Abstract
Les espèces de Bacillus contiennent la chaîne et des acides gras insaturés (AF) ramifiés avec des positions diverses de la branche de méthyle (iso ou anteiso) et de la double liaison. Changements dans la composition FA jouent un rôle crucial dans l'adaptation des bactéries à leur environnement. Ces modifications entraînent un changement dans le rapport des iso contre anteiso ramifié AF, et la proportion de insaturée AF par rapport à saturé AF, avec des doubles liaisons créées à des positions spécifiques. L' identification précise du profil FA est nécessaire de comprendre les mécanismes d'adaptation des espèces de Bacillus.
Bon nombre des AF de Bacillus ne sont pas disponibles dans le commerce. La stratégie proposée ici identifie AC en combinant des informations sur le temps de rétention (par le calcul de la longueur de chaîne équivalente (ECL)) avec les spectres de masse des trois types de dérivés FA: des esters méthyliques d'acides gras (FAME), 4,4-diméthyl oxazoline dérivés (DMOX), etester 3-pyridylcarbinyl (picolinyle). Cette méthode permet d'identifier les AF sans la nécessité de purifier l'inconnu AF.
En comparant les profils chromatographiques de FAME préparé à partir de Bacillus cereus avec un mélange commercial de normes permet l'identification de chaîne droite saturée AF, le calcul de la ECL, et les hypothèses sur l'identité de l'autre AF. FAME de ramifiés saturés AF, iso ou anteiso, afficher un décalage négatif constant dans la ECL, contre linéaires saturés avec AF le même nombre de carbones. FAME de insaturée AF peuvent être détectés par la masse de leurs ions moléculaires, et se traduisent par un changement positif dans la ECL par rapport aux AF saturés correspondants.
La position de branchement des AF et la position de double liaison insaturée d'AF peuvent être identifiés par l'ionisation d'électrons spectres de masse des picolinyle et DMOX dérivés, respectivement. Cette approche identifie toutes les branches saturée inconnueed AF, insaturé linéaire AF et AF ramifiés insaturés de l'extrait B. cereus.
Introduction
l'acide gras Chromatographie ester méthylique (FAME) de gaz (GC) est une méthode essentielle pour la caractérisation des lipides. Il se sépare rapidement et quantifie les différents acides gras (AF) d'un échantillon après une courte étape d'extraction. Les produits dérivés d'esters méthyliques sont très volatils, stable et inerte vers la colonne chromatographique, ce qui évite des pics de résidus. Leur identification est assez simple lorsque l'échantillon est constitué d'AF bien connus parce que les profils chromatographiques sont soit publiés ou par rapport aux normes. En outre, l'injection répétée de normes d'étalonnage pour la quantification des différents AF est pas nécessaire, compte tenu de leur réponse presque constante à la détection à ionisation de flamme (FID) 1.
En plus de la FID, la spectrométrie de masse (MS) de détection fournit un ensemble complémentaire d'informations pour confirmer FAME. Toutefois, lorsque FAME sont facturés en utilisant l'ionisation électronique (EI), les spectres obtenus ne permettent pas toujours eidentification e de FA structure fine. Par exemple, la position de branchement (ie, un groupe méthyle ramifié) est difficile à prévoir parce que les ions de diagnostic sont difficiles à détecter 1 et le changement caractéristique de l'abondance des ions cible est dépendant de la machine, ce qui empêche l'utilisation de bibliothèques de spectres de masse 2. Un autre défi consiste à identifier la position de double liaison, car l'assurance-emploi provoque migration de la double liaison. Ainsi, les isomères FA avec diverses positions de doubles liaisons ne peuvent pas être différenciés par leurs spectres de masse. Heureusement, d'autres outils ont été développés pour l'identification FA. Par exemple, la présence et la position de ramification ou de doubles liaisons dans AF peuvent être conjecturé en calculant la longueur de chaîne équivalente (ECL) 3.
