Abstract
أنواع بكتيريا تحتوي على تشعبت سلسلة والأحماض الدهنية غير المشبعة (FAS) مع المواقف المختلفة للفرع الميثيل (ايزو أو anteiso) والرابطة المزدوجة. تغييرات في تكوين اتحاد كرة القدم تلعب دورا حاسما في التكيف من البكتيريا إلى بيئتهم. هذه التعديلات تنطوي على تغيير في نسبة ايزو مقابل anteiso تشعبت اتفاقات الصيد، ونسبة غير المشبعة اتفاقات الصيد بالنسبة إلى اتفاقات الصيد المشبعة، مع ضعف السندات التي تم إنشاؤها في مواقع محددة. تحديد دقيق للوضع الاتحاد الانجليزي ضروري لفهم آليات التكيف من أنواع بكتيريا.
العديد من اتفاقات الصيد من العصيات ليست متاحة تجاريا. الاستراتيجية المقترحة في هذه الوثيقة تحدد اتفاقات الصيد من خلال الجمع بين المعلومات على الوقت الاحتفاظ (عن طريق حساب طول سلسلة يعادل (ECL)) مع أطياف الشامل من ثلاثة أنواع من المشتقات FA: استرات الدهنية الميثيل حمض (جوع)، 4،4-ثنائي ميثيل oxazoline المشتقات (DMOX)، واستر 3-pyridylcarbinyl (picolinyl). هذه الطريقة يمكن التعرف على اتفاقات الصيد دون الحاجة إلى تنقية اتفاقات الصيد غير معروف.
وبمقارنة ملامح الكروماتوغرافي من FAME أعدت من الشمعية عصية مع خليط التجاري للمعايير تسمح لتحديد مستقيمة السلسلة المشبعة اتفاقات الصيد، وحساب من أطلق بيت التمويل الخليجي، وفرضيات على هوية اتفاقات الصيد الآخر. جوع من تشعبت المشبعة اتفاقات الصيد، ايزو أو anteiso، عرض تحول سلبي مستمر في ECL، مقارنة خطية المشبعة اتفاقات الصيد مع نفس عدد ذرات الكربون. جوع من غير المشبعة اتفاقات الصيد يمكن الكشف عن كتلة أيونات الجزيئي، ويؤدي إلى تحول إيجابي في ECL مقارنة اتفاقات الصيد المشبعة المقابلة.
موقف المتفرعة فاس وموقف الرابطة المزدوجة من غير المشبعة اتفاقات الصيد يمكن تحديدها من قبل أطياف الكتلة التأين الإلكترون من picolinyl وDMOX المشتقات، على التوالي. ويحدد هذا النهج كل فرع المشبعة غير معروفإد اتفاقات الصيد، غير المشبعة على التوالي سلسلة اتفاقات الصيد واتفاقات الصيد تشعبت غير المشبعة من B. استخراج الشمعية.
Introduction
الأحماض الدهنية استر الميثيل (FAME) اللوني للغاز (GC) هو وسيلة أساسية لتوصيف الدهون. أنه يفصل بسرعة والكمي مختلف الأحماض الدهنية (FAS) من عينة بعد خطوة استخراج قصيرة. مشتقات استرات الميثيل متقلبة جدا ومستقرة والخاملة نحو العمود الكروماتوغرافي، وبالتالي تجنب قمم المخلفات. التعرف عليهم واضح وصريح للغاية عندما تتكون عينة فاس معروفة لأن ملامح الكروماتوغرافي إما المنشورة أو مقارنة بالمعايير. وبالإضافة إلى ذلك، لا يلزم الحقن المتكررة للمعايير معايرة لتقدير مختلف اتفاقات الصيد، نظرا استجابة ثابتة تقريبا لكشف اللهب التأين (ااا) 1.
بالإضافة إلى الاستثمارات الخارجية المباشرة، ويوفر الطيف الكتلي (MS) الكشف عن مجموعة متكاملة من المعلومات لتأكيد جوع. ومع ذلك، عندما اتهم جوع باستخدام التأين الإلكترون (EI)، والأطياف الناتجة لا تسمح دائما عشرتحديد (ه) من الاتحاد الانجليزي هيكل غرامة. على سبيل المثال، المتفرعة موقف (أي مجموعة الميثيل تشعبت) من الصعب التنبؤ لأن أيونات التشخيص صعبة للكشف عن 1 والتغيير مميزة في وفرة ايون الهدف تعتمد على آلة، ومنع استخدام المكتبات أطياف الجماعية 2. تحد آخر يكمن في تحديد موقف الرابطة المزدوجة لEI يسبب هجرة السندات مزدوجة. وهكذا، أيزومرات الاتحاد الانجليزي مع اختلاف المواقف السندات مزدوجة لا يمكن تفريقها أطياف الشامل بهم. لحسن الحظ، تم تطوير أدوات أخرى لتحديد الاتحاد الانجليزي. على سبيل المثال، فإن وجود وموقف المتفرعة أو سندات مزدوجة في اتفاقات الصيد يمكن حدسيا عن طريق حساب طول سلسلة يعادل (ECL) 3.
