 받는 사람 동물을 Anesthetize 다음 머리를 제거 하 고 소독 (제 1). 메스와 골반에 있는 칼에서 중순 라인 절 개 하 고 복 부 벽을 철회 합니다. 절차 동안 건조를 방지 하기 위해 눈에 안과 연 고를 배치.
- 생리 식 염 수에 장 거 즈를 습 하 게 하 고 동물을 매우 부드럽게 치환 포장 ' s 오른쪽.
- Dissect infrarenal 대동맥 proximally 신장 동맥 사이 무료 및 핀셋으로 distally 분기.
- 매우 신중 하 게 11-0 monofilament 하나의 봉합 사를 사용 하 여이 세그먼트의 모든 작은 가지 보안.
- 단일 실크 봉합에 6-0와 대동맥의 인접 하 고 원심 부분을 클램프.
- 는 클램프 사이의 중간에 대동맥을 분할 하 고 관개를 루멘 오픈 heparinized 염 분으로 잘라 끝.
- 제대로 기증자와 받는 사람 (정렬 하 여 대동맥의 어떤 비틀림을 방지 하도록 하는 11-0 monofilament와 봉합 뒤 받는 선박에 삽입 먹이 그릇 엔드와 orthotopic 위치에는 이식 장소 그림 1) 10.
- 신중 하 게는 합자는 문 합에의 한 검사를 실시 후 공개. 먼저 원심 클램프를 해제 합니다. 이 인접 고압 측을 풀어 놓기 이전 함께 벽을 잡고 낮은 압력에서 결과.
- Perfuse는 이식 즉시와 보이는 펄스에 대 한 확인. 부드럽게 실크의 잔해를 제거 합니다. 기증자와 받는 사람 대동맥 사이의 최적의 겹침 길이 1-2 m m.
- 복 부 구멍에는 복 부 내용을 반환 하 고 전체를 닫습니다 실행 3-0 polyglycolic 산 봉합 된 상처.
- 마우스 buprenorphine 줄 (0.05 mg/kg 체중을 피하 (SC)) 마 취 종료 되기 전에.
- 두지 마십시오 동물 무인 완전히 식을 때까지. 통증 관리 치료 buprenophine 0.05 mg/kg 체중 관리 SC 작업 후 3 일 동안 하루에 세 번 기관 감독 기관에 의해 승인.
- 조직 수확, anesthetize로 받는 사람 마우스 대 위에서 설명한 및 플러시 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 선박 4% 포름알데히드/PBS, (pH = 7.4) 심장 빵 꾸 여. 이식 부드럽게 제거 합니다. 4% 포름알데히드/PBS에 야간 고정, 후 프로세스 표본 추가 및 파라핀에 포함.
Representative Results
혈전 증의 높은 위험 했지만 쥐 없이 관찰된 물리적 장애가 있는 15-30 분 이내 마 취에서 회복. 초음파 분석 수술 후 수행 하는 동안 사용 되었다. 연구에 사용 하는 야생 타입 마우스 전시 그들의 루멘의 크기 변경. 따라서, stenoses도 aneurysmal 형성 관찰 되었다. 이식 동물 전시 배 벽 (그림 2)의 패 개발 하지 못했습니다.
Immunohistology 등 기존의 얼룩 절차 상 패, 패턴의 부드러운 근육 세포 및 대 식 세포의 축적을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 우리의 연구는 조직학 immunohistochemical 얼룩이 지는 이식의 무결성을 테스트 하려면 접목 후 6 주를 수행 했다. 조직학 얼룩 (Hematoxylin와 (그가) 오신 immunohistochemical 얼룩 (부드러운 근육 걸 (SMA)와 대 식 세포 (MAC2)) (그림 3) 우리에 게 보여준 없고 안 감 그대로 내 피 세포, 평활 근 세포의 분포 패턴을 그대로 셀은 intima에 축적 이러한 결과 아무 중요 한 병 변 또는 셀 활성화 이식할된 선박 (그림 3)에서 검색 되었습니다 나타냅니다.