D'autres méthodes de dérivatisation se traduisent par des spectres de masse différente, en fonction de la localisation d'une double liaison ou d'un groupe méthyle ramifié. 4,4-diméthyl dérivés de l' oxazoline (DMOX) 4 permettent de easidentification y de la position de l'acide gras monoinsaturé doubles liaisons. 3-pyridylcarbinyl dérivés ester (ester de picolinyle) permettent d'identifier sans ambiguïté de l'emplacement de ramification méthyle AF 5. La combinaison de rétention chromatographique (ECL) et les spectres de masse (DMOX et picolinyle) l' information permet l'identification de la plupart des autorités fédérales , sans la nécessité d'utiliser des méthodes complexes de purification, tel que requis pour la résonance magnétique nucléaire (RMN), la méthode incontestable pour la caractérisation structurale 1 .
Les bactéries du genre Bacillus, qui comprennent certains agents pathogènes humains et animaux, sont capables de coloniser très diverses niches et sont donc largement distribués dans l'environnement 6. Parmi genre Bacillus, la composition FA est influencée par la niche écologique de l'espèce avec des modulations dans les modèles FA adapter à un large éventail de changements environnementaux (par exemple, le milieu de croissance, la température,pH, etc.) 7-9. En raison de la relative homogénéité du modèle FA entre les espèces du genre Bacillus au cours de la croissance dans des conditions normalisées, la détermination de la composition en acides gras est l' un des critères essentiels permettant de définir les espèces de Bacillus. Un attribut unique du genre Bacillus est l'abondance de Fas à chaîne ramifiée contenant 12-17 atomes de carbone 10-12 avec le rapport entre iso et Anteiso isomères étant un déterminant clé de l' adaptation aux conditions environnementales. Bacillus species adaptent également aux fluctuations environnementales en modifiant la proportion d'acides gras insaturés. Chez certaines espèces, telles que Bacillus cereus, deux désaturases d'acides gras et de créer des doubles liaisons dans des positions différentes de la chaîne alkyle 13 ayant des rôles différents dans l' adaptation 9. L'exemple du genre Bacillus illustre l'importance d'identifier précisément la position de double liaison et FA ramification. Collecteivement, l' identification des motifs Bacillus FA a plusieurs applications utiles. Ici, nous proposons une nouvelle approche GC-MS pour Bacillus FA identification de motif qui surmonte les limitations inhérentes à une analyse GC-MS classique.
Cette approche innovante peut être utilisée directement sur le matériel biologique brut, et se compose d'une combinaison de techniques existantes: des informations sur les temps de rétention (ECL) et les spectres de masse des différents dérivés (AF FAME, DMOX et picolinyle-ester).
Nous utilisons la nomenclature FA suivante. i, a et n indiquent iso, anteiso ramification méthyle, et de l'acide gras à chaîne droite, respectivement. AC insaturées ont été désignés par C: D où C est le nombre d'atomes de carbone dans l'acide gras et d est le nombre de doubles liaisons. Δ x indique la position de la double liaison, où la double liaison est située sur la liaison xième carbone-carbone, en comptant à partir de la fin de l' acide carboxylique.
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Protocol
1. Cultures bactériennes
- Préparer une pelouse des bactéries (Bacillus cereus souche ATCC 14579) en étalant 100 ul d'une culture de nuit de la souche en incubation à 30 ° C dans du milieu LB (milieu Luria-Bertani), sur la surface d'une plaque de milieu LB gélose. Incuber la plaque pendant une nuit à 30 ° C.
2. ECL: chaîne Longueur équivalente
- Calculer ECL comme suit:
avec:
i, le soluté d'intérêt;
n, le nombre de carbone de l'ester méthylique de la chaîne d'acides gras saturés à chaîne droite en éluant avant soluté I;
n + 1, le nombre de carbone de l'ester méthylique saturé à chaîne d'acide gras linéaire en éluant après soluté I;
Rti, Ret, Tr (n + 1), les temps de rétention des pics de FAME décrits ci-dessus.
NOTE: Obtenir les temps de rétention des droites esters chaîne d'acides gras saturés de méthyle par injection d'un mélange de normes (BAME).
avec: 3. FAME Préparation et analyse
- Afin d'obtenir des acides gras des lipides, des cellules bactériennes récolte en grattant les colonies de la plaque d' agar et transférer 40 mg (poids frais, ce qui équivaut à 10 9 cellules viables) de bactéries dans un tube en verre de 10 ml avec des bouchons à vis et des joints d' étanchéité en PTFE.