طرق اشتقاق أخرى تؤدي إلى أطياف الإعلام المختلفة، اعتمادا على مكان وجود رابطة ثنائية أو مجموعة الميثيل متفرعة. 4،4-ثنائي ميثيل المشتقات oxazoline (DMOX) 4 تسمح لقمة شرق اسياتحديد ذ من موقف ضعف السندات غير المشبعة الاحادية الأحماض الدهنية. 3-pyridylcarbinyl استر (picolinyl استر) المشتقات تسمح لتحديد واضح للموقع الميثيل تشعبت اتفاقات الصيد 5. الجمع بين الاحتفاظ الكروماتوغرافي (ECL) والأطياف كتلة (DMOX وpicolinyl) تتيح المعلومات للتعرف على معظم اتفاقات الصيد دون الحاجة إلى استخدام وسائل معقدة للتنقية، على النحو المطلوب لالرنين المغناطيسي النووي (NMR) الطيف، وطريقة لا شك فيه لتوصيف هيكلي 1 .
البكتيريا من جنس العصيات، والتي تشمل بعض مسببات الأمراض للإنسان والحيوان، هي قادرة على استعمار منافذ متنوعة للغاية، وبالتالي توزع على نطاق واسع في البيئة 6. بين جنس العصيات، ويتأثر تكوين اتحاد كرة القدم من مكانة الايكولوجية من الأنواع مع التحويرات في أنماط الاتحاد الانجليزي للتكيف مع مجموعة واسعة من التغيرات البيئية (على سبيل المثال، متوسطة النمو، ودرجة الحرارة،درجة الحموضة، الخ) 7-9. بسبب التجانس النسبي للنمط كرة القدم عبر الأنواع في جنس العصيات أثناء النمو في ظروف موحدة، وتحديد تكوين اتحاد كرة القدم هي واحدة من المعايير الأساسية المستخدمة لتحديد أنواع بكتيريا. سمة فريدة من جنس العصيات هي وفرة فاس تشعب سلسلة تحتوي على 12-17 الكربون 10-12 مع النسبة بين ايزو وanteiso أيزومرات كونه محددا رئيسيا للتكيف مع الظروف البيئية. الأنواع عصية على التكيف أيضا لتقلبات البيئية عن طريق تغيير نسبة من الأحماض الدهنية غير المشبعة. في بعض الأنواع، مثل الشمعية عصية، واثنين من إنزيمات دياستيريز الأحماض الدهنية خلق روابط ثنائية في مواقع مختلفة من سلسلة الألكيل 13 مع أدوار مختلفة في التكيف 9. على سبيل المثال من جنس العصيات يوضح أهمية تحديد بدقة موقف الرابطة المزدوجة واتحاد كرة القدم المتفرعة. جمعively، وتحديد أنماط العصوية الاتحاد الانجليزي لديها العديد من التطبيقات المفيدة. هنا، نقترح نهجا GC-MS رواية لتحديد نمط عصيات كرة القدم أن يتغلب على القيود المتأصلة في تحليل GC-MS الكلاسيكية.
هذا النهج المبتكر يمكن استخدامها مباشرة على المواد البيولوجية الخام، ويتكون من مزيج من التقنيات الموجودة: معلومات عن الاحتفاظ مرات (ECL) والأطياف الشامل لمختلف المشتقات اتفاقات الصيد (FAME، DMOX وpicolinyl استر).
نحن نستخدم التسمية الاتحاد الانجليزي التالية. ط، لذلك، ون تشير ايزو، تشعبت anteiso الميثيل، ومباشرة سلسلة الأحماض الدهنية، على التوالي. سميت اتفاقات الصيد غير المشبعة التي كتبها C: d حيث C هو عدد ذرات الكربون في الأحماض الدهنية ود هو عدد الروابط الثنائية. Δ س يشير إلى موقف الرابطة المزدوجة، حيث يقع الرابطة المزدوجة على السندات بين الكربون xth، عد من نهاية الحمضية الكربوكسيلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الثقافات البكتيرية
- إعداد العشب من البكتيريا (العصوية الشمعية سلالة ATCC 14579) من خلال نشر 100 ميكرولتر من ثقافة بين عشية وضحاها من سلالة المحتضنة في 30 درجة مئوية في LB (لوريا، Bertani المتوسطة)، على سطح لوحة من LB أجار المتوسطة. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
2. أطلق بيت التمويل الخليجي: سلسلة تعادل طول
- حساب أطلق بيت التمويل الخليجي على النحو التالي:
مع:
ط، المذاب في المصالح؛
ن، وعدد من الكربون استر الميثيل سلسلة الأحماض الدهنية المشبعة على التوالي يبلغ حجمه قبل المذاب الأول؛
ن + 1، وعدد من الكربون استر سلسلة المشبعة الأحماض الدهنية الميثيل على التوالي يبلغ حجمه بعد المذاب الأول؛
RTI، RTN، الرايت (ن + 1) مرات الإبقاء على قمم FAME المذكورة أعلاه.
ملاحظة: للحصول على الاحتفاظ مرات من استرات سلسلة الأحماض الدهنية المشبعة الميثيل على التوالي عن طريق الحقن من خليط من المعايير (Bآمي).