그림 1 : 기술 슬리브. 복 부 대동맥 슬리브 기술을 사용 하 여 이식 했다. 이 절차에서는 기증자의 대동맥 표면에 물린 먹이 그릇에 함께 orthotopic 위치에 배치 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 자가 초음파 이미지. 이식 후 이식 (A), 그것의 3 차원 초음파 (B), B 모드 보기 (C) 6 주의 자가 (검 시) 보기의 예. 수술 후 후속 초음파를 사용 하 여 실시 했다. 그림 루멘 크기에서 변화 없이 이식의 patency를 보여준다. 또한, stenoses 또는 aneurysmal 형성 관찰 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 조직학 및 immunohistochemistry 이미지. 이식 후 6 주에 이식된 동물의 조직학 및 immunohistochemistry 대표 이미지. 아니 중요 한 병 변 조직학으로 이식된 aortas에서 관찰 되었다 (Hematoxylin 및 오신, 그는, 100 배 확대, 눈금 막대 = 50 µ m), immunohistochemical (부드러운 근육 걸 SMA (빨강), 또는 대 식 세포 MAC2 (녹색), 200 배 확대, 스케일 바 = 얼룩 25 µ m)입니다. 핵은 카운터 스테인드 DAPI에서 (파란색). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 연구에 앞서 다양 한 다른 이식 모델 마우스에 철저 하 게 분석된3,6,7,10,,1314했다. 그것은 우리의 조건과 일치 하 고 기존의 엔드-투-엔드 봉합 방법에 비해 슬리브 문 합의 높은 신뢰성 대동맥 이식 하 여 소매 기술 수정 Dambrin 그 외 여러분 의 모델 선정 되었습니다. 1 , 10.
이 기술은 여러 가지에서 유리한 크로스-클램프 시간이 상당히 감소 수술 동안 대동맥에 손상을 최소화 이다. 혈전 증의 발생률이 낮은 그릇 구경 기증자와 받는 사람 사이에서 잠재적인 불일치를 피하고 외에 관찰 되었다. 위의 관찰 확인이 기술은 쥐에서 대동맥 이식 혈관 질병 조사에 매우 적합 합니다.
후속 연구에서 초음파 이식 후 8 주를 수행 했다, 중요 한 변경 감지 했다. 이 확인 대동맥 수술 동안에 손상을 최소한의1될 것 이라고 가정을 했다.
이 문서에서 제공 하는 이식 절차 모두 이식 무결성 및 그것의 기능에 아무런 장애를 보장 합니다. 따라서,이 실험적인 이식 모델 유전자 조작된 생쥐에서 퇴행 성 혈관 질환의 미래 분자 및 약리 수사를 위해 귀중 한 도구로 사용할 수 있습니다 결론 수 있습니다.
우리는 비디오 가이드가 간단한 arterio 동맥 모델의 사용을 설명 하는 교재로 작동할 수 그것은 혈관 병 리에 많은 중요 한 문제에 더 유익한 토론에 기여할 것입니다 믿습니다. 이 매우 빠른 문 합 방법 유전자 조작된 생쥐에서 혈관 질환 연구에 사용할 수 있습니다. 그것은 또한 이식 함께 동맥 모델에 수정으로 사용할 수 있습니다.
절차 동안 한계점이 있다. 봉합 자체의 배치 하는 것은 가장 중요 한 단계입니다. 외과 의사 기증자와 받는 사람의 적절 한 맞춤으로 대동맥의 어떤 비틀림을 방지 하는. 클램프 검사는 문 합 후 신중 하 게 제거 됩니다. 항상 먼저 함께 방출 이전에 인접 고압 측 벽을 잡고 낮은 압력의 결과로 원심 클램프를 공개 합니다. 방출의 순서를 따라 제대로의 결과 출혈 될 것 이다.
Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
우리는 로마 Wieczorek에 그들의 우수한 편집, 피터 Kurdybacha 그리고 레온 데커 울 리 Heuter에 그들의 우수한 기술 지원 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halsey Needle Holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Dumont #5 Forceps - | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Lexer-Baby Scissors | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Castroviejo Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Vannas Scissors | Aesculap, Germany | Typ OC498R | |
| Castroviejo Suture Forceps | Geuder, Germany | 19015 | |
| 6-0 silk black (Silk) | Deknatel, Research Triangle Park NC, USA | 18020-60- FST | |
| 11-0 monofilament (Ethilon) | Ethicon, Norderstedt, Germany | EH7438G | |
| 3-0 polyglycolic acid suture (Serafit) | Serag-Wiessner, Naila, Germany | 60203214 | |
| Isofluorane | Any genericon | ||
| Heparin | Any genericon | ||
| 0.9% saline | Any genericon | ||
| Buprenorphine | Any genericon | ||
| Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | ||
| Microscop | Zeiss | Opmi MDO/S5 | |
| Vaporiser | Eickemeyer | TEC3 | |
| Ultrasound | Vevo, Canada | 770,2100 |
References
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