- Effectuer une transestérification par l' intermédiaire de l'ester 14,15 procédé de liaison décrit ci - dessous.
- Ajouter 5 ml de KOH 0,2 M dans le methanol, les cellules bactériennes fraîches et incuber à 37 ° C pendant 1 heure. Cette réaction consiste en une méthanolyse alcaline, la rupture de la liaison ester dans le lipide et pour produire des esters méthyliques d'acides gras.
- Ajouter 1 ml d'acide acétique 1 M pour abaisser le pH à 7,0. Vérifier le pH avec des bandelettes de test de pH.
- Ajouter 3 ml d'hexane pour extraire FAME.
- Transférer le surnageant (phase organique) dans des tubes propres et on concentre par évaporation à température ambiante sous un courant continu d'azote pour obtenir environ 200 ulde l'extrait. Transférer l'échantillon dans un flacon de GC avec insert.
- Injecter extraits dans une chromatographie-spectrométrie de masse de gaz du système (GC-MS).
4. GC / MS Conditions
- Injecter les échantillons de FAME dans un appareil GC-MS équipé d'une ZB-WAX colonne capillaire (longueur 30 m, diamètre 0,25 mm, épaisseur du film 0,25 pm).
- Définir l'orifice d'injection (en mode splitless) de température à 250 ° C. Utiliser l'hélium comme gaz porteur, à une vitesse linéaire de 37 cm / s. Maintenir la température du four à 50 ° C pendant 1 min, augmenter à 190 ° C à une vitesse de 20 ° C / min, et encore augmenter pour atteindre une température finale de 230 ° C à une vitesse de 2 ° C / min.
- Pour les MS, enregistrer les spectres de masse par ionisation électronique (EI) à 70 eV, et définir l'acquisition du courant ionique total entre 50 et 400 unités atomiques de masse (uma) (2 scans / sec).
- Au besoin, injecter DMOX et picolinyle dérivés sous la même condition except le four programme de température comme suit:
DMOX: 50 ° C (1 min), 20 ° C / min jusqu'à 210 ° C et 2 ° C / min jusqu'à 240 ° C (5 min);
Picolinyle: 6 ° C (1 min), 20 ° C / min jusqu'à 220 ° C et 2 ° C / min jusqu'à 250 ° C (20 min).
5. picolinyle Ester Préparation à partir de FAME 16
- Evaporer l'extrait de FAME de la section 3 avec un flux d'azote (au moins 10 mg de matière sèche) et dissoudre dans 1 ml de dichlorométhane sec.
- Préparer une solution à 1,0 M de potassium ter t-butoxyde dans du tétrahydrofuranne.
- Ajouter l'extrait de FAME et 0,2 ml 3-pyridineméthanol à 0,1 ml de solution faites à l'étape 5.2.
- Chauffer la solution à 40 ° C pendant 30 min dans un flacon fermé.
- Après refroidissement à température ambiante, on ajoute de l' eau déionisée purifiée (2 ml, voir le tableau des matériaux) et de l' hexane (4 ml). Mélanger avec un vortex, permet de séparer la phase, et de recueillir la phase organique.
- Dry en ajoutant du sulfate de sodium anhydre jusqu'à ce que la phase organique est parfaitement claire. Transférer dans un tube propre. Ensuite, on évapore à 200 pi. Transférer l'échantillon dans un flacon de GC avec insert.
6. DMOX Préparation à partir de FAME 17
- Evaporer l'extrait de FAME de la section 3 avec un flux d'azote (matière sèche d'au moins 10 mg).
- L'extrait sec FAME, ajouter 250 mg de 2-amino-2-méthyl-1-propanol. Rincer le récipient avec de l'azote, ajouter un bouchon, et le placer dans un bloc chauffant pendant une nuit à 190 ° C.
- Après refroidissement à température ambiante, ajouter 3 ml de dichlorométhane au tube, et 5 ml d' eau purifiée déminéralisée (voir le tableau Materials).
- Agiter pour la séparation de phase, puis retirer la phase aqueuse.