مع: 3. إعداد وتحليل FAME
- من أجل الحصول على الأحماض الدهنية الدهون والخلايا البكتيرية الحصاد عن طريق كشط المستعمرات من لوحة أجار ونقل 40 ملغ (الوزن الطازج، أي ما يعادل 10 9 خلايا قابلة للحياة) من البكتيريا في أنبوب زجاجي 10 مل مع قبعات المسمار والأختام PTFE.
- أداء أسترة عبر استر طريقة ارتباط 14،15 المفصلة أدناه.
- إضافة 5 مل من 0.2 M KOH في الميثانول إلى الخلايا البكتيرية الطازجة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. يتكون هذا رد فعل من تحلل الميثانول القلوية، وقطع الصلة استر في الدهون وإنتاج استرات الميثيل الأحماض الدهنية.
- إضافة 1 مل من 1 M حمض الخليك لخفض درجة الحموضة إلى 7.0. تحقق من درجة الحموضة مع شرائط اختبار درجة الحموضة.
- إضافة 3 مل من الهكسان لاستخراج جوع.
- نقل طاف (المرحلة العضوية) في أنابيب نظيفة والتركيز عن طريق التبخر في درجة حرارة الغرفة تحت تدفق مستمر من النيتروجين للحصول على ما يقرب من 200 ميكرولتراستخراج. نقل العينة إلى قارورة GC مع إدراج.
- حقن مقتطفات في الطيف اللوني الشامل الغاز (GC-MS) النظام.
4. GC / MS شروط
- حقن عينات FAME إلى أداة GC-MS مجهزة العمود الشعري ZB-شمع (طول، 30 متر، وقطره 0.25 مم؛ سماكة الفيلم، 0.25 ميكرون).
- تعيين منفذ حقن (في الوضع splitless) درجة الحرارة إلى 250 درجة مئوية. استخدام الهيليوم بوصفها الناقل للغاز، مع سرعة خطية من 37 سم / ثانية. عقد درجة حرارة الفرن عند 50 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، يرتفع إلى 190 درجة مئوية في معدل 20 درجة مئوية / دقيقة، ويرتفع على درجة حرارة النهائية من 230 درجة مئوية بمعدل 2 درجة مئوية / دقيقة.
- لMS، تسجيل أطياف الشامل التي كتبها التأين الإلكترون (EI) في 70 فولت، وتعيين الاستحواذ من إجمالي أيون الحالية بين 50 و 400 وحدة ذرية كتلة (اتحاد المغرب العربي) (2 بالاشعة / ثانية).
- عند الاقتضاء، وضخ DMOX وpicolinyl مشتقات تحت نفس حالة excepر الفرن برنامج درجات الحرارة على النحو التالي:
DMOX: 50 ° C (1 دقيقة)، 20 ° C / دقيقة حتى 210 درجة مئوية و 2 درجة مئوية / دقيقة حتى 240 درجة مئوية (5 دقائق).
Picolinyl: 6 ° C (1 دقيقة)، 20 ° C / دقيقة حتى 220 درجة مئوية و 2 درجة مئوية / دقيقة حتى 250 درجة مئوية (20 دقيقة).
5. إعداد استر Picolinyl من FAME 16
- تتبخر استخراج شهرة من القسم 3 مع تدفق النيتروجين (لا يقل عن 10 ملغ المادة الجافة) وتذوب في 1 مل من ثنائي كلورو ميثان الجاف.
- إعداد محلول 1.0 M من البوتاسيوم ثالثا تي باتوكسايد في رباعي هيدرو الفوران.
- إضافة استخراج FAME و 0.2 مل 3-pyridinemethanol إلى 0.1 مل من محلول في الخطوة 5.2.
- الحرارة الحل عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في قنينة مغلقة.
- بعد التبريد لدرجة حرارة الغرفة، وإضافة الماء منزوع الأيونات النقي (2 مل، انظر المواد الجدول) والهكسان (4 مل). خلط مع دوامة، والسماح مرحلة لفصل، وجمع المرحلة العضوية.
- الدكتورذ بإضافة كبريتات الصوديوم اللامائية حتى المرحلة العضوية واضح تماما. نقله في أنبوب نظيفة. ثم تتبخر إلى 200 ميكرولتر. نقل العينة إلى قارورة GC مع إدراج.
6. إعداد DMOX من FAME 17
- تتبخر استخراج شهرة من القسم 3 مع تدفق النيتروجين (لا يقل عن 10 ملغ المادة الجافة).
- لاستخراج الجافة FAME، إضافة 250 ملغ من 2-أمينو-2-ميثيل-1-بروبانول. مطاردة السفينة مع النيتروجين، إضافة سدادة، ووضعه في كتلة التدفئة بين عشية وضحاها في 190 درجة مئوية.
- بعد التبريد لدرجة حرارة الغرفة، إضافة 3 مل ثنائي كلورو ميثان إلى أنبوب، و 5 مل تنقية الماء منزوع الأيونات (انظر الجدول المواد).
- يهز لفصل المرحلة ومن ثم إزالة المرحلة المائية.
- تغسل المرحلة العضوية مع 5 مل من الماء. يهز لفصل المرحلة ومن ثم إزالة المرحلة المائية.