- Laver la phase organique avec 5 de l'eau. Agiter pour la séparation de phase, puis retirer la phase aqueuse.
- Sec en ajoutant du sulfate de sodium anhydre jusqu'à ce que la phase organique est parfaitement claire etle transférer dans un tube propre. S'évaporer sous un courant d'azote jusqu'à atteindre un volume de 200 ul. Transférer l'échantillon dans un flacon de GC avec insert.
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Representative Results
La stratégie d'identification des cellules bactériennes FA est présenté sur la figure 1. Chaque étape fournit des informations ou des informations sur la rétention chromatographique spectrale complémentaire. L'étape 1 consiste d'identification FA préliminaire en utilisant une solution standard. Étape 2 permet l'interprétation des spectres EI FAME et de leur ECL, afin d'identifier provisoirement les produits. Étape 3 identifie l'emplacement de branchement exacte à chaîne ramifiée-Fas. Enfin, l'étape 4 identifie la position précise des doubles liaisons insaturées AF.
FAME et ECL
Le mélange BAME nous a permis d'identifier une série de chaîne linéaire d'acides gras saturés (n12 à n17) et certains méthyle acide gras ramifié (i15, a15, i16, i17). Cependant, très peu spécifique à AF B. cereus ont été détectés dans notre échantillon, ce qui justifie le dévepements de la méthode d'identification décrite ci-dessous.
AF Indépendamment de la longueur de la chaîne, ramifiée , saturée (iso ou anteiso) d'une série homologue ( à savoir, une série de composés avec la même formule générale) présentent un décalage constant dans ECL par rapport à la ligne droite saturée FA ayant le même nombre de carbone dans leur à chaîne carbonée. Ce changement, appelée longueur de chaîne fractionnaire (LCM), permet l'identification du SAF dans une série homologue. Par exemple, l'iso-Fas (désigné par le préfixe "i") ont une valeur de -0.48 FCL, tandis que Anteiso AF (notée avec le préfixe «a») ont une LCM de -0.33. Il est alors facile d'identifier un i14 et i13 avec une ECL de 13,52 et 12,52, respectivement, et un a13 et a15 avec une ECL de 12,67 et 14,66, respectivement.
Le tableau 1 présente les LCE pour chacune des AF détectées dans notre échantillon. Les temps de rétention prédisented pour iso et anteiso série, ainsi que MS spectres obtenus avec FAME, nous a permis d'identifier tous la chaîne FA-ramifié de notre échantillon. Une telle identification à cette étape était provisoire, mais plus tard confirmé par les spectres EI obtenus à partir de dérivés de picolinyle AF.
FAME avec LCE ne correspondant pas à l'iso ou Anteiso changements sont insaturés, à chaîne droite ou ramifiée AF, comme indiqué par la masse de leur ion moléculaire. AF insaturées montrent un changement positif dans ECL par rapport à la FA saturé correspondant. Spectra à partir de dérivés DMOX, combinés avec des spectres de dérivé picolinyle pour ramifié AF, permettre l'identification de position de la double liaison.
De telles méthodes de dérivatisation sont appropriées pour l' identification FA seulement lorsque l' ordre d'élution est retenu, comme indiqué pour les trois mélanges dérivés (ie, FAME, DMOX et picolinyle) dans la figure2 pour plusieurs 16: 1 AF. Cette approche permet la collecte d'information spectrale complémentaire d'un pic en utilisant 3 méthodes de dérivatisation qui peuvent être combinés pour identifier la structure FA. Aucune différence dans l'ordre d'élution ont été observées entre les 3 produits dérivés, bien que les temps de rétention et les températures du four étaient différentes.
esters picolinyle d'iso et anteiso acide gras méthylique à chaîne ramifiée saturée
Les spectres obtenus par l'IE confirmer la présence de méthyle AF à chaîne ramifiée. En effet, les ions moléculaires ont le m / z correspondant à FA saturés. Nous avons observé une série d'ions avec un écart de 14 unités de masse (uma) correspondant à une perte d'un groupe méthylène, sauf dans la zone du point de ramification, où l'ion correspondant à l'atome de carbone substitué est manquant. On observe alors un écart de 28 amu entre les deux ions correspondant à des fragments créé avant etaprès que le carbone ramifié. La figure 3 montre le spectre i16 avec les ions de diagnostic (304 et 332) indiquant l'emplacement de branchement.