- الجاف بإضافة كبريتات الصوديوم اللامائية حتى المرحلة العضوية من الواضح تماما ونقله في أنبوب نظيفة. تتبخر تحت تيار من النيتروجين حتى يصل إلى حجم 200 ميكرولتر. نقل العينة إلى قارورة GC مع إدراج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقدمت استراتيجية لتحديد الهوية كرة القدم من الخلايا البكتيرية في الشكل 1. توفر كل خطوة من المعلومات الطيفية تكميلية أو معلومات حول الاحتفاظ الكروماتوغرافي. الخطوة 1 تتكون من تحديد الاتحاد الانجليزي الأولي باستخدام محلول قياسي. الخطوة 2 تسمح لتفسير FAME EI الأطياف وأطلق بيت التمويل الخليجي، ومن أجل تحديد مبدئيا المنتجات. الخطوة 3 تحدد موقع المتفرعة بالضبط في تشعبت سلسلة اتفاقات الصيد. وأخيرا، الخطوة 4 يحدد بدقة موضع الرابطة المزدوجة غير المشبعة اتفاقات الصيد.
FAME وأطلق بيت التمويل الخليجي
السماح للخليط BAME لنا لتحديد سلسلة من مستقيم سلسلة الأحماض الدهنية المشبعة (N12 في N17) وتشعبت بعض الميثيل الأحماض الدهنية (I15، A15، I16، I17). ومع ذلك، تم الكشف عن عدد قليل جدا من اتفاقات الصيد الخاصة ب الشمعية في عينة لدينا، لتبرير develoوصف pment من طريقة التعريف أدناه.
اتفاقات الصيد بغض النظر عن طول السلسلة، تشعبت المشبعة (ايزو أو anteiso) من سلسلة متماثلة (أي سلسلة من المركبات بنفس الصيغة العامة) عرض تحولا مستمرا في ECL مقارنة المشبعة الاتحاد الانجليزي على التوالي وجود نفس العدد من الكربون في حياتهم الكربون سلسلة. هذا التحول، ودعا طول سلسلة كسور (FCL)، ويسمح لتحديد فاس في السلاسل المتجانسة. على سبيل المثال، ايزو اتفاقات الصيد (الرمز مع البادئة "أنا") لها قيمة خط الائتمان المرن من -0.48 في حين anteiso اتفاقات الصيد (الرمز مع البادئة "أ") لديها خط الائتمان المرن من -0.33. ومن ثم من السهل التعرف على i14 وI13 مع ECL من 13.52 و 12.52 على التوالي، وA13 و A15 مع ECL من 12.67 و 14.66 على التوالي.
الجدول 1 يعرض ECLs لكل من اتفاقات الصيد اكتشفت في عينة لدينا. وتتوقع الاحتفاظ مراتيسمح إد لايزو وanteiso سلسلة، جنبا إلى جنب مع مرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف التي تم الحصول عليها مع جوع، لنا للتعرف على كل من تشعب سلسلة-FA من العينة. كان هذا التحديد في هذه الخطوة مؤقت، ولكن أكد في وقت لاحق من قبل المنظمة الدولية للتعليم الأطياف تم الحصول عليها من picolinyl المشتقات اتفاقات الصيد.
وغير المشبعة جوع مع ECLs لا تتوافق مع ايزو أو anteiso التحولات، سلسلة مستقيمة أو متفرعة اتفاقات الصيد، كما هو مبين من قبل كتلة أيون الجزيئي. وتشير اتفاقات الصيد غير المشبعة تحولا إيجابيا في ECL بالمقارنة مع اتحاد كرة القدم المشبعة المقابلة. أطياف من المشتقات DMOX، جنبا إلى جنب مع أطياف من مشتقات picolinyl لاتفاقات الصيد تشعبت، والسماح لتحديد موقف الرابطة المزدوجة.
هذه الأساليب اشتقاق مناسبة لتحديد اتحاد كرة القدم فقط عندما يتم الاحتفاظ أجل شطف، كما هو مبين في خليط مشتقة ثلاثة (أي شهرة، DMOX وpicolinyl) في الشكل2 لعدة 16: 1 اتفاقات الصيد. يسمح هذا النهج جمع المعلومات الطيفية التكميلية لقمة واحدة باستخدام 3 طرق اشتقاق التي يمكن دمجها لتحديد هيكل الاتحاد الانجليزي. لم يلاحظ أي اختلاف في ترتيب شطف بين 3 المشتقات، على الرغم من أن الاحتفاظ مرات ودرجات حرارة الفرن كانت مختلفة.
استرات Picolinyl ايزو وanteiso الأحماض الدهنية الميثيل تشعب سلسلة المشبعة
الأطياف التي حصلت عليها EI تؤكد وجود الميثيل اتفاقات الصيد تشعب سلسلة. وبالفعل، فإن الأيونات الجزيئية لديها م / ض الموافق اتفاقات الصيد المشبعة. لاحظنا سلسلة أيون مع وجود فجوة من 14 وحدة الإعلام (اتحاد المغرب العربي) المقابلة لفقدان مجموعة الميثيلين إلا في المنطقة من وجهة الفرع الذي ايون المقابلة لذرة الكربون التي تم استبدالها في عداد المفقودين. ثم أننا نلاحظ وجود فجوة من 28 اتحاد المغرب العربي بين الأيونات المقابلة لشظايا إنشاؤها قبل وبعد الكربون متفرعة. ويبين الشكل 3 الطيف من I16 مع أيونات التشخيص (304 و 332) توضح موقع المتفرعة.