DMOX de chaîne linéaire d'acides gras insaturés
La figure 2 présente les cinq pics différents associés à 16: 1 d' acide gras. Les deux premiers pics ont des valeurs ECL <16. Nous en concluons que leur structure est certainement ramifiée. L'identification de ces composés nécessite l'interprétation des spectres de masse produits par DMOX et des dérivés d'ester de picolinyle. Trois pics possédant ECL> 16 correspondance acides gras monoinsaturés linéaires. DMOX spectres de masse dérivés montrent ions de diagnostic identifiant la position de la double liaison de ces composés. Dans la figure 4 , nous pouvons voir un écart de 12 amu ions entre 196 et 208 indiquant la présence de la double liaison avec le carbone 8 de la n16: 1 Δ
spectres DMOX et la masse picolinyle de méthyle à chaîne ramifiée monoinsaturés acides gras
La figure 6 présente les spectres de DMOX et les dérivés d'esters picolinyle, utilisés pour déterminer la structure des i16: 1 Δ 9 FA. La position de laramification est indiqué par un écart de 28 uma pour les deux dérivés. Un écart de 12 uma pour DMOX et 26 pour l' ester picolinyle identifie la position de double liaison, comme le montre la figure 6.
L'identification des acides gras et des ions diagnostiques
Le tableau 1 montre les différents acides gras identifiés, avec les ions de diagnostic correspondants, dans Bacillus cereus ATCC 14579 cultivées à 30 ° C. Ces ions de diagnostic identifient les positions des ramifications de méthyle et de doubles liaisons dans la chaîne de carbone pour les dérivés d'ester et DMOX picolinyle, qui fournissent des informations structurelles complémentaires. Les deux approches sont vraiment complémentaires, sous forme d'ions de diagnostic sont parfois plus faciles à observer avec des dérivés de DMOX, et à d'autres moments plus faciles à observer avec des dérivés de picolinyle.
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Figure 1: Stratégie pour l'identification des acides gras dans Bacillus cereus.
Les étapes successives de génération d'informations sur les temps de rétention (ECL), sur les spectres de masse de FAME, de DMOX et de picolinyle-ester sont présentés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Comparaison des profils chromatographiques pour différents 16: Acides gras 1 détectés dans Bacillus cereus.
(A) des dérivés de FAME (d'ion moléculaire extrait à m / z 268); Les dérivés de (DMOX d'ion moléculaire à m / extrait z 307) (B); (C) des dérivés de (picolinyle ion moléculaire extrait à m / z 345).iles / ftp_upload / 54960 / 54960fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: picolinyle i16 spectre de masse dérivé généré par ionisation électronique.
Ions à m / z 151 et m / z 164 indiquent la présence d'un dérivé de picolinyle d'acide gras. L'ion moléculaire à m / z 347 est identifié comme étant un isomère de l'acide palmitique. La présence d'un écart de 28 amu entre l'ion à m / z 304 et m / z 332 est une indication de i16. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: n16: 1 Δ 8 DMOX spectre de masse dérivé généré par électronsionisation.
L'ion à m / z 126 indique un dérivé DMOX, m / z 307 est l'ion moléculaire de 16: 1 DMOX et la présence d'un écart de 12 amu entre les ions à m / z 196 et m / z 208 identifie l'emplacement de double liaison sur le carbone 8. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: n16: 1 Δ 5 DMOX spectre de masse dérivé généré par ionisation électronique.
Ion à m / z 126 est indicatrice d'un dérivé de DMOX et m / z 307 est l'ion moléculaire de 16: 1 DMOX. Le m intense / z 153 ion est caractéristique d'une double liaison située sur le carbone 5. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: DMOX ( en haut) et picolinyle ( en bas) comparaison de i16: 1Δ 9 spectres.