DMOX المستقيمة سلسلة الأحماض الدهنية غير المشبعة
ويبين الشكل 2 خمس قمم مختلفة تترافق مع 16: الأحماض الدهنية 1. قمم الأولين والقيم ECL <16. نخلص إلى أن هيكلها وتشعبت بالتأكيد. تحديد هذه المركبات يتطلب تفسير أطياف الجماعية التي تنتجها DMOX ومشتقاتها picolinyl استر. ثلاث قمم حيازة أطلق بيت التمويل الخليجي> 16 مباراة الأحادية غير المشبعة والأحماض الدهنية مباشرة سلسلة. تظهر DMOX أطياف جماعية مشتقة أيونات التشخيص تحديد موقف الرابطة المزدوجة من هذه المركبات. في الشكل (4) يمكننا أن نرى فجوة من 12 أيون اتحاد المغرب العربي بين 196 و 208 تشير إلى وجود الرابطة المزدوجة مع الكربون 8 من N16: 1 Δ
DMOX وكتلة picolinyl أطياف الميثيل تشعب سلسلة الأحماض الدهنية monounsatured
ويبين الشكل 6 أطياف DMOX ومشتقاتها picolinyl استر، وتستخدم لتحديد بنية I16: 1 Δ 9 الاتحاد الانجليزي. موقفيشار المتفرعة من وجود فجوة من 28 اتحاد المغرب العربي لكل من المشتقات. هناك فجوة من 12 اتحاد المغرب العربي لDMOX و 26 لاستر picolinyl تحدد موقف الرابطة المزدوجة، كما هو مبين في الشكل (6).
التعرف على الأحماض الدهنية وأيونات التشخيص
ويبين الجدول 1 مختلف الأحماض الدهنية التي تم تحديدها، مع أيونات التشخيص المقابلة، في العصوية الشمعية آي تي سي سي 14579 نمت عند 30 درجة مئوية. هذه الأيونات التشخيص التعرف على مواقف المتفرعة الميثيل وروابط مزدوجة في سلسلة الكربون لDMOX وpicolinyl المشتقات استر، والتي توفر المعلومات الهيكلية المكملة. النهجين متكاملان حقا، كما أيونات التشخيص أسهل في بعض الأحيان لمراقبة مع المشتقات DMOX، وتارة أخرى الأسهل للمراقبة مع المشتقات picolinyl.
SRC = "/ ملفات / ftp_upload / 54960 / 54960fig1.jpg" />
الشكل 1: استراتيجية لتحديد الأحماض الدهنية في الشمعية عصية.
وتظهر الخطوات المتعاقبة توليد المعلومات على الاحتفاظ مرات (ECL)، على أطياف الشامل للمشاهير، من DMOX، وpicolinyl استر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مقارنة لمحات الكروماتوغرافي لمختلف 16: الأحماض الدهنية 1 الكشف في الشمعية عصية.
(A) مشتقات FAME (أيون الجزيئية المستخرج في م / ض 268)؛ (ب) مشتقات DMOX (أيون الجزيئية المستخرج في م / ض 307)؛ (C) مشتقات picolinyl (أيون الجزيئية المستخرج في م / ض 345).ديزيل / ftp_upload / 54960 / 54960fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): picolinyl I16 الطيف الكتلي المشتقات الناتجة عن التأين الإلكترون.
الأيونات في م / ض 151 و م / ض 164 تشير إلى وجود مشتق picolinyl من الأحماض الدهنية. يتم تحديد أيون الجزيئية في م / ض 347 كما آيزومور من حمض البالمتيك. وجود فجوة من 28 اتحاد المغرب العربي بين أيون في م / ض 304 و م / ض 332 يدل على I16. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: N16: 1 Δ 8 DMOX الطيف الشامل المشتقات الناتجة عن الإلكترون التأين.
أيون في م / ض 126 يشير إلى وجود مشتقات DMOX، م / ض 307 هو أيون الجزيئية من 16: 1 DMOX وجود فجوة من 12 اتحاد المغرب العربي بين الأيونات في م / ض 196 و م / ض 208 يحدد الموقع من الرابطة المزدوجة على الكربون 8. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: N16: 1 Δ 5 DMOX مشتق الطيف الكتلي الناتجة عن التأين الإلكترون.
أيون في م / ض 126 يدل على مشتق DMOX وم / ض 307 هو أيون الجزيئية من 16: 1 DMOX. م مكثف / ض 153 أيون هو سمة من الرابطة المزدوجة تقع على الكربون 5. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
معشوقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> 
الشكل 6: DMOX (أعلى) وpicolinyl (القاع) مقارنة I16: 1Δ 9 الأطياف.