Dans les deux cas, l'écart de 28 amu indique la position de la ramification méthyle. L'emplacement de double liaison peut être obtenue par un écart de 12 amu et 26 amu pour DMOX et picolinyle dérivés, respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| composés putatifs | ion moléculaire (m / z) FAME; DMOX; picolinyle | RT | ECL | identification confirmée | ions de diagnostic DMOX | ions de diagnostic picolinyle |
| i12 | 214; 253; 291 | 7,93 | aucune référence | i12 | [276 (15); 262 (0); 248 (15)] mb | |
| n12 | 214; 253; 291 | 8.21 | 12.00 | n12 | [276 (10); 262 (20); 248 (20)] mb | |
| i13 | 228; 267; 305 | 8,53 | 12.5 | i13 | [290 (15); 276 (0); 262 (48)] mb | |
| a13 | 228; 267; 305 | 8,64 | 12.67 | a13 | [276 (48); 262 (0); 248 (65)] mb | |
| i14 | 242; 281; 319 | 9.24 | 13.52 | i14 | [304 (20); 276 (45) 290 (0)] mb | |
| n14 | 242; 281; 319 | 9.60 | 14.00 | n14 | [304 (7); 290 (17); 276 (17)] mb | |
| i15 | 256; 295; 333 | 10,06 | 14,51 | i15 | [318 (20); 314 (0); 290 (50)] mb | |
| a15 | 256; 295; 333 | 10.19 | 14.66 | a15 | [304 (30); 290 (tr); 276 (62)] mb | |
| n15 | 256; 295; 333 | 10,49 | 15.00 | n15 | [318 (5); 304 (13); 290 (18)] mb | |
| i16 | 270; 309; 347 | 11.04 | 15.5 | i16 | [332 (18); 318 (tr); 304 (42)] mb | |
| ramification méthyle 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.19 | 15,64 | i16: 1Δ 5 | [152 (2); 153 (10)] db [292 (3); 278 (tr); 264 (2)] mb | |
| ramification méthyle 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.40 | 15.83 | i16: 1 Δ 9 | [210 (3) 222 (3)] db [292 (12); 278 (tr); 264 (40)] mb | |
| n16 | 270; 309; 347 | 11,59 | 16.00 | n16 | [332 (5); 318 (15); 304 (15)] mb | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 11,78 | 16.14 | n16: 1 Δ 5 | [152 (2); 153 (10)] db | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 11,94 | 16.24 | n16: Δ 1 8 | [196 (5); 208 (3)] db | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 12.00 | 16.31 | n16: 1Δ 9 | [210 (3) 222 (3)] Db | |
| 16: 2 | 266; 305; 343 | 12.18 | 16,44 | n16: 2 Δ 5, Δ 9 | [152 (2); 153 (12)] db [208 (1); 220 (2)] db | |
| i17 | 284; 323; 361 | 12.25 | 16.5 | i17 | [346 (20); 332 (tr); 318 (35)] mb | |
| ramification méthyle 17: 1 | 282; 321; 359 | 12,43 | 16.64 | i17: 1Δ 5 | [152 (2); 153 (10)] db | [344 (10); 316 (5)] mb |
| a17 | 284; 323; 361 | 12,47 | 16.66 | a17 | [332 (30); 318 (0); 304 (52)] mb | |
| ramification méthyle 17: 1 | 282; 321; 359 | 12,57 | 16.74 | i17: 1Δ 8 | [196 (2); 208 (2)] db | [344 (10); 316 (5)] mb |
| ramification méthyle 17: 1 | 282; 321; 359 | 12.64 | 16,79 | i17: 1Δ 9 | [210 (3) 222 (3)] db | |
| ramification méthyle 17: 1 | 282; 321; 359 | 12.70 | 16,84 | i17: 1Δ 10 | [224 (1); 236 (1)] db | |
| ramification méthyle 17: 1 | 282; 321; 359 | 12,84 | 16,94 | a17: 1Δ 9 | [210 (3) 222 (4)] db | [330 (10); 316 (0); (90)] mb |
Tableau 1: Détermination des acides gras à partir de Bacillus cereus ATCC 14579.
Les temps de rétention des valeurs équivalentes, la longueur de chaîne (ECL) et les ions moléculaires pour les esters méthyliques d'acides gras (FAME) sont indiqués, conjointement avec des ions moléculaires et des ions de diagnostic pour DMOX et les dérivés de picolinyle.
[] Mb paire d'ions de diagnostic qui indique une perte de 28 unités de masse atomique correspondant à un fragment avant et après le branchement de carbone.
[] Db paire d'ions de diagnostic indiquant une perte de 12 amu correspondant au clivage d'une double liaison.
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Discussion
Les profils chromatographiques FAs présentés dans le tableau 1 correspondent à B. cereus ATCC 14579 cultivée sur une surface de la plaque de gélose. Des profils similaires ont été obtenus lorsque la bactérie a été cultivée dans un milieu liquide aéré à la même température 8. Dans le cas des bactéries cultivées en milieu liquide, la biomasse bactérienne est recueillie par centrifugation du milieu de croissance et peut être lavée selon des protocoles décrits précédemment en fonction des conditions de croissance de 8,19. L'identification des différentes AF produites par B. cereus a permis des changements précis dans la proportion de la FA à détecter dans des souches mutées sur certains gènes nécessaires à la croissance à basse température 7,9.
En règle générale, ECL est calculée en utilisant les valeurs de log du temps de rétention ajustée déterminée à une température fixe ( à l' aide d' un four avec contrôle de température isothermique) 20. Ici, en raison de l'utilisation d'un four non isotherme à permite une séparation optimisée du FAME d'intérêt, la méthode de calcul utilisée a été celle décrite précédemment pour les indices de rétention linéaire 3,21.
Le but de ce travail était de ne pas comparer les valeurs ECL calculées avec celles qui sont décrites dans la littérature, mais pour prédire la structure FA, dans le même profil de chromatogramme, sur la base de ces données de rétention et de l'information des spectres. En effet, pour les AF saturés, une ramification donnée (iso ou anteiso) provoque toujours le même changement dans ECL, par rapport à la chaîne droite équivalente FA. En outre, l'ECL calculée dans la présente étude , en correspondance avec les valeurs mesurées par Stránský 22 sur une colonne de polarité équivalente. Cet accord avec les valeurs précédemment rapportées indique que les valeurs ECL sont donc très utiles pour une identification rapide des pics de profils fas chromatogramme de B. cereus cultivées dans d' autres conditions, ou d'autres souches (par exemple., Mutants) de B. cereus.
les dérivés de picolinyle fournissent plus d'ions caractéristiques indiquant l'emplacement de branchement que les ions générés par des dérivés de DMOX, tandis que la position de la double liaison est plus facilement affectée avec les dérivés de DMOX. La présente étude montre l'utilité de combiner les informations des deux dérivés pour identifier le méthyle ramifié insaturé de B. cereus AF, qui jusqu'à présent ont été mal décrits dans la littérature.
jove_content "> L'approche proposée peut être complétée dans les 2 jours. A titre de comparaison, pour la spectroscopie RMN, chaque FA doit être purifié, ce qui représente plusieurs semaines de travail et une grande quantité de matériel biologique. Cependant, l'approche ne différencie pas la géométrie ( cis, trans) des doubles liaisons. Une fois que chaque FA est identifié, ils peuvent être systématiquement quantifiés par leurs dérivés FAME, par exemple, pour comparer les souches bactériennes et mutants ou pour étudier l'impact des conditions de croissance. Dans nos mains, aussi peu que 8 mg des cellules bactériennes fraîches étaient suffisantes pour la quantification des autorités fédérales, ce qui rend le procédé applicable à des bactéries difficiles à cultiver. la limite de quantification pour chacun des AC identifié est de 1 ng / pl de solution injectée dans la CG / SM.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Les auteurs sont reconnaissants à Thomas Mison pour son soutien technique, et de Rachel Kopec pour la révision du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GC/MS | Shimadzu | QP2010 | |
| capillary column ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm |
| Methanol Lichrosolv | VWR | 1.06018.2500 | |
| potassium hydroxide | Aldrich | P1767 | |
| THF | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| Dichloromethane | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| Hexane | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-pyridinemethanol | Aldrich | P6-680-7 | |
| potassium tertiobutoxide | Aldrich | 156671 | |
| 2-amino-2-methyl-1-propanol | A-9879 | ||
| MilliQ Academic | Millipore | ZMQS50001 | |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco |
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