في كلتا الحالتين الفجوة من 28 اتحاد المغرب العربي تدل على موقف المتفرعة الميثيل. موقع الرابطة المزدوجة يمكن أن تستمد من وجود فجوة من 12 اتحاد المغرب العربي و 26 اتحاد المغرب العربي لDMOX وpicolinyl المشتقات، على التوالي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مركبات المفترضة | أيون الجزيئية (م / ض) FAME. DMOX. picolinyl | RT | أطلق بيت التمويل الخليجي | تحديد أكد | أيونات التشخيص DMOX | أيونات التشخيص picolinyl |
| I12 | 214، 253، 291 | 7.93 | لم يشر | I12 | [276 (15)، 262 (0)؛ 248 (15)] ميغابايت | |
| N12 | 214، 253، 291 | 8.21 | 12.00 | N12 | [276 (10)، 262 (20)؛ 248 (20)] ميغابايت | |
| I13 | 228، 267، 305 | 8.53 | 12.5 | I13 | [290 (15)، 276 (0)؛ 262 (48)] ميغابايت | |
| A13 | 228، 267، 305 | 8.64 | 12.67 | A13 | [276 (48)، 262 (0)؛ 248 (65)] ميغابايت | |
| i14 | 242، 281، 319 | 9.24 | 13.52 | i14 | [304 (20)؛ 276 (45) 290 (0)] ميغابايت | |
| N14 | 242، 281، 319 | 9.60 | 14.00 | N14 | [304 (7)؛ 290 (17)؛ 276 (17)] ميغابايت | |
| I15 | 256؛ 295؛ 333 | 10.06 | 14.51 | I15 | [318 (20)، 314 (0)؛ 290 (50)] ميغابايت | |
| A15 | 256؛ 295؛ 333 | 10.19 | 14.66 | A15 | [304 (30)، 290 (TR)؛ 276 (62)] ميغابايت | |
| N15 | 256؛ 295؛ 333 | 10.49 | 15.00 | N15 | [318 (5)؛ 304 (13)؛ 290 (18)] ميغابايت | |
| I16 | 270؛ 309، 347 | 11.04 | 15.5 | I16 | [332 (18)، 318 (TR)؛ 304 (42)] ميغابايت | |
| تشعبت الميثيل 16: 1 | 268؛ 307، 345 | 11.19 | 15.64 | I16: 1Δ 5 | [152 (2)؛ 153 (10)] ديسيبل [292 (3)؛ 278 (TR)؛ 264 (2)] ميغابايت | |
| تشعبت الميثيل 16: 1 | 268؛ 307، 345 | 11.40 | 15.83 | I16: 1 Δ 9 | [210 (3)؛ 222 (3)] ديسيبل [292 (12)، 278 (TR)؛ 264 (40)] ميغابايت | |
| N16 | 270؛ 309، 347 | 11.59 | 16.00 | N16 | [332 (5)؛ 318 (15)؛ 304 (15)] ميغابايت | |
| 16: 1 | 268؛ 307، 345 | 11.78 | 16.14 | N16: 1 Δ 5 | [152 (2)؛ 153 (10)] ديسيبل | |
| 16: 1 | 268؛ 307، 345 | 11.94 | 16.24 | N16: 1 Δ 8 | [196 (5)؛ 208 (3)] ديسيبل | |
| 16: 1 | 268؛ 307، 345 | 12.00 | 16.31 | N16: 1Δ 9 | [210 (3)؛ 222 (3)] ديسيبل | |
| 16: 2 | 266؛ 305، 343 | 12.18 | 16.44 | N16: 2 Δ 5، Δ 9 | [152 (2)؛ 153 (12)] ديسيبل [208 (1)؛ 220 (2)] ديسيبل | |
| I17 | 284؛ 323؛ 361 | 12.25 | 16.5 | I17 | [346 (20)، 332 (TR)؛ 318 (35)] ميغابايت | |
| تشعبت الميثيل 17: 1 | 282، 321، 359 | 12.43 | 16.64 | I17: 1Δ 5 | [152 (2)؛ 153 (10)] ديسيبل | [344 (10)، 316 (5)] ميغابايت |
| A17 | 284؛ 323؛ 361 | 12.47 | 16.66 | A17 | [332 (30)، 318 (0)؛ 304 (52)] ميغابايت | |
| تشعبت الميثيل 17: 1 | 282، 321، 359 | 12.57 | 16.74 | I17: 1Δ 8 | [196 (2)؛ 208 (2)] ديسيبل | [344 (10)، 316 (5)] ميغابايت |
| تشعبت الميثيل 17: 1 | 282، 321، 359 | 12.64 | 16.79 | I17: 1Δ 9 | [210 (3)؛ 222 (3)] ديسيبل | |
| تشعبت الميثيل 17: 1 | 282، 321، 359 | 12.70 | 16.84 | I17: 1Δ 10 | [224 (1)؛ 236 (1)] ديسيبل | |
| تشعبت الميثيل 17: 1 | 282، 321، 359 | 12.84 | 16.94 | A17: 1Δ 9 | [210 (3)؛ 222 (4)] ديسيبل | [330 (10)، 316 (0)؛ (90)] ميغابايت |
الجدول 1: تحديد الأحماض الدهنية من العصوية الشمعية آي تي سي سي 14579.
وتظهر مرات الاحتفاظ، والقيم ما يعادل طول سلسلة (ECL)، وأيونات الجزيئية للاسترات الأحماض الدهنية الميثيل (جوع)، جنبا إلى جنب مع أيونات الجزيئية وأيونات تشخيص DMOX ومشتقاتها picolinyl.
[] ميغابايت زوج التشخيص أيون مما يدل على فقدان 28 لاتحاد المغرب العربي المقابلة للجزء قبل وبعد المتفرعة الكربون.
[] ديسيبل الزوج أيون التشخيص تشير إلى فقدان 12 لاتحاد المغرب العربي المقابلة للانشقاق من الرابطة المزدوجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لمحات اللوني اتفاقات الصيد هو مبين في الجدول رقم 1 تتوافق مع B. الشمعية آي تي سي سي 14579 نمت على سطح لوحة أجار. تم الحصول عليها ملامح مشابهة عندما كانت تزرع البكتيريا في وسائل الإعلام السائل الغازي في نفس درجة الحرارة 8. في حالة البكتيريا نما في وسائل الإعلام السائلة، يتم جمع الكتلة الحيوية البكتيرية بواسطة الطرد المركزي من متوسط النمو ويمكن غسلها وفقا لبروتوكولات الموصوفة سابقا اعتمادا على 8،19 ظروف النمو. التعرف على مختلف اتفاقات الصيد التي تنتجها B. الشمعية يسمح التغييرات الدقيقة في نسبة من اتفاقات الصيد ليتم الكشف في سلالات تحور في بعض الجينات الضرورية للنمو في انخفاض 7،9 درجات الحرارة.
عادة، يتم احتساب ECL باستخدام قيم السجل من الوقت الاحتفاظ المعدل تحدد عند درجة حرارة ثابتة (باستخدام فرن مع التحكم في درجة الحرارة متساوي الحرارة) 20. هنا، بسبب استخدام فرن غير متساوي إلى p ermit على فصل الأمثل للشهرة من الفائدة، والتي وصفت سابقا لمؤشرات الاحتفاظ الخطية 3،21 طريقة الحساب المستخدمة.
وكان الهدف من هذا العمل ليس لمقارنة القيم ECL محسوبة مع تلك التي وصفها في المؤلفات، ولكن للتنبؤ بنية اتحاد كرة القدم، ضمن نفس الملف الشخصي اللوني، وبناء على هذه الاحتفاظ بالبيانات والمعلومات الأطياف. في الواقع، لاتفاقات الصيد المشبعة، معطى المتفرعة (ايزو أو anteiso) يسبب دائما نفس التحول في أطلق بيت التمويل الخليجي، بالمقارنة مع ما يعادلها على التوالي سلسلة اتحاد كرة القدم. بالإضافة إلى ذلك، أطلق بيت التمويل الخليجي المحسوبة في الدراسة تتطابق مع القيم المقاسة بواسطة Stransky 22 على عمود من الاستقطاب ما يعادلها. هذا بالتزامن مع القيم ذكرت سابقا إلى أن القيم أطلق بيت التمويل الخليجي وبالتالي مفيدة جدا لتحديد السريع للقمم من ملامح اتفاقات الصيد اللوني باء الشمعية نمت في ظروف أخرى، أو من سلالات أخرى (على سبيل المثال، المسوخ) باء الشمعية.
الطبقة = "jove_content"> المشتقات Picolinyl عرض مرات الاحتفاظ أطول لكن أقل نسبة الإشارة / الضوضاء بالمقارنة مع غيرها من المشتقات التي تم اختبارها. وتشير تقارير سابقة إلى أن شطف من هو أكثر صعوبة 4. ومن المرجح أن استخدام عمود مع انخفاض فيلم سمك، وحقيقة أن الأنواع بكتيريا يحتوي على اتفاقات الصيد مع أقل من 18 الكربون، وجعل من الممكن استخدام نفس العمود الكروماتوغرافي القطبي لتوليد عالية الجودة GC-MS الاستشرابية من 3 المشتقات.
توفر المشتقات Picolinyl المزيد من أيونات مميزة تدل على موقع المتفرعة من الأيونات الناتجة عن المشتقات DMOX، في حين تم تعيين موقف الرابطة المزدوجة بسهولة أكبر مع المشتقات DMOX. وتبين هذه الدراسة فائدة دمج المعلومات من كلا المشتقات لتحديد الميثيل تشعب سلسلة غير المشبعة اتفاقات الصيد من B. الشمعية، التي كانت حتى الآن وقد وصفت سيئة في الأدب.
jove_content "> ويمكن الانتهاء من النهج المقترح في غضون 2 أيام. وعلى سبيل المقارنة، لمطيافية الرنين المغناطيسي النووي، كل اتحاد كرة القدم يجب تنقيته، يمثلون عدة أسابيع من العمل وكمية كبيرة من المواد البيولوجية. ومع ذلك، فإن النهج لا يفرق هندسة ( رابطة الدول المستقلة، العابرة) من حدود مزدوجة. وحالما يتم تحديد كل اتحاد كرة القدم، ويمكن قياسها بشكل روتيني من قبل المشتقات شهرتهم، على سبيل المثال، لمقارنة السلالات البكتيرية والمسوخ أو لدراسة تأثير ظروف النمو. في أيدينا، واقل من 8 ملغ من الخلايا البكتيرية جديدة كانت كافية لتقدير فاس، مما يجعل طريقة ينطبق على صعوبة أن تنمو البكتيريا. الحد الكمي لكل من اتفاقات الصيد التي تم تحديدها هو 1 نانوغرام / ميكرولتر من محلول يحقن في GC / MS.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
الكتاب ممتنون لتوماس Mison لدعمه الفني، وراشيل Kopec لمراجعة المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GC/MS | Shimadzu | QP2010 | |
| capillary column ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm |
| Methanol Lichrosolv | VWR | 1.06018.2500 | |
| potassium hydroxide | Aldrich | P1767 | |
| THF | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| Dichloromethane | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| Hexane | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-pyridinemethanol | Aldrich | P6-680-7 | |
| potassium tertiobutoxide | Aldrich | 156671 | |
| 2-amino-2-methyl-1-propanol | A-9879 | ||
| MilliQ Academic | Millipore | ZMQS50001 | |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco |
References
- Christie, W. W., Han, X. Lipid Analysis 4th Edition. , Oily press. (2010).
- HÜbschmann, H. -J. Handbook of GC-MS: fundamental and application. Third edition. , Wiley-vch. (2015).
- Sasser, M. Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty Acids. MIDI Technical note. 101, 1-6 (1990).
- Spitzer, V. Structure analysis of fatty acids by gas chromatography - Low resolution electron impact mass spectrometry of their 4,4-dimethyloxazoline derivatives - A review. Prog Lipid Res. 35 (4), 387-408 (1996).
- Harvey, D. J. Advances in lipid methodology. Volume 1. Christie, W. W. , Oily press. Dundee. 19-80 (1992).
- Diomande, S. E., Nguyen-The, C., Guinebretière, M. -H., Broussolle, V., Brillard, J. Role of fatty acids in Bacillus environmental adaptation. Front Microbiol. 6, (2015).
- Brillard, J., et al. Identification of Bacillus cereus Genes Specifically Expressed during Growth at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 76 (8), 2562-2573 (2010).
- de Sarrau, B., et al. Influence of Anaerobiosis and Low Temperature on Bacillus cereus Growth, Metabolism, and Membrane Properties. Appl Environ Microbiol. 78 (6), 1715-1723 (2012).
- Diomandé, S. E., et al. Involvement of the CasK/R two-component system in optimal unsaturation of the Bacillus cereus fatty acids during low-temperature growth. Int J Food Microbiol. 213, 110-117 (2015).
- Berkeley, R. C. W., Heyndrickx, M., Logan, N., De Vos, P. Applications and Systematics of Bacillus and Relatives. Berkeley, R. C. W. , Blackwell Science Publ. 1-7 (2002).
- Kämpfer, P. Limits and Possibilities of Total Fatty Acid Analysis for Classification and Identification of Bacillus Species. System. Appl. Microbiol. 17 (1), 86-98 (1994).
- Kaneda, T. Fatty-acids of genus bacillus - example of branched-chain preference. Bacteriol Rev. 41 (2), 391-418 (1977).
- Chazarreta Cifre, L., Alemany, M., de Mendoza, D., Altabe, S. Exploring the Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids in Bacillus cereus ATCC 14579 and Functional Characterization of Novel Acyl-Lipid Desaturases. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6271-6279 (2013).
- Sasser, M., et al. Identification of Bacillus anthracis from culture using gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters. J AOAC Int. 88 (1), 178-181 (2005).
- Schutter, M. E., Dick, R. P. Comparison of fatty acid methyl ester (FAME) methods for characterizing microbial communities. Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).
- Destaillats, F., Angers, P. One-step methodology for the synthesis of FA picolinyl esters from intact lipids. J Am Oil Chem Soc. 79 (3), 253-256 (2002).
- Fay, L., Richli, U. Location of double-bonds in polyunsaturated fatty-acids by gas-chromatography mass-spectrometry after 4,4-dimethyloxazoline derivatization. J Chromatogr. 541 (1-2), 89-98 (1991).
- Zhang, J. Y., Yu, Q. T., Liu, B. N., Huang, Z. H. Chemical modification in mass spectrometry IV-2-alkenyl-4,4-dimethyloxazolines as derivatives for the double bond location of long-chain olefinic acids. Biol Mass Spect. 15 (1), 33-44 (1988).
- de Sarrau, B., et al. Unsaturated fatty acids from food and in the growth medium improve growth of Bacillus cereus under cold and anaerobic conditions. Food Microbiol. 36 (2), 113-122 (2013).
- Miwa, T. K., Mikolajczak, K. L., Earle, F. R., Wolff, I. A. Gas chromatographic characterization of fatty acids.Identification constants for mono- and dicarboxylic methyl esters. Anal Chem. 32 (13), 1739-1742 (1960).
- van Den Dool, H., Kratz, P. A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. J Chromatogr A. 11, 463-471 (1963).
- Stransky, K., Jursik, T., Vitek, A. Standard equivalent chain length values of monoenic and polyenic (methylene interrupted) fatty acids. J High Res Chromatogr. 20 (3), 143-158 (1997